第四章 DNA復(fù)制課件

第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制可能的三種方式第四章DNA復(fù)制由Meselson和Stahl設(shè)計(jì)證明半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)的被譽(yù)為生物學(xué)最美麗的實(shí)驗(yàn)第四章DNA復(fù)制半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)親代DNA；15N標(biāo)記在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中培養(yǎng)：第四章DNA復(fù)制15N標(biāo)記DNA移到14N標(biāo)記DNA培養(yǎng)基中第四章DNA復(fù)制氯化銫密度梯度超離心?15NDNA在14NDNA培養(yǎng)基中培養(yǎng)第1~….n代親代F1F2Fn第四章DNA復(fù)制Meselson和Stahl的證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)流程第四章DNA復(fù)制Meselson和Stahl的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第四章DNA復(fù)制Meselson與Stalh在42年以后在最初他們相遇的一顆樹(shù)下重逢時(shí)的合影第四章DNA復(fù)制半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?15NDNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。?15NDNA和14N-DNA的雜交分子中密度帶。?第二代有中密度帶及低密度帶兩個(gè)區(qū)帶，這表明它們分別為15N14N－DNA和14N-DNA。?在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱。第四章DNA復(fù)制半保留復(fù)制進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證椐?15NDNA、14NDNA雜交分子經(jīng)加熱變性，對(duì)于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心。?結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15NDNA)及低密度帶(14NDNA)。第四章DNA復(fù)制15NDNA第一代變性前后超離心15NDNA第一代：變性前變性后排除了彌散復(fù)制第四章DNA復(fù)制Taylor以蠶豆根尖細(xì)胞為材料、使用放射性同位素證明真核細(xì)胞DNA也是半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)。第四章DNA復(fù)制DNA的半保留復(fù)制兩條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。第四章DNA復(fù)制某些生物DNA復(fù)制的引物序列第四章DNA復(fù)制證明DNA復(fù)制的方向始終是5′→3′的末端終止實(shí)驗(yàn)

第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制起始區(qū)的特征由多個(gè)短的重復(fù)序列組成；能夠被多亞基的復(fù)制起始區(qū)結(jié)合蛋白識(shí)別；通常富含AT堿基對(duì)，這有利于DNA復(fù)制起動(dòng)時(shí)的解鏈，因?yàn)锳T堿基對(duì)含有的氫鍵數(shù)目低于GC堿基對(duì)。第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制起始區(qū)的特征第四章DNA復(fù)制電鏡下真核生物DNA的多個(gè)復(fù)制叉結(jié)構(gòu)第四章DNA復(fù)制復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)當(dāng)DNA復(fù)制從起始區(qū)起動(dòng)的時(shí)候，起始區(qū)的DNA雙鏈因發(fā)生解鏈而形成叉狀結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)被稱為復(fù)制叉

第四章DNA復(fù)制真核生物DNA復(fù)制子第四章DNA復(fù)制Cairns的實(shí)驗(yàn)復(fù)制開(kāi)始時(shí)，將大腸桿菌放在含低劑量的[3H]-dT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾分鐘；隨后，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含高劑量的[3H]-dT的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間；最后，收集細(xì)胞，小心地裂解以抽取其中的染色體DNA進(jìn)行放射自顯影。如果是單向復(fù)制，自顯影圖譜上銀顆粒的密度應(yīng)該是一端高、一端低；如果是雙向復(fù)制，則應(yīng)該中間是一段低密度的銀顆粒，兩側(cè)是高密度的銀顆粒。低密度銀顆粒意味著這一段DNA屬于復(fù)制起始區(qū)，高密度顆粒代表的是后來(lái)合成的。第四章DNA復(fù)制Cairns證明大腸桿菌DNA雙向復(fù)制的實(shí)驗(yàn)第四章DNA復(fù)制ReijiOkazaki的實(shí)驗(yàn)脈沖標(biāo)記——目的在于即時(shí)標(biāo)記在特定時(shí)段內(nèi)合成的DNA。和脈沖追蹤——目的則是要弄清那些被標(biāo)記上的DNA片段后來(lái)的去向。

第四章DNA復(fù)制Okazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實(shí)驗(yàn)第四章DNA復(fù)制脈沖標(biāo)記在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中加入同位素[3H]標(biāo)記的dTTP，經(jīng)30秒后，DNA剛開(kāi)始復(fù)制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開(kāi)，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來(lái)確定片段的大小，再檢測(cè)放射標(biāo)記，結(jié)果表明被3H標(biāo)記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長(zhǎng)1000~2000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大20~50倍；第四章DNA復(fù)制脈沖追蹤這個(gè)實(shí)驗(yàn)是先進(jìn)行標(biāo)記培養(yǎng)30秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測(cè)結(jié)果。先合成的（帶標(biāo)記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉淀系數(shù)為70S~120S較長(zhǎng)的片段，這意味著剛開(kāi)始合成的片段都是短片段，以后再連接成長(zhǎng)片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段（Okazakifragment）第四章DNA復(fù)制Okazaki的脈沖標(biāo)記和脈沖追蹤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析第四章DNA復(fù)制不連續(xù)復(fù)制由于這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果使得人們普遍認(rèn)為：無(wú)論是前導(dǎo)鏈還是后滯鏈都是先合成小片段，然后在連成大片段，稱為“不連續(xù)復(fù)制“（discontinuousreplication）第四章DNA復(fù)制在復(fù)制叉中不連續(xù)合成的DNA片段稱為岡崎片段，連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為前導(dǎo)鏈，不連續(xù)合成的DNA子鏈被稱為后隨鏈或滯后鏈。1978年Olivera提出了半不連續(xù)（semidiscontinuous）復(fù)制模型，也就是說(shuō)前導(dǎo)鏈上的合成是連續(xù)的，只有后滯鏈上的合成才是半連續(xù)的。第四章DNA復(fù)制由于細(xì)胞內(nèi)都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ卻并不能區(qū)分它們，因此也會(huì)將dUTP加入到DNA中，形成A·U對(duì)。那么在DNA中為什么沒(méi)有U的存在呢？這是因?yàn)镋.coli細(xì)胞里有雙重“保險(xiǎn)”，防止了U的“混入”。

第一道關(guān)是細(xì)胞里的dUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。但總還有些漏網(wǎng)之“魚(yú)”，它們還是逃過(guò)此關(guān)，混入DNA中，這就靠第二道關(guān)來(lái)清除“異己”，這道關(guān)的主角是尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無(wú)Pu和Py位點(diǎn)（apurinicorapyrimidinic，AP），再由AP內(nèi)切酶在AP位點(diǎn)切出一個(gè)缺口，進(jìn)一步進(jìn)行切除修復(fù)。在細(xì)胞內(nèi)尿嘧啶N-糖苷酶作用較快，而AP酶作用較慢，在新鏈合成之初約1200bp就有可能摻進(jìn)一個(gè)U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切斷糖苷鍵，在AP酶未作用前在脈沖標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中就提取了，用NaOH沉淀時(shí)，AP位點(diǎn)十分易斷裂，所以前導(dǎo)鏈也成了小片段。第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制ＤＮＡ復(fù)制的速度和方向第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制過(guò)程的三個(gè)階段?DNA復(fù)制的起始階段，包括起始點(diǎn)，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成。?DNA鏈的延長(zhǎng)，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補(bǔ)空缺及連接崗崎片段。?DNA復(fù)制的終止階段。第四章DNA復(fù)制（一）DNA復(fù)制的起始階段?復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開(kāi)始的，復(fù)制起始點(diǎn)(originofreplication)常用ori或o表示，稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。?在原核細(xì)胞中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制子。?在真核生物中復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始的，即有多個(gè)復(fù)制子。第四章DNA復(fù)制1、DNA復(fù)制起始點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特性?大腸桿菌Ori由422個(gè)核苷酸組成，是一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)。?有些生物復(fù)制起始點(diǎn)Ori是富含A·T的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于在DNA復(fù)制起始過(guò)程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識(shí)別和結(jié)合都是必須的。第四章DNA復(fù)制2、DNA復(fù)制的方向性?定點(diǎn)開(kāi)始雙向復(fù)制：?定點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制：?兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制：ori第四章DNA復(fù)制3、DNA復(fù)制的起始?DNA雙螺旋的解旋由多種酶來(lái)完成的?DNA解鏈酶：水解ATP獲能解開(kāi)雙鏈DNA?單鏈結(jié)合蛋白（SSB蛋白）：保持單鏈結(jié)構(gòu)?RNA聚合酶：合成RNA引物?對(duì)于隨從鏈?zhǔn)怯梢l(fā)體來(lái)完成的，引發(fā)體由6種蛋白組成：n、n/、n//

、DnaB、C、I第四章DNA復(fù)制（二）DNA鏈的延長(zhǎng)?DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將四種dNTP聚合成DNA的過(guò)程。?需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與。第四章DNA復(fù)制1、DNA聚合酶?1957年，Arthurkornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ簡(jiǎn)寫(xiě)DNApolⅠ，后來(lái)又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。?大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過(guò)程靠DNApolⅢ起作用，而DNApolⅠ和DNApolⅡ在DNA錯(cuò)配的校正和修復(fù)中起作用。第四章DNA復(fù)制真核生物DNA聚合酶

?真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。復(fù)制中起主要作用的是DNApolα。?β與DNA修復(fù)有關(guān)。?γ在線粒體DNA的復(fù)制中起作用。?δ前導(dǎo)鏈合成靠δ催化，還需要調(diào)節(jié)因子參與。?隨從鏈的合成靠α和引發(fā)酶配合作用完成。第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶的性質(zhì)?需要DNA模板?需要RNA做為引物?催化dNTP加到引物的3′-OH末端?DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們?cè)贒NA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程的不同階段發(fā)揮作用。第四章DNA復(fù)制2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶?拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶，松馳超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)合成。?拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，原核、真核中均有。第四章DNA復(fù)制（三）DNA復(fù)制的終止階段

?大腸桿菌DNA具有復(fù)制終止位點(diǎn)，此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus，通過(guò)阻止解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制。第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制“滾環(huán)復(fù)制”某些噬菌體（如M13和ФX174）DNA和一些小的質(zhì)粒（如枯草桿菌內(nèi)的pIM13質(zhì)粒）在宿主細(xì)胞內(nèi)通過(guò)滾環(huán)復(fù)制方式擴(kuò)增DNA。真核細(xì)胞的某些基因，如某些兩棲動(dòng)物卵母細(xì)胞內(nèi)的rRNA基因和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的二氫葉酸還原酶基因，在特定的情況下會(huì)通過(guò)滾環(huán)復(fù)制在較短的時(shí)間內(nèi)迅速增加目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。第四章DNA復(fù)制滾環(huán)復(fù)制

第四章DNA復(fù)制D-環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體DNA通常以D-環(huán)的方式進(jìn)行復(fù)制。少數(shù)病毒，如腺病毒，也進(jìn)行D-環(huán)復(fù)制。催化線粒體DNA復(fù)制的酶是DNA聚合酶γ，兩條鏈的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成岡崎片段，因此都是連續(xù)合成。兩條子鏈的合成在時(shí)間上的不同步。第四章DNA復(fù)制D環(huán)復(fù)制

第四章DNA復(fù)制干細(xì)胞分裂過(guò)程中的“不朽鏈假說(shuō)”干細(xì)胞的分裂是不對(duì)稱的，而分裂的不對(duì)稱性使以后的干細(xì)胞能夠選擇性得到含有最老的DNA模板的染色體。這樣的假設(shè)是合乎邏輯的，因?yàn)槿绻粋€(gè)干細(xì)胞在分裂中抓住最老的DNA，就等于將復(fù)制可能產(chǎn)生的錯(cuò)誤“拒之門(mén)外”，從而大大降低了細(xì)胞癌變的可能性，而將來(lái)分化成體細(xì)胞的子細(xì)胞得到易錯(cuò)的新DNA也沒(méi)有什么危險(xiǎn)，因?yàn)樗鼈兒芸焱Ｖ狗至鸦蛘咚劳?，特別是在高度更新的組織。第四章DNA復(fù)制“不朽鏈假說(shuō)”圖解

第四章DNA復(fù)制原核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)第四章DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)雜；需要多種酶和蛋白質(zhì)參與（包括拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及連接酶等）。原核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)第四章DNA復(fù)制1.DNA復(fù)制的起始復(fù)制起始原點(diǎn)DNA雙螺旋的解旋復(fù)制的引發(fā)

第四章DNA復(fù)制大腸桿菌(E.coli)的OriC

復(fù)制原點(diǎn)大腸桿菌基因組的復(fù)制原點(diǎn)位于天冬酰胺合酶和ATP合酶操縱子之間，全長(zhǎng)245bp,稱為oriC。第四章DNA復(fù)制參與DNA復(fù)制起始和引發(fā)的蛋白質(zhì)DNA解旋酶(DNAhelicase)

催化DNA雙鏈的解鏈過(guò)程。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein)：以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，只保持單鏈的存在，并不能起解鏈作用。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

消除DNA雙鏈的超螺旋堆積。引物酶(primase)

合成一小段RNA引物，為DNA新鏈的合成提供3’-OH末端。第四章DNA復(fù)制1.1解旋酶（helicase)DNA復(fù)制時(shí)，解旋酶利用ATP的能量啟動(dòng)DNA解旋，使雙連分開(kāi)形成單鏈。

1.DNA雙螺旋的解旋第四章DNA復(fù)制在Ecoli中，解旋酶DnaB作為引發(fā)體的成員，參與復(fù)制叉形成，并結(jié)合于一個(gè)復(fù)制叉，利用ATP水解的能量解開(kāi)雙螺旋，推動(dòng)復(fù)制叉向前延伸;

大部分DNA解鏈酶可沿后隨鏈的5’-3‘方向隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，Rep蛋白則沿前導(dǎo)鏈模板的3’-5‘方向移動(dòng)。生物體內(nèi)的解旋酶有多種，有些解旋酶還參與DNA修復(fù)，重組等非復(fù)制過(guò)程。第四章DNA復(fù)制1.2拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase)可以使DNA的兩種拓?fù)洚悩?gòu)體互變的酶。DNA分子在細(xì)胞內(nèi)以超螺旋形式存在，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶催化同一DNA分子不同超螺旋狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變。第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制ActionoftopoisomeraseatthereplicationforkTopoisomeraserapidlyremovethepositivesupercoilsaccumulateinfrontofthereplicationfork.第四章DNA復(fù)制功能：與DNA形成共價(jià)結(jié)合中間體，使DNA磷酸二酯鍵斷裂，形成DNAnick，DNA的一條鏈進(jìn)行解旋旋轉(zhuǎn)而改變DNA分子的拓?fù)錉顟B(tài)。v參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組。第四章DNA復(fù)制效應(yīng)：拓?fù)洚悩?gòu)酶可使DNA發(fā)生：連環(huán)化（catenate)脫連環(huán)化(decatenate)打結(jié)（knot)解結(jié)（unknot)第四章DNA復(fù)制拓?fù)洚悩?gòu)酶類(lèi)別拓?fù)洚悩?gòu)酶IDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I對(duì)單鏈DNA的親和力要比雙鏈高得多，這正是它識(shí)別負(fù)超螺旋DNA的分子基礎(chǔ)，因?yàn)樨?fù)超螺旋DNA常常會(huì)有一定程度的單鏈區(qū)。負(fù)超螺旋越高，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I作用越快生物體內(nèi)負(fù)超螺旋穩(wěn)定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物體通過(guò)拓?fù)洚悩?gòu)酶1和II的相反作用而使負(fù)超螺旋達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，編碼E．coli拓?fù)洚悩?gòu)酶I的基因topA發(fā)生突變，則會(huì)引起旋轉(zhuǎn)酶基因的代償性突變；否則，負(fù)超螺旋增高，細(xì)胞生活能力降低。

拓?fù)洚悩?gòu)酶IIII類(lèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶沒(méi)有堿基序列特異性，它們可以和任何相交的兩對(duì)雙鏈DNA結(jié)合。通過(guò)切斷DNA的一條或兩條鏈中的磷酸二酯鍵，然后重新纏繞和封口來(lái)更正DNA連環(huán)數(shù)的酶。第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制解旋酶沿著復(fù)制叉向前延伸產(chǎn)生了一段單鏈，細(xì)胞內(nèi)大量的單鏈結(jié)合蛋白能和單鏈DNA結(jié)合，防止其重新配對(duì)形成雙鏈。1.3單鏈結(jié)合蛋白（SSB）第四章DNA復(fù)制SSB的作用：v使DNA單鏈保持一種伸展構(gòu)象，它們與磷酸骨架結(jié)合，離開(kāi)暴露的堿基，此次那些堿基能作為DNA合成的模板；v使解開(kāi)的單鏈不形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)；v保護(hù)DNA單鏈不受Dnase水解。第四章DNA復(fù)制2DNA復(fù)制的引發(fā)oriC(84min)（dnaA結(jié)合位點(diǎn)）第四章DNA復(fù)制此序列在所有細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)中都是保守的。第四章DNA復(fù)制oriC在不同原核生物中有同源性，很多細(xì)菌的oriC區(qū)在結(jié)構(gòu)上相似的，在序列上有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?，而且在分?lèi)上越接近的細(xì)菌其同源性越高，表明DNA復(fù)制起點(diǎn)的重要性。第四章DNA復(fù)制第四章DNA復(fù)制將DNA分子的復(fù)制起始位點(diǎn)（復(fù)制器）連接到任何一個(gè)DNA分子上，都能起始其復(fù)制。第四章DNA復(fù)制起始蛋白與ＤＮＡ特異序列結(jié)合、促進(jìn)解旋和引發(fā)體組裝第四章DNA復(fù)制引發(fā)體是由很多蛋白質(zhì)因子參與形成的。第四章DNA復(fù)制引發(fā)體primosome引發(fā)前體preprimosome引發(fā)酶Primase(DnaG)DnaBhelicaseDnaChelicaseassistantDnaInn’n’’只有當(dāng)引發(fā)前體把這6種蛋白質(zhì)合在一起并與引發(fā)酶進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。第四章DNA復(fù)制4.3.4引發(fā)酶（Primase，或引物酶)DNA合成時(shí)需要一段大約6-10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA，作為DNA合成的引物；這段引物是由引物酶合成的。是在特定環(huán)境下發(fā)揮作用的RNA聚合酶，僅用于合成DNA復(fù)制所需的一小段RNA。引物酶以單鏈DNA為模板，利用核糖核苷酸直接從頭合成RNA引物（6-10nt)。第四章DNA復(fù)制

減少致死突變。

DNA合成中最初幾個(gè)核苷酸正確性遠(yuǎn)比其后的低。引物RNA隨后被降解，從而減少了復(fù)制錯(cuò)誤。引物的意義：第四章DNA復(fù)制引物酶催化引物RNA的合成，但它不同于RNA聚合酶。引物酶只在復(fù)制起點(diǎn)處合成RNA引物以引發(fā)DNA復(fù)制，而RNA聚合酶則是啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄合成RNA，從而將遺傳信息由DNA傳遞到RNA。E.coli的引物酶由一條肽鏈組成，分子量為60KD,DnaG基因編碼。第四章DNA復(fù)制①

DnaAproteinmoleculesbindstothefour9bprepeatsintheorigin，thenrecognizesandsuccessivelydenaturestheDNAintheregionofthethree13bprepeats,whicharerichinA=Tpairs

ThisprocessrequiresATPandthebacterialhistonelikeproteinHU.

HUpreventsnonspecificinitiationatsitesotherthanoriCTheDnaAproteinthenmediatestheseparationofthestrandsoftheDNAduplexbyactingonthreeAT-richtandemrepeatslocatedatthe5'-endofthesequencedefiningoriCFormationofthis45-bp“opencomplex”byDnaAproteinisATP-dependent.①②第四章DNA復(fù)制②

DnaBprotein(ahexamerof50-kDsubunits)bindstothe“open”oriC.

DnaBproteinisdeliveredtooriC

byDnaCproteinassistedbyDnaTprotein.

TheadditionofDnaBproteincompletesassemblyofthepre-primingcomplex（引發(fā)前體）.

ATPhydrolysisdrivestheformationofthiscomplex.

DnaBproteinhashelicaseactivityanditfurtherunwindstheDNAinthepre-primingcomplexinbothdirections．③SSBtetramerscoatsingle

strandedregionsastheyarise.②③第四章DNA復(fù)制④

引物酶（ＤｎａＧ）結(jié)合到引發(fā)前體上組裝成了引發(fā)體（primosome）。⑤在SSB和拓?fù)洚悩?gòu)酶的參與下，引發(fā)體可在單鏈ＤＮＡ上移動(dòng)，在ＤｎａＢ的幫助下，識(shí)別復(fù)制的起始起點(diǎn)位置。④⑤第四章DNA復(fù)制⑥引發(fā)體在復(fù)制叉先合成先導(dǎo)鏈的RNA引物，再合成后滯鏈的引物．（PrimaseassociationwithDnaBistransient;onceaprimerhasbeensynthesized,primasedissociatesuntilanotherroundofprimersynthesisisnecessary.)⑦在復(fù)制叉DNApolymeraseIII組裝成非對(duì)稱的二聚體，它催化第一個(gè)ｄＮＴＰ按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則加在ＲＮＡ引物的３‘－ＯＨ端，而進(jìn)入ＤＮＡ鏈的延伸階段.⑥⑥第四章DNA復(fù)制DNA鏈的延伸需要的蛋白質(zhì):DNA聚合酶滑動(dòng)夾（SlidingDNAclamp）RNA酶(RNaseH等)

在復(fù)制完成后切除RNA引物。DNA連接酶(DNAligase)

通過(guò)生成3’5’-磷酸二酯鍵連接兩條DNA鏈。2.DNA鏈的延伸第四章DNA復(fù)制DNApolymeraseuseasingleactivesite

to

catalyzeDNAsynthesisDNApolymeraseboundtoaprimer:templatejunctionpalm第四章DNA復(fù)制Processivity(持續(xù)合成能力)Processivityisacharacteristicofenzymesthatoperateonpolymericsubstrates.ForDNApolymerase,thedegreeofprocessivityisdefinedastheaveragenumberofnucleotidesaddedeachtimetheenzymebindsaprimer:templatejunction(afew~50,000).

第四章DNA復(fù)制StructureofaslidingDNAclampSlidingDNAclampsencirclethenewlyreplicatedDNAproducedbyanassociatedDNApolymerase.第四章DNA復(fù)制SlidingclampsdramaticallyincreaseDNApolymeraseprocessivity(持續(xù)合成能力)第四章DNA復(fù)制Thecompositionofthe

DNAPolIIIholoenzymeThreeenzymes:TwocopiesoftheDNAPolIIIcoreenzymeOnecopyoftheγ-complex第四章DNA復(fù)制The“trombone”modelforcoordinatingreplicationbytwoDNApolymeraseattheE.colireplicationfork第四章DNA復(fù)制岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制岡崎片段(Okazakifragment)一般長(zhǎng)約1000-2000個(gè)堿基，原核比真核長(zhǎng)。前導(dǎo)鏈Leadingstrand后隨鏈Laggingstrand然后，RNaseH降解RNA引物，DNA聚合酶I補(bǔ)齊缺口，再由DNA連接酶連接兩個(gè)岡崎片段。第四章DNA復(fù)制Stepsinthesynthesisofthelaggingstrand第四章DNA復(fù)制RemovalofRNAprimersfromnewlysynthesizedDNARNAseHremovesalloftheRNAprimerexcepttheribonucleotidedirectlylinkedtotheDNAend.Anexonucleaseremovesthefinalribonucleotide.DNApolymerasefillsthegap,leavingaabreakinthebackbonebetweenthe3’OHand5’phosphateoftherepairedstrand.DNAligaserepairesthis“nick”.第四章DNA復(fù)制當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列(Ter)時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。

ter3.復(fù)制的終止第四章DNA復(fù)制復(fù)制的終止位點(diǎn)在E.coliDNA上存在著復(fù)制的終止位點(diǎn);終止位點(diǎn)的序列Ter(２３ｂｐ):AATTAGTATGTTGTAACTAAAGTTTAATCATACAACATTGATTTCA第四章DNA復(fù)制終止序列可被tus蛋白（tus基因編碼）識(shí)別，并結(jié)合于其上；Ter-Tus復(fù)合物能使DnaB不再將DNA解鏈，使復(fù)制叉停止前移；E.coli兩個(gè)復(fù)制叉在相距100kb時(shí)，復(fù)制速度減慢從而協(xié)調(diào)兩個(gè)復(fù)制叉到達(dá)時(shí)間。Tusprotein只讓一側(cè)復(fù)制叉通過(guò)，使DNA的復(fù)制在終點(diǎn)位置終止。第四章DNA復(fù)制復(fù)制終止的協(xié)調(diào)：在Forksmeet兩側(cè)各有幾個(gè)段序列如：terE.D.A.terC.B。當(dāng)一側(cè)復(fù)制叉前進(jìn)的快，而另一側(cè)前進(jìn)的慢時(shí)，快側(cè)復(fù)制酶則會(huì)在ter位點(diǎn)停止，等待直到慢側(cè)跟上。以上似乎構(gòu)成一個(gè)“replicationforktrap”第四章DNA復(fù)制E.coliDNA復(fù)制到最后，子代DNA鏈套在一起,由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II切開(kāi)雙鏈將兩個(gè)DNA分子分開(kāi)成為兩個(gè)完整地與親代DNA分子完全一樣的子代DNA分子。第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶I(codedbypolA)不是復(fù)制大腸桿菌染色體的主要聚合酶，它有3’→5’核酸外切酶活性,與DNA聚合酶的校正功能有關(guān)，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。DNAPolymeraseI它的5’→3’核酸外切酶活性也可用來(lái)除去岡崎片段5'端RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來(lái)。第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶II(codedbypolB)的活性很低，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是復(fù)制中主要的酶。生理功能主要是起修復(fù)DNA的作用。DNAPolymeraseII第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶III(codedbypolC)包含有7種不同的亞單位和9個(gè)亞基，其生物活性形式為二聚體。Coreenzyme&holoenzymeDNAPolymeraseIII

它的聚合活性較強(qiáng)，為DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。

它能在引物的3’—OH上以每分鐘約5萬(wàn)個(gè)核苷酸的速率延長(zhǎng)新生的DNA鏈，是大腸桿菌DNA復(fù)制中鏈延長(zhǎng)反應(yīng)的主導(dǎo)聚合酶。全酶第四章DNA復(fù)制DNAPolymeraseIIITheholoenzymeconsistsof:Thecoreenzyme–α,ε,θTheslidingclamp-

Theclamploadercomplex–γχδδ’ψAprocessivityswitch-τ第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶I(DNA損傷的修復(fù)）DNA聚合酶I、II、III(aproofreadingactivity)DNA聚合酶III第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶IV和V分別由dinB和umuD’2C基因編碼，主要在SOS修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮功能。DNAPolymeraseIV&V第四章DNA復(fù)制1、都以dNTP為底物。2、都需要Mg2+激活。3、聚合時(shí)必須有模板鏈和具有

3’-OH末端的引物鏈。4、鏈的延伸都方向?yàn)?'→3'。DNA聚合酶的共同點(diǎn)：第四章DNA復(fù)制6DNA連接酶（ligase)催化雙鏈DNA切口處的5'-磷酸和3'-羥基生成磷酸二酯鍵;連接反應(yīng)需要供給能量。大腸桿菌和其它細(xì)菌的DNA連接酶以NAD作為能量來(lái)源;動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來(lái)源。第四章DNA復(fù)制DNA滯后鏈上的復(fù)制是不連續(xù)的，各合成的片段需要連接酶連接，連接酶的反應(yīng)條件：v被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補(bǔ)；v兩鏈相鄰；v每次只能連接一個(gè)缺口；使一條鏈的5′-P與另一鏈的3′-OH形成磷酸二酯鍵；

缺口缺失核苷酸不連接。第四章DNA復(fù)制T4Ligase特性：v可連接DNA與DNA，也可連接RNA與RNA?？蛇B接DNA中的單鏈切口，也可連接粘性末端切口和齊末端切口。

T4Ligase可作為重組工具酶。T4連接酶T4連接酶第四章DNA復(fù)制真核生物DNA的復(fù)制第四章DNA復(fù)制真核生物DNA的復(fù)制特點(diǎn)有多處復(fù)制起始點(diǎn)；在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能再開(kāi)始；原核生物起始點(diǎn)上可連續(xù)開(kāi)始新的DNA復(fù)制。DNA復(fù)制只在S期進(jìn)行。復(fù)制子相對(duì)較小，為40-100kb。E.coli?第四章DNA復(fù)制真核生物的復(fù)制起始位點(diǎn)被稱為自主復(fù)制序列(autonomousreplicatingsequence,ARS)這個(gè)序列是染色體正常起始復(fù)制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列：（A區(qū)）-A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-第四章DNA復(fù)制起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物(originrecognitioncomplex,ORC)DNA的復(fù)制起始需要ORC的參與ORC結(jié)合于ARS，形成復(fù)制叉。ORC它是由6種蛋白質(zhì)組成的啟動(dòng)。第四章DNA復(fù)制酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)：長(zhǎng)約150bp左右， 包括數(shù)個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。酵母染色體Ⅳ的著絲粒附近為ARS1序列起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物第四章DNA復(fù)制ARS1分為A,B,C三個(gè)功能區(qū),A,B起主要作用,C起次要作用。A區(qū)為15bp,其中11個(gè)保守，稱ACS

(ARSconsensussequence)。有復(fù)制起始子的功能B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個(gè)功能區(qū)。B3是ABF1（ARS-bindingfactor1）結(jié)合區(qū)，ARS1序列特征第四章DNA復(fù)制真核生物DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/秒。因此，人類(lèi)DNA中每隔30,000-300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。第四章DNA復(fù)制已發(fā)現(xiàn)的真核生物DNA聚合酶有15種以上。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中主要有5種DNA聚合酶，分別稱為DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε。第四章DNA復(fù)制真核生物DNA聚合酶的特性比較性質(zhì)DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122-3≥1在細(xì)胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)(?)功能DNA引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA復(fù)制主要DNA復(fù)制酶DNA復(fù)制(?)3'→5'外切無(wú)無(wú)有有有5'→3'外切無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)

第四章DNA復(fù)制DNA聚合酶α主要參與引物合成。DNA聚合酶β活性水平穩(wěn)定，主要在DNA損傷的修復(fù)中起作用。高忠實(shí)性修復(fù)酶DNA聚合酶δ主要負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制。DNA聚合酶ε與后隨鏈合成有關(guān)，在DNA合成過(guò)程中核苷切除以及堿基的切除修復(fù)中起著重要的作用。DNA聚合酶

在線粒體DNA的復(fù)制中發(fā)揮作用。第四章DNA復(fù)制真核生物中還存在

、

、

和

等幾種DNA聚合酶，它們承擔(dān)著修復(fù)損傷的功能，但這些修復(fù)酶的忠實(shí)性都很低。第四章DNA復(fù)制真核生物DNA聚合酶特征dNTPMg2+3`-OH5`-3`真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性。第四章DNA復(fù)制KeyConcepts·Areplicationforkhas1complexofDNApolymeraseα/primaseand2complexesofDNApolymeraseδandδ/orε.·TheDNApolymeraseα/primasecomplexinitiatesthesynthesisofbothDNAstrands.·DNApolymeraseδelongatestheleadingstrandandasecondDNApolymeraseδorDNApolymeraseεelongatesthelaggingstrand.第四章DNA復(fù)制去除岡崎片段：分兩步RNA酶H1切斷DNA-RNA，F(xiàn)EN1蛋白降解RNA片段。真核生物的聚合酶沒(méi)有5'-3'外切酶活性，需要一種叫FEN1的蛋白切除5'端引物DNA連接酶I將相鄰的岡崎片段連接起來(lái)第四章DNA復(fù)制DNA末端復(fù)制端粒(telomere)

真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

1.由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成

2.末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C

堿基的短序列功能：1.維持染色體的穩(wěn)定性

2.維持DNA復(fù)制的完整性第四章DNA復(fù)制端粒酶(telomerase)特點(diǎn)：

1.由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合物

2.為特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA功能： 合成端粒DNA，維持端粒的長(zhǎng)度第四章DNA復(fù)制

爬行模型：第四章DNA復(fù)制離開(kāi)RNA模板的端粒DNA3’端可反折為雙鏈，并常出現(xiàn)兩個(gè)G之間的配對(duì)，以有利于DNA-RNA雜交鏈之間的相對(duì)滑動(dòng)。第四章DNA復(fù)制

端粒及端粒酶的意義：端粒特別是端粒酶的活性與細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、衰老凋亡以及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。端粒的平均長(zhǎng)度隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增多及年齡的增長(zhǎng)而逐漸變短至消失，可導(dǎo)致染色體穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致細(xì)胞衰老凋亡。體細(xì)胞幾乎沒(méi)有端粒酶活性，隨多次細(xì)胞分裂端粒逐漸縮短，細(xì)胞失去增殖能力。而端粒酶活性較高的胚原細(xì)胞，端粒長(zhǎng)度未縮短。腫瘤細(xì)胞端粒酶重新獲得活性，以維持端粒結(jié)構(gòu)致使染色體穩(wěn)定而成為永生細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞的端粒比正常人同類(lèi)細(xì)胞顯著縮短。第四章DNA復(fù)制DNA復(fù)制的調(diào)控?大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控?ColEI質(zhì)粒DNA的復(fù)制調(diào)控?真核細(xì)胞中DNA的復(fù)制調(diào)控第四章DNA復(fù)制復(fù)制的調(diào)控許多現(xiàn)象表明，DNA的復(fù)制是受到調(diào)控的。比如原核細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)條件下細(xì)胞的分裂速度是不同的，舉個(gè)例子：大腸桿菌細(xì)胞在37℃碳源充足的時(shí)候，分裂一次需要46分鐘；而在碳源不充足的時(shí)候，分裂一次需要10個(gè)小時(shí)，但是在兩種情況下，DNA復(fù)制的速度都是40分鐘左右第四章DNA復(fù)制大腸桿菌的復(fù)制調(diào)控?調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)與復(fù)制復(fù)合物的相互作用確定復(fù)制起始的頻率和復(fù)制方式。復(fù)制子由起始物位點(diǎn)和復(fù)制起點(diǎn)兩部分。第四章DNA復(fù)制大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制調(diào)控 復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，復(fù)制終止