蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化

關(guān)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和穩(wěn)定化第一節(jié):蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性一.蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的分子原因蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性:蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響,保持其生物活力的能力。第2頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素:

1.金屬離子、底物、輔因子和其他相對(duì)低分子質(zhì)量配體的結(jié)合作用

金屬離子由于結(jié)合到多肽鏈的不穩(wěn)定部分（特別是彎曲處），因而可以顯著增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)酶與底物、輔因子和其他低相對(duì)分子質(zhì)量配體相互作用時(shí)，也會(huì)看到蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加。第3頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

2蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用

由于蛋白質(zhì)分子表面上既有疏水簇，也有極性和帶電基團(tuán)。從熱力學(xué)上看，疏水簇與水的接觸對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是不利的。所以當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物時(shí)，脂分子或蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定到疏水簇上，因而防止疏水簇與溶劑的接觸，屏蔽了蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域。第4頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

3.鹽橋和氫鍵

鹽橋：當(dāng)一個(gè)氨基酸的氨基和與它空間相鄰的另一個(gè)氨基酸的羧基互相靠近時(shí)，形成鹽橋。

-COO.......H3N-

蛋白質(zhì)中鹽橋的數(shù)目較少，但對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性作用很顯著。第5頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

氫鍵：是通過(guò)氫原子參與成鍵的特殊形式的化學(xué)鍵。當(dāng)一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子與氫鍵合后，繼續(xù)與另一個(gè)電負(fù)性較強(qiáng)的原子鍵合：

氫鍵能維持二級(jí)結(jié)構(gòu)(如α-螺旋，β-片層，β-轉(zhuǎn)角等）。但是氫鍵對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要性不應(yīng)估計(jì)過(guò)高。

第6頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

4.二硫鍵

二硫鍵：即S－S鍵，是2個(gè)巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價(jià)鍵。鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵：

第7頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

由于交聯(lián)即蛋白質(zhì)中形成二硫鍵，伸展蛋白質(zhì)的熵急劇降低，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。與此類似，用雙功能試劑實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)交聯(lián)，也能使蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定化。第8頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

日常生活中的燙發(fā)和發(fā)型保持，主要原理是操縱毛發(fā)角蛋白二硫鍵的還原和再氧化，即二硫鍵的斷開(kāi)和重新鍵合。第9頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

5.對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量較低

蛋白質(zhì)中一些結(jié)構(gòu)比較重要的氨基酸殘基（如活性部位的氨基酸）的氧化作用是蛋白質(zhì)失活的重要原因。因此要減少這類對(duì)氧化修飾敏感的氨基酸含量，從而提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。第10頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月6.氨基酸殘基的堅(jiān)實(shí)裝配溶液中的蛋白質(zhì)似乎裝配緊密，其緊密程度類似于低相對(duì)分子質(zhì)量化合物的晶體狀態(tài)，盡管如此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中仍有空隙?？障吨谐錆M水分子，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，因此除去孔隙中的水分子，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更堅(jiān)實(shí)，穩(wěn)定性也增加。第11頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月7.疏水相互作用疏水性大小與穩(wěn)定性沒(méi)有必然的聯(lián)系非極性氨基酸在蛋白質(zhì)球體內(nèi)的規(guī)則的排列是穩(wěn)定性的原因之一增加疏水作用是穩(wěn)定蛋白質(zhì)的實(shí)用方法:1.降低蛋白質(zhì)表面的疏水性；

2.增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性第12頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月有3個(gè)主要因素不利于疏水相互作用：

1.蛋白質(zhì)球體中的氨基酸必須相當(dāng)緊密地堆積；

2.影響氨基酸幾何形狀和能量的微環(huán)境；

3.蛋白質(zhì)多肽鏈折疊時(shí)需要疏水簇仍保持在蛋白質(zhì)表面，因?yàn)樵隗w內(nèi)，疏水簇負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)與其他分子的疏水相互作用。第13頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月二.測(cè)定蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法比較蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的準(zhǔn)則包括:1.熔化溫度Tm;蛋白質(zhì)伸展一半時(shí)的變性劑濃度2.蛋白質(zhì)自由能;3.最大穩(wěn)定性溫度(Ts);4.在特定溫度下蛋白質(zhì)功能活性維持時(shí)間.第14頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

熔化溫度Tm和蛋白質(zhì)伸展50%時(shí)的變性劑濃度是預(yù)測(cè)酶穩(wěn)定性的最有用參數(shù);1.Tm:

蛋白質(zhì)受熱伸展過(guò)渡中點(diǎn)時(shí)的溫度;2.變性劑濃度:蛋白質(zhì)加變性劑伸展過(guò)程中使蛋白質(zhì)伸展一半時(shí)所需要的變性劑濃度;第15頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月第二節(jié)：蛋白質(zhì)失活的原因和機(jī)理一.蛋白水解酶和自溶作用

1.酶在使用和貯存過(guò)程中的失活常是由于微生物和外源蛋白水解酶作用的結(jié)果。蛋白水解酶可催化肽鍵水解。

2.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物也是一種蛋白水解酶時(shí)，就會(huì)發(fā)生自我降解現(xiàn)象，叫做自溶。第16頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

二.聚合作用：蛋白質(zhì)發(fā)生可逆性伸展→→伸展的蛋白質(zhì)分子彼此締合

→→可能發(fā)生蛋白質(zhì)分子間二硫鍵的形成從而使蛋白質(zhì)沉淀析出.

第17頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)的聚合作用和沉淀的區(qū)別：1.蛋白質(zhì)的聚合作用可能是可逆的,并不一定是不可逆的.

2.沉淀作用意味著蛋白質(zhì)并未發(fā)生顯著的構(gòu)象變化即從溶液中析出。因此，沉淀很容易再溶于水溶液中，并恢復(fù)其全部天然特性。第18頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

三、極端pH:

極端pH下引起蛋白質(zhì)變性的重要因素是：一旦遠(yuǎn)離了蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的，那么蛋白質(zhì)分子內(nèi)相同電荷間的靜電斥力會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)伸展。從而使埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部非電離殘基發(fā)生電離，導(dǎo)致失活。

pH的變化可以引起蛋白質(zhì)的伸展,這個(gè)過(guò)程原則上是可逆的,但這些變化常能導(dǎo)致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.第19頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月四、氧化作用:

各種氧化劑能氧化帶芳香族側(cè)鏈的氨基酸以及蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸殘基，從而使蛋白質(zhì)變性。分子氧、H2O2和氧自由基是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)氧化劑。五、表面活性劑和去污劑

表面活性劑在很低濃度下能使蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性.其中陰離子去污劑的作用比陽(yáng)離子和非離子去污劑強(qiáng)烈.第20頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月六、變性劑：

1.脲和鹽酸胍:機(jī)制尚不明確,可能是消除了維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水作用力或直接與蛋白質(zhì)分子作用.

2.高濃度鹽：高濃度鹽既有穩(wěn)定作用也有變性作用，這要看鹽的性質(zhì)和濃度。

3.螯合：常常不可逆地失活需要金屬輔因子的酶，但可穩(wěn)定不需要金屬輔因子的酶；

4.有機(jī)溶劑：改變?nèi)芤旱慕殡姵?shù);增加疏水核的溶解度,降低帶電表面的溶解度;奪去酶分子表面的必需水而使酶失活.第21頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月七、重金屬離子和巰基試劑:

與蛋白質(zhì)的巰基、二硫鍵以及色氨酸、組氨酸殘基反應(yīng)。八、熱:

熱失活是工業(yè)上最經(jīng)常遇到的酶失活的原因.熱失活分二步過(guò)程:伸展---不可逆失活.九、機(jī)械力：

振動(dòng)、剪切、超聲波、壓力都可能引起蛋白質(zhì)的變性。這種變性理論上是可逆的，但也可能伴隨著其他反應(yīng)而不可逆地失活.

第22頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月十、冷凍和脫水：

冷凍和脫水時(shí)，溶質(zhì)被濃縮，引起酶微環(huán)境中pH和離子強(qiáng)度的劇烈改變，減弱疏水相互作用,并可能引起二硫交換和巰基的氧化。十一、輻射作用:

輻射可產(chǎn)生自由基(.OH,H2O2,O2-.等)直接或間接地作用于蛋白質(zhì)分子.第23頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月第三節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定化

酶的穩(wěn)定化方法

固定化非共價(jià)修飾化學(xué)修飾④蛋白質(zhì)工程第24頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月一固定化固定化可通過(guò)下列效應(yīng)影響酶的穩(wěn)定性：

空間障礙：由于空間障礙可以防止蛋白水解酶的作用，阻擋酶與化學(xué)失活劑的接觸，同時(shí)阻礙氧向酶的擴(kuò)散可以保護(hù)對(duì)氧不穩(wěn)定的酶

擴(kuò)散機(jī)制:使酶發(fā)生交聯(lián)或包埋在載體緊密的孔中可以使酶的構(gòu)象更加堅(jiān)牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過(guò)渡。第25頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月一酶固定到載體上后可產(chǎn)生空間障礙，結(jié)果其他大分子難于與酶作用，因此，固定到載體上的酶往往能抵抗蛋白水解酶的降解作用，這也是防止蛋白水解酶自溶的原因二底物、配體和氫離子濃度在載體附近和整體溶液之間的分布不均一，造成載體周圍的局部濃度與整體濃度不同，也就是酶的微環(huán)境發(fā)生了變化第26頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月三當(dāng)酶包埋在多孔顆粒內(nèi)，底物必須先擴(kuò)散到顆粒表面（外部質(zhì)量傳遞），然后進(jìn)入顆粒內(nèi)部（內(nèi)部質(zhì)量傳遞），酶才能與其作用，這些擴(kuò)散限制可明顯使固定化酶“穩(wěn)定化”外擴(kuò)散：底物必須從流動(dòng)的水溶液傳遞到固定化酶顆粒外表面內(nèi)擴(kuò)散:底物進(jìn)一步傳遞到固定化酶顆粒內(nèi)部第27頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月四將酶多點(diǎn)共價(jià)連接到載體表面，或用雙功能試劑交聯(lián)酶，或?qū)⒚赴裨谳d體緊密的孔中，可以使酶構(gòu)象更加堅(jiān)牢，從而阻止酶構(gòu)象從折疊態(tài)向伸展態(tài)過(guò)渡。

A

B

CA.用多功能試劑交聯(lián)；B.共價(jià)或非共價(jià)連于載體上

C.包埋到載體的緊密孔中

第28頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

二、非共價(jià)修飾反相膠束添加劑蛋白質(zhì)間非共價(jià)相連，形成的多聚體或者聚合體的活力和穩(wěn)定性常比單體高第29頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

反膠束是由兩性化合物在占優(yōu)勢(shì)的有機(jī)相中形成的。它不僅可以保護(hù)酶，還能提高酶活力，改變酶的專一性。

反相膠束示意圖

第30頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月添加劑專一性底物及配體;非專一性中性鹽和多羥基物質(zhì);與失活劑競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)或除掉破壞化學(xué)催化劑的物質(zhì)第31頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

添加劑不僅可以提高酶的熱穩(wěn)定性，還可提高酶的抗蛋白水解，抗化學(xué)試劑，抗PH變化，抗變性劑，抗稀釋作用

例如：甘油，糖和聚乙二醇是多羥基化合物，能形成很多氫鍵，并助于形成“溶劑層”，增加表面張力和溶液黏度，這類添加劑通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的有效脫水，降低蛋白質(zhì)水解作用而起穩(wěn)定酶的作用第32頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)非共價(jià)相連蛋白質(zhì)間相互作用時(shí)，由于從蛋白質(zhì)表面相互作用區(qū)域排除水，因而降低自由能，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定酶形成的多聚體或聚合體的活力和穩(wěn)定性也常比其單體高

第33頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月三、化學(xué)修飾

化學(xué)修飾即修飾作用可達(dá)到穩(wěn)定酶的作用，得到可溶性穩(wěn)定化酶。

1.可溶性大分子修飾酶：聚乙二醇（PEG）、右旋糖苷、肝素等多糖以及白蛋白，多聚氨基酸

2.小分子修飾酶第34頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月原因：修飾有時(shí)會(huì)獲得不同于天然蛋白質(zhì)構(gòu)象的更穩(wěn)定的構(gòu)象；修飾關(guān)鍵功能基團(tuán)也會(huì)達(dá)到穩(wěn)定化；由化學(xué)修飾引入到蛋白質(zhì)的新的功能基團(tuán)有可能形成附加氫鍵或鹽鍵；用非極性試劑修飾可加強(qiáng)蛋白質(zhì)中疏水相互作用；蛋白質(zhì)表面基團(tuán)的親水性；交聯(lián)酶晶體第35頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月酶的失活和再活化對(duì)于可逆性酶，可以采取相應(yīng)措施實(shí)現(xiàn)其再活化例如：用過(guò)量的碘離子使脲酶重新天然化，該酶失活是由于重金屬陽(yáng)離子使巰基中毒引起，再活化的機(jī)理是碘離子與結(jié)合的金屬離子形成碘結(jié)合物

對(duì)于不可逆變性酶，可用下述方法進(jìn)行再活化：用變性劑使固定化酶伸展成無(wú)規(guī)則盤繞狀態(tài)第36頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月最新進(jìn)展可將變性的蛋白質(zhì)分子孤立在反膠束內(nèi)，蛋白質(zhì)在反相膠束內(nèi)可重新折疊成天然狀態(tài)，而且沒(méi)有與其他變性分子接觸和聚合，此膠束由表面活性劑穩(wěn)定的水滴構(gòu)成，并懸浮于異丁烷中。第37頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月第四節(jié)各種酶穩(wěn)定化方法的比較比較各種不同的酶穩(wěn)定化方法是困難的，因此制定的了一下一般的標(biāo)準(zhǔn)：①穩(wěn)定性至少要增加1~3個(gè)數(shù)量級(jí)②應(yīng)對(duì)各種酶失活因素(物理，化學(xué)及生物學(xué)因素)③穩(wěn)定化不應(yīng)減少酶活力或改變酶的專一性④穩(wěn)定化方法適合各類蛋白質(zhì)⑤穩(wěn)定化方法應(yīng)在體內(nèi)，體外都適用⑥從經(jīng)濟(jì)角度看，方法應(yīng)具有方法的潛力第38頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)工程定義以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)化學(xué)、物理和分子生物學(xué)的手段進(jìn)行基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。第五節(jié)蛋白質(zhì)工程第39頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)：

是按預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)分子設(shè)計(jì)和DNA重組技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會(huì)需要的新型蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：提供了有目的改變酶性能的可能性，不僅改變酶的結(jié)構(gòu)，也可以改變其催化活力及專一性和穩(wěn)定性。第40頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程方法

①DNA改組技術(shù)②定點(diǎn)突變技術(shù)③組合設(shè)計(jì)④理性設(shè)計(jì)第41頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月DNA改組技術(shù)的定義

DNA改組(DNAshuffling),也稱分子育種(molecularbreeding)或有性PCR(sexualPCR),是以單個(gè)基因或多個(gè)同源基因(一般為天然存在的基因家族)為模板,將其切割成一系列隨機(jī)大小的DNA小片段,然后在體外通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)將這些片段隨機(jī)重組成全長(zhǎng)基因,實(shí)現(xiàn)同源基因重組,達(dá)到分子進(jìn)化目的的一種技術(shù)。第42頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月隨著突變方法、突變體高通量篩選技術(shù)、基因結(jié)構(gòu)與功能研究的突破，特別是PCR技術(shù)的進(jìn)一步成熟，DNA改組技術(shù)(DNAshuffling)更加成熟，使得DNA改組成為蛋白質(zhì)體外分子進(jìn)化的主流技術(shù)。DNA改組技術(shù)具有許多重要優(yōu)點(diǎn)，例如不需要事先了解結(jié)構(gòu)信息，也不需要了解蛋白質(zhì)的功能關(guān)系，其缺點(diǎn)是需要配合快速、可靠的鑒別突變體的方法。第43頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月定點(diǎn)突變技術(shù)(Site-directedmutagenesis)是在已知蛋白質(zhì)中取代、插入或刪除特定的氨基酸殘基，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和對(duì)應(yīng)功能，又被稱為理性設(shè)計(jì)(rationaldesign)。它可以作為DNA改組技術(shù)的有益補(bǔ)充，是基于基因和蛋白質(zhì)信息進(jìn)行基因和蛋白質(zhì)序列的改造，通過(guò)定點(diǎn)突變使得所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的特征改變。第44頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

組合設(shè)計(jì)（combinationaldesign）和數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)（data-drivendesign）是另外兩種最新的可以提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)工程技術(shù)。第45頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

組合設(shè)計(jì):

是通過(guò)一種策略使得在基因水平上產(chǎn)生差異化，同時(shí)，通常需要大量的高通量篩選來(lái)鑒別設(shè)計(jì)是否獲得成功。組合設(shè)計(jì)方法的目標(biāo)在于通過(guò)在蛋白質(zhì)隨機(jī)位點(diǎn)引入隨機(jī)突變（randommutation）來(lái)提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

第46頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

組合設(shè)計(jì)方法的優(yōu)點(diǎn)：在于不像理性設(shè)計(jì)那樣需要詳細(xì)的蛋白質(zhì)殘基信息和知識(shí)。不過(guò)，從大量的組合產(chǎn)生的變異體集合中，有效鑒別穩(wěn)定性提升的蛋白質(zhì)是極為重要的，因此篩選工作非常重要。第47頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)：

以不斷增加的、相同功能的氨基酸序列以及核苷酸的可用性為基礎(chǔ)的。它通過(guò)利用有效的數(shù)據(jù)來(lái)選擇蛋白質(zhì)的目標(biāo)區(qū)域，減少數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)量，而不需要指出精確的變化。

第48頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)將理性設(shè)計(jì)方法的小數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)量和缺乏設(shè)計(jì)突變所需要的指定信息合并，數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)方法最近被用來(lái)促進(jìn)篩選過(guò)程。通過(guò)考慮可獲得的有用數(shù)據(jù)（如結(jié)構(gòu)和序列信息），減少序列空間，篩選變體數(shù)量。第49頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月

第六節(jié)蛋白質(zhì)糖基化蛋白質(zhì)的糖基化修飾是廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾形式之一，在決定蛋白質(zhì)功能以及保護(hù)蛋白質(zhì)免受熱力學(xué)降解方面發(fā)揮重要的作用。蛋白質(zhì)糖基化的分類：①O-糖基化②N-糖基化第50頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月糖基化位點(diǎn)的確定方法①PNGaseF酶法

當(dāng)前，因操作方法極為穩(wěn)定，被應(yīng)用最為廣泛的N-糖蛋白鑒定方法就是PNGaseF酶法。其原理是當(dāng)天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼釙r(shí)，相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)增加0.98，從而起到質(zhì)量標(biāo)記糖基化位點(diǎn)的作用。但此法的缺點(diǎn)確是不能區(qū)分酶促去糖基化與自發(fā)脫氨基間的區(qū)別，另外，由于質(zhì)量差只有0.98，很難用質(zhì)譜儀等進(jìn)行區(qū)分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易被錯(cuò)讀。第51頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月②EndoH酶法

內(nèi)切乙酰葡糖胺酶在去糖基化時(shí)會(huì)將N-糖鏈五糖核心中與天冬酰胺相連的GlcNAc以外的部分切除，而在糖基化位點(diǎn)處留下GlcNAc，從而起到標(biāo)記糖基化位點(diǎn)的作用。此法分析的局限性很大，EndoH僅能作用于雜合型N-糖鏈和高甘露糖型。第52頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年，5月③三氟甲基磺酸法

三氟甲基磺酸法可以切除與肽鏈直接相連的單糖以外的所有糖基，留下的糖基則起到標(biāo)記糖基化位點(diǎn)的作用。此法的鑒定速度較快、實(shí)驗(yàn)條件較為溫和、可以作用于任一類型的糖鏈。但其缺點(diǎn)確是操作過(guò)程要全程無(wú)水且在存在唾液酸的條件下會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生部分影響。第53頁(yè),共60頁(yè)，星期六，2024年