國境口岸諾卡氏菌PCR檢測方法

國境口岸諾卡氏菌PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)給出了國境口岸痰標(biāo)本分離培養(yǎng)物中諾卡氏菌的PCR檢測方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于國境口岸痰標(biāo)本中諾卡氏菌的實(shí)驗(yàn)室檢測2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件人間傳染的病原微生物名錄(衛(wèi)生部下列術(shù)語和定義適用于本文件諾卡氏菌Nocaroia革蘭氏染色陽性菌。某些菌株在生長的某一階段可呈抗酸染色陽性。細(xì)菌呈球狀、桿狀、絲狀菌落外貌多樣，菌體大小0.6pmx(3μm~4μm),專性需氧，營養(yǎng)要求一般。在普通瓊脂平板上培養(yǎng)2d后有可見菌落，7d-10d后菌落凸起。不同種的菌落有白、黃、橙、紅或這些色素的混合色諾卡氏菌屬現(xiàn)已報(bào)導(dǎo)103種。對人或動物致病的有星形諾卡氏菌、巴西諾卡氏菌、鼻疽諾卡氏菌和豚諾卡氏菌感染Nocandlainte最常見的癥狀是肺炎，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、體重減輕、咳嗽、肋膜炎性胸痛、呼吸困難，診斷是需要與肺結(jié)核鑒別。諾卡氏菌感染還可表現(xiàn)為肉牙腫樣皮膚損傷和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常。革蘭氏染色和細(xì)菌培養(yǎng)是診斷諾卡氏菌感染的主要方法。4儀器和設(shè)備4.1Ⅱ級生物安全柜4.3水平冷凍離心機(jī)(RCF3500g以上)。4.7紫外成像儀。4.8100℃熱浴儀。4.9正置光學(xué)顯微鏡。5試劑和耗材5.4無菌2.9%枸橡酸鈉溶液。5.6無水乙醇。5.8革蘭氏染色液。5.9抗酸染色液。5.10瓊脂糖。5.11TBE電泳緩沖液。6生物安全要求按照GB19489和《人間傳染的病原微生物名錄》的要求，諾卡氏菌相關(guān)材料的生物安全要求如下；——大量活菌培養(yǎng)和動物感染實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全二級(BSL-2或ABSL-2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行；——未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料的操作在生物安全二級(BSL-2)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行； 滅活材料的操作在生物安全一級(BSL-)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行： 檢驗(yàn)過程中的廢棄物，收集后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，作為醫(yī)療廢棄物處理或其他等效的處理方法。7痰標(biāo)本采集和處理7.1痰標(biāo)本采集通風(fēng)環(huán)境中采集受檢人員空腹的晨痰5mL,置于50mL無菌離心管中1h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，或4℃保存，24h內(nèi)進(jìn)行檢測。7.2病標(biāo)本處理在Ⅱ級生物安全柜(4.1)內(nèi)進(jìn)行痰標(biāo)本處理，加2倍痰液體積的前處理液(4%NaOH和2.9%枸橡酸鈉等體積混合溶液),按0.25g50mL含量加人NALC,室溫輕輕混勻20min,使痰液充分液化。及時(shí)加入無菌PBS至50mL,混勻后，4℃水平離心15min,RCF不低于3500g。離心后棄去上清液，加1.2mL無菌PBS重懸離心沉淀物，取250μL重懸痰標(biāo)本接種到羅氏培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8周。剩余的痰懸液轉(zhuǎn)移人1.5mL無菌離心管內(nèi)-20℃保存。7.3痰標(biāo)本培養(yǎng)物觀察痰標(biāo)本接種到培養(yǎng)基后，第1周內(nèi)每日觀察細(xì)菌生長情況，第2周至第8周每周觀察1次細(xì)菌生長情況，發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長，既可進(jìn)行PCR檢測。Nocardiabrasiliensis標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC19296)在羅氏培養(yǎng)基上的生長參見圖A.I。Nocardiabrasiliensis標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC19296)在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長參見圖A.2。8細(xì)菌核酸提取無菌吸取0.5mL液體培養(yǎng)基中的沉淀物，置于15mL無菌離心管內(nèi)，13000r/min離心10min,去上清液，加人50pL無菌去離子水(5.13)重懸沉淀；或無菌刮取肉眼可見的細(xì)菌菌落，置于1.5mL無菌離心管內(nèi)，溶于50μL無菌去離子水(5.13)中，用于細(xì)菌核酸提取。根據(jù)細(xì)菌的量可以增減無菌去離子水(5.13)的體積。將放有細(xì)菌標(biāo)本的1.5mL無菌離心管于100℃熱溶30min,12000r/min離心10min。上清液即為DNA模板，用于PCH擴(kuò)增。剩余DNA可保存在-20℃。8.2試劑盒提取純化核酸法按革蘭氏陽性細(xì)菌核酸提取的試劑盒說明書操作。9PCR檢測擴(kuò)增片段大小598bp.設(shè)計(jì)引物，引物應(yīng)用液濃度配制成100μmol/L,序列分別如下 物NG2:5'-ACCGACCACAAGGCGG19296);陰性對照用無菌水或分面紅菌接酸作為PCR反應(yīng)的模板9.3PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系為2×Mastermix10μL;引物NG1和NG2各1.5μL;ddH?O?pL;最后加DNA模9.4PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30個(gè)循環(huán)72℃延伸5min;4℃保溫。因不同PCR儀器的性能差異，可根據(jù)條件優(yōu)化適當(dāng)消藍(lán)PCR退火溫度9.5瓊脂糖凝膠電泳用0.5xTBE電泳緩沖液制備1.8%的瓊脂糖凝膠平板(含溴化乙錠或其他等效染料)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和上樣緩沖液1pL混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照，推薦使用100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。按100V的電壓條件電泳約1h。采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察核酸條帶并判斷結(jié)果。10檢測結(jié)果判斷當(dāng)陽性對照出現(xiàn)598hp目的片段條帶，而陰性對照沒有任何核酸條帶出現(xiàn)時(shí)才可對樣本進(jìn)行結(jié)果判斷及報(bào)告。否則視為實(shí)驗(yàn)失敗，需重新實(shí)驗(yàn)。10.2檢測結(jié)果判斷及報(bào)告 檢測樣品出現(xiàn)598bp條帶，而陰性對照沒有任何核酸條帶出現(xiàn)時(shí)，判斷為“檢出諾卡氏菌(PCR法”。報(bào)告“檢出諾卡氏菌(PCR法”。 驗(yàn)測樣品未出現(xiàn)59