《飼料及飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查 膠體金快速定量法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明》

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是一種單端孢霉烯族毒

素，同時(shí)也是一種倍半萜烯化合物，分子量為296，易溶于水等極性溶劑中，性質(zhì)較為穩(wěn)定，

是一種無色的針狀結(jié)晶，具有較強(qiáng)的抗熱能力，熔點(diǎn)為151~152℃，在堿性與高壓環(huán)境下可

破壞部分毒素，但一般食物處理工藝，基本不能破壞其毒性。但用蒸餾水或者加入堿性物質(zhì)

的水沖洗染有霉菌的谷物，嘔吐毒素的含量可減少65%~69%，若用0.1mol/L的碳酸鈉溶液

浸泡24~72h，毒素的含量可減少42%~100%。

DON主要由禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌以及擬枝孢鐮刀菌等多種鐮刀菌屬產(chǎn)生，在小麥、

玉米、大麥等谷物和飼料中污染最為嚴(yán)重。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評估顯示，嘔吐毒素可

致癌、致畸形、致突變，其毒性具體主要表現(xiàn)在細(xì)胞毒性、遺傳毒性和急慢性毒性、免疫毒

性作用幾個(gè)方面。近些年，科學(xué)家指出嘔吐毒素與食管癌、腎病等可能有直接關(guān)系。流行病

學(xué)表明，DON也可能影響人類免疫系統(tǒng)。嘔吐毒素與玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、煙曲

霉毒素、赭曲霉毒素A等其他毒素也存在聯(lián)合污染，相互產(chǎn)生累加作用、拮抗作用、增強(qiáng)

作用以及協(xié)同作用等，將帶來更為嚴(yán)重的食品安全問題，給國民健康帶來一系列威脅，因此

引起了社會(huì)各界的高度重視。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價(jià)格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進(jìn)一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時(shí)存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動(dòng)物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護(hù)人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟(jì)利益。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項(xiàng)目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來越多地被利用為貿(mào)易保護(hù)主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費(fèi)者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時(shí)在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進(jìn)行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為打開市場并占領(lǐng)市場提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

目前，世界各國飼料、谷物等食類中DON限量標(biāo)準(zhǔn)還未統(tǒng)一。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB

13078.3-2007中規(guī)定：犢牛、泌乳期動(dòng)物以及豬配合飼料中DON允許限量不能超過

1

1.0mg/kg，而家禽、牛配合飼料允許限量較高，不能超過5.0mg/kg，但未制定飼料原料（酒

槽中蛋白飼料參照農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1968-2010不能超過1.0mg/kg）中嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。GB

2761-2017中規(guī)定：玉米、玉米面（渣、片）、大麥、小麥、麥片、小麥粉中DON含量均不

得超過1mg/kg。我國要求人類消費(fèi)品中DON允許限量≤1mg/kg，但現(xiàn)今我國還沒有規(guī)定牛

奶中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)，可見我國在毒素污染超標(biāo)程度判定方面尚不完整，還需相關(guān)部門不

斷修訂、完善相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以此加強(qiáng)安全監(jiān)管。

國外方面，美國規(guī)定人類食用面粉中最高限量為1mg/kg，飼喂豬等動(dòng)物的谷物中（除

過玉米）DON含量不得超過5mg/kg，且要小于總食用量的40%。歐盟規(guī)定谷粉及玉米粉中

允許限量≤0.75mg/kg，未加工的硬質(zhì)小麥、燕麥中DON含量不得超過1.75mg/kg。加拿大

規(guī)定牛、禽飼料中DON允許含量≤5mg/kg，嬰兒食品中最高限量為1mg/kg。俄羅斯規(guī)定硬

質(zhì)小麥、面粉中最高限量為1mg/kg。奧地利規(guī)定小麥、裸麥中DON最高限量為0.5mg/kg。

在巴西，研磨小麥和麥麩中DON不得超過2mg/kg，面食、餅干中DON不得超過1.75mg/kg。

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太

復(fù)雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測法，主

要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時(shí)檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測定

時(shí)DON需要進(jìn)行衍生化、上一次進(jìn)樣待測物品滯留、重復(fù)進(jìn)樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差

等一系列問題。HPLC法雖可精確進(jìn)行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴

而成本高，同時(shí)需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機(jī)

構(gòu)的定量分析。ELISA檢測嘔吐毒素，樣品前處理步驟簡單且可實(shí)現(xiàn)定量化，但這種生物

學(xué)方法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場上的同一物質(zhì)試劑

盒檢測結(jié)果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗(yàn)和基

層檢測，尤其是野外和偏遠(yuǎn)地區(qū)人員現(xiàn)場應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)十分方便，但是我國目前還沒有針對

飼料原料中嘔吐毒素膠體金免疫層析快速測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，嚴(yán)重影響了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要

嘔吐毒素是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真菌分

布于各級食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進(jìn)的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物種植、

收獲、儲藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，

人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對食品安全的關(guān)注進(jìn)一步提高，迫切需要相應(yīng)的檢測

技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點(diǎn)，嘔吐毒素快速檢測技術(shù)的研究

及制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2、實(shí)現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

嘔吐毒素毒性很高，可通過污染谷物和那些來源于被嘔吐毒素污染了的飼料喂飼的動(dòng)物

2

性食物（如牛奶、肉和蛋）而進(jìn)入食物鏈，危害人類健康。其具有致癌、致畸形、致突變性，

還具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性和急慢性毒性、免疫毒性，可能影響人類免疫系統(tǒng)。為了對國家、

人民高度負(fù)責(zé)，保障人民生命安全和農(nóng)村社會(huì)穩(wěn)定，研究嘔吐毒素快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)

的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

3、適應(yīng)市場經(jīng)濟(jì)和加入WTO新形勢的需要

我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個(gè)市場，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動(dòng)密

集型）進(jìn)入國際市場提供了很好的機(jī)遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易

于被真菌污染，可能存在嘔吐毒素等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制約

因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，

給我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)

量，提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競爭力，研究嘔吐毒素快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非

常必要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程

《飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所、

北京勤邦生物技術(shù)有限公司、雙胞胎（集團(tuán)）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司負(fù)

責(zé)起草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原料中嘔吐

毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括以下幾個(gè)方面：

（1）詳細(xì)查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻(xiàn)等技術(shù)資料，

并對這些資料進(jìn)行了詳細(xì)的對比，從方法的先進(jìn)性、可靠性和實(shí)用性等幾個(gè)方面考慮，選取

了幾個(gè)代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時(shí)購置相關(guān)的實(shí)驗(yàn)試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；已將DON與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)

得到具有羧基官能團(tuán)的半抗原；將DON半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別進(jìn)行偶聯(lián)得

到免疫原和包被原；已將制備獲得的抗原通過免疫小鼠獲得DON單克隆抗體；建立了膠體

金免疫層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對方法進(jìn)行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗(yàn)，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進(jìn)行試驗(yàn)

和驗(yàn)證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測出飼料原料中DON的含量。如：方

法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg四種濃度

對飼料原料進(jìn)行添加，確定檢測限；方法的準(zhǔn)確率，通過對經(jīng)驗(yàn)證的陰陽性樣品進(jìn)行檢測，

得到本檢測方法的假陰性率和假陽性率，盲樣測定與儀器方法的結(jié)果進(jìn)行比對，確保本方法

的檢測結(jié)果可靠；方法的特異性，運(yùn)用本方法對飼料原料中常見的其他真菌毒素進(jìn)行檢測，

確保本方法能特異性地檢測飼料原料中DON殘留。

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗(yàn)工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T

20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進(jìn)行編寫的。有關(guān)技術(shù)

3

內(nèi)容是在參考國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進(jìn)和驗(yàn)證后制定的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競爭抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，

標(biāo)記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢

向另一端滲移。在移動(dòng)的過程中，會(huì)發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫金的顏色而顯示

出來。樣本中的嘔吐毒素在流動(dòng)的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝

酸纖維素（NC）膜檢測線上嘔吐毒素-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線不顯顏色，結(jié)果為陽牲；

反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。

（二）膠體金免疫方法主要材料的制備

1、半抗原的合成及鑒定

DON為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與大分子共價(jià)結(jié)合后

才能使動(dòng)物免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實(shí)驗(yàn)首先需要合成小分子半抗原與蛋白質(zhì)偶

聯(lián)的人工抗原。

DON小分子半抗原的制備既要保留其基本結(jié)構(gòu)特征，同時(shí)又要很好地與大分子蛋白結(jié)

合。本項(xiàng)目通過DON小分子結(jié)構(gòu)改造獲得具有羧基官能團(tuán)的半抗原，與牛血清白蛋白（BSA）

偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。

將DON與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)得到具有羧基官能團(tuán)的半抗原，合成路線如下：

半抗原合成的具體步驟：30mg嘔吐毒素、60mg鄰苯二甲酸酐和0.1mL吡啶在5mL

DMSO中的混合液，在80℃下攪拌反應(yīng)15h，蒸除溶劑，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單嘔

吐毒素酯，即為DON半抗原。

2、人工抗原的合成及鑒定

（1）免疫原的合成

將DON半抗原與BSA進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。

具體操作如下：

4

取8mg半抗原，溶解于0.8mL二甲基甲酰胺（DMF）中；取20mg碳化二亞胺（EDC）

用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取BSA

36mg，使之充分溶解在3mL0.1mol/LCB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶

液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換3次透析液，得到DON

免疫原。

（2）包被原的合成

將DON半抗原與OVA進(jìn)行偶聯(lián)得到包被原。

具體操作如下：

取8mg半抗原，溶解于0.8mLDMF中；取20mgEDC用0.2mL水充分溶解后加入半抗

原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取OVA36mg，使之充分溶解在3mL

0.1mol/LCB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，

用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換3次透析液，得到DON包被原。

（3）DON免疫原與包被原的鑒定

一般通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因?yàn)榘肟乖c蛋白

在紫外下有不同的特征吸收，當(dāng)偶聯(lián)成功時(shí)，偶聯(lián)物的紫外吸收會(huì)有二者的迭加效應(yīng)出現(xiàn)，

因此比著單獨(dú)的蛋白特征吸收會(huì)發(fā)生一定的偏移，可用于檢測偶聯(lián)是否成功。

偶聯(lián)比的測定

用pH7.4的PBS溶液稀釋DON半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白與DON

半抗原的結(jié)合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，得到它

們的紫外吸收光譜圖。

根據(jù)公式K=A/CL分別計(jì)算出DON半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾消光系數(shù)。

在載體蛋白和DON半抗原的最大波長處檢測偶聯(lián)物的光吸收值，按公式計(jì)算兩種物質(zhì)在偶

聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KDON264-A偶264×KDON280）

蛋白含量的測定

將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式計(jì)算蛋白的

濃度即偶聯(lián)物的濃度：

蛋白質(zhì)（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鑒定結(jié)果

通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)DON半抗原、載體蛋

白、偶聯(lián)物在特定波長的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為13:1和11:1，

偶聯(lián)效果較好。

3、抗體的制備

（1）動(dòng)物免疫

用無菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（DON半抗原-BSA）與弗

5

氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對8~10

周齡Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采

用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量

同上；31天后加強(qiáng)免，不加佐劑，直接采用DON半抗原-BSA免疫。免疫過程見表1。

表1動(dòng)物免疫過程

免疫過程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時(shí)間

首免DON半抗原-BSA（FCA）150-

二免DON半抗原-BSA（FICA）15014天

三免DON半抗原-BSA（FICA）15014天

加強(qiáng)免（融合前三天）DON半抗原-BSA1003天

（2）單克隆抗體的制備

飼養(yǎng)細(xì)胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入

超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用

剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性

分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，

注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動(dòng)小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，

注入離心管。如此反復(fù)操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)

液重懸細(xì)胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

脾細(xì)胞制備：加強(qiáng)免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%

酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640

至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。

骨髓瘤細(xì)胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細(xì)胞數(shù)>95%）骨髓瘤細(xì)胞，將之完全吹

下，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，

加RPMI1640至30mL，計(jì)數(shù)待用。

細(xì)胞混合：脾細(xì)胞:骨髓瘤細(xì)胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。

細(xì)胞融合：將混合好的細(xì)胞離心，倒干上清，把沉淀細(xì)胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，

在1min內(nèi)加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細(xì)

胞，在隨后4min內(nèi)加入20mL無血清的PEG營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用

20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪種于含飼養(yǎng)細(xì)胞96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)

箱中。

上清檢測：待細(xì)胞長至孔底的1/2~1/3時(shí)，采用間接競爭ELISA法測定細(xì)胞上清液，篩

選陽性孔。將陽性細(xì)胞在檢測后2天內(nèi)采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。10~14天后，再取細(xì)胞

上清檢測，最終得到了穩(wěn)定分泌DON的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和

傳代。

老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹

水。

注射細(xì)胞：收集雜交瘤細(xì)胞并用1640洗細(xì)胞兩遍，取100到150萬細(xì)胞注射于老鼠腹

6

腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。

腹水采集：注射細(xì)胞一周后對腹腔腫大的老鼠用無菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔

一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。

單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)

境保存，腹水在使用前經(jīng)過0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一

次。

4、膠體金的制備

（1）玻璃器皿的準(zhǔn)備

用于實(shí)驗(yàn)的所有玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來水沖洗去除玻

璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，

再用去離子水把每個(gè)玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專用的玻璃器皿用第一次生成的膠

體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會(huì)干

擾金顆粒的生成。

（2）檸檬酸三鈉還原法

取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高

溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透

亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。

（3）膠體金的質(zhì)量鑒定

肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無雜質(zhì)、透明度較

高，說明膠體金質(zhì)量較好，結(jié)果見圖1。

圖1肉眼觀察膠體金顏色

紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進(jìn)行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長，

觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結(jié)果見圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說明膠體金

顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長為523nm。

7

圖2膠體金的紫外/可見分光光度計(jì)掃描圖

透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無橢圓形及多角形。

拍片放大后測量膠體金顆粒直徑大小，取多個(gè)點(diǎn)計(jì)算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的

透射電鏡掃描圖片見圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒

有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉(zhuǎn)換成電子版圖片，放大后測量膠體金顆粒直徑

大小。隨機(jī)挑選10個(gè)膠體金顆粒通過計(jì)算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。

圖3膠體金電鏡掃描圖片

（4）膠體金溶液的準(zhǔn)備

用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵

塞，故不能用pH計(jì)測定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。

5、膠體金標(biāo)記抗體的制備

（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇

以目測法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為7.2，

分裝9管，每管1mL。待標(biāo)記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為

50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜

置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，

觀察結(jié)果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見表2，結(jié)果見表3和圖4。

8

表2最適蛋白用量操作步驟

管數(shù)

試劑

123456789

抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1

抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400

膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

搖勻，靜置5min

10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10

搖勻，靜置2h后，觀察結(jié)果

備注：第1管為沒有加入抗體的對照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水，第9管為沒有加入氯化鈉的對照管，其內(nèi)加

入0.1mL三蒸水。

表3目測法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量

管號123456789

蛋白添加量（μg）0510152025303540

終顏色藍(lán)灰紅藍(lán)紅紅紅紅紅紅紅

圖4膠體金與抗體比例試驗(yàn)結(jié)果

由表3和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2管，

呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達(dá)到或

超過穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的3~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的3號試管即

含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎(chǔ)上再增加20%即為待標(biāo)記抗體蛋白的實(shí)際

用量，即穩(wěn)定膠體金的實(shí)際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加12μg抗體蛋白。

（2）膠體金標(biāo)記抗體程序

在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入

抗體12μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入DON單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%BSA使其

在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀

物用體積為初始膠體金體積1/10的金標(biāo)抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活

性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。

9

（3）膠體金標(biāo)記抗體的鑒定

將羊抗鼠二抗點(diǎn)樣于NC膜上，直接與金標(biāo)抗體作用，可見有明顯的粉紅色斑點(diǎn)，表明

金標(biāo)抗體有活性。

（三）膠體金免疫方法的建立

1、固相載體的選擇

（1）吸水墊的選擇

取厚度為2.59nm，質(zhì)地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后

5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。

（2）硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當(dāng)稀釋后通過點(diǎn)樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種

NC膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測試觀察樣品層析速度和檢測線顯色情

況，結(jié)果見表4。

表4NC膜點(diǎn)樣顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較??；＋，

表示著色淡或著色較深但與背景反差很?。唬?，表示沒有著色，或與背景色沒有反差，表5-表18同此注釋。

由表4可知，不同孔徑及廠家的NC膜點(diǎn)樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，milipore

135顯色最深，UnisartCN140和mdi70差別不大。

不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開速度和加樣5min后的檢測線顯色結(jié)果見表5。

表5NC膜層析顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

試劑展開速度慢較快快

5min后檢測線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表5可知，milipore135加入樣品后層析速度較慢，5min內(nèi)檢測線顯色最深，UnisartCN

140試劑展開速度較milipore135快，但不及mdi70。UnisartCN140與mdi70上檢測線顯色情

況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi

70更符合試紙條設(shè)計(jì)要求。

（3）金釋放墊的選擇

取6613和8964兩種金釋放墊，每墊分別加入5μL的金標(biāo)抗體后干燥，在陰性豆粕樣品中

測試觀察其結(jié)果（檢測線顯色程度以及5~8min金標(biāo)抗體的釋放程度）。結(jié)果見表6。

10

表6金釋放墊選擇結(jié)果

金釋放墊66138964

金標(biāo)抗體釋放情況釋放完全少量殘余

檢測線顯色情況＋＋＋＋＋

由表6可知，8964組裝的試紙條上檢測線較6613組裝的試紙條上檢測線顏色淺，檢測完

成后8964上有少量的金標(biāo)抗體殘余。故選擇6613作為金釋放墊。

（3）樣品墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條，各滴加100μL

的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對樣品的過濾、吸收，以及樣品在NC膜上的層析和檢測線顯

色情況，結(jié)果見表7。

表7樣品墊選擇結(jié)果

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況＋＋＋－＋

由表7可知，WFB對豆粕中各組分吸收能力非常差，作為樣品墊檢測豆粕時(shí)檢測線沒

有顯色。BX-SB06和QXLM都可以較大程度地吸收、過濾豆粕的蛋白等物質(zhì)，但QXLM對

于豆粕的層析速度的提高有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺；而BX-SB06層析速

度相對快速，檢測線顯色明顯。所以，選擇BX-SB06作為樣品墊。

2、層析條件的選擇

（1）包被稀釋液和包被條件的篩選

分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原DON半抗原-OVA做一定梯度稀釋，

在NC膜上點(diǎn)樣后烘干，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表8。

表8包被稀釋液篩選結(jié)果

包被原濃度包被液

（mg/mL）ABCD

0.025－＋－－

0.5＋＋＋－＋

1＋＋＋＋＋＋＋＋

2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表8可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結(jié)果有一定差異，其中包被稀釋液B

在稀釋至0.025mg/mL時(shí)，NC膜上點(diǎn)樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至

0.025mg/mL時(shí)，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液B作為實(shí)際用包被稀釋液。

11

用包被稀釋液B將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點(diǎn)樣后分別置于37℃烘干和室溫

（18~25℃）下自然干燥，時(shí)間設(shè)置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測陰性豆粕

樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表9。

表9包被條件篩選結(jié)果

包被時(shí)間

包被條件

30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表9可知，點(diǎn)樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被時(shí)

間差異不顯著。為減少外界因素對試驗(yàn)的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。

（2）封閉液和封閉條件的選擇

為減少NC膜對反應(yīng)的非特異性影響，采用封閉液對NC膜進(jìn)行封閉，分別用A、B、C、

D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測

陰性豆粕樣品，觀測膠體金在NC膜上的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表10。

表10封閉液篩選結(jié)果

封閉液ABCD

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表10可知，封閉液D封閉后得到的斑點(diǎn)顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點(diǎn)

顏色反差非常大，說明封閉液D封閉效果很好，將NC膜上的一些結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了封閉，使

金標(biāo)抗體不在NC膜上結(jié)合停留，除抗原點(diǎn)樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液

A封閉后得到的斑點(diǎn)顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點(diǎn)同背景的反

差。封閉液B、C封閉后得到的斑點(diǎn)顏色較淺。說明封閉液D的封閉效果比其他三種封閉液

封閉效果好。

包被抗原點(diǎn)樣后，用封閉液D以不同的封閉時(shí)間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫

（18~25℃）、37℃條件下進(jìn)行封閉，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上

的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表11。

表11封閉條件篩選結(jié)果

封閉時(shí)間30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表11可知，抗原點(diǎn)樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背

景較淺的斑點(diǎn)。為縮短試驗(yàn)時(shí)間、減少外界因素對試驗(yàn)的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉

2h。

12

（3）金標(biāo)抗體稀釋液和干燥條件的篩選

分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標(biāo)抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表12。

表12金標(biāo)抗體稀釋液篩選結(jié)果

金標(biāo)抗體稀釋液

稀釋倍數(shù)

ABCDE

1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:3＋＋＋－－＋

1:4＋－－－－

由表12可知，五種金標(biāo)抗體稀釋液顯色結(jié)果差異顯著，分析結(jié)果顯示經(jīng)稀釋液A稀釋1:4

的金標(biāo)抗體滴加到NC膜上時(shí)仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標(biāo)抗

體稀釋液A作為實(shí)際用金標(biāo)抗體稀釋液。

用稀釋液A將金標(biāo)抗體稀釋到1:2，取5μL涂布在金釋放墊上，分別置于室溫（18~25℃）、

37℃條件下干燥，時(shí)間設(shè)置為10min、20min、30min、60min、120min，觀察金釋放墊的干

燥度，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察金標(biāo)抗體釋放程度及檢測線的顯色情況，結(jié)果見

表13。

表13金標(biāo)抗體干燥條件篩選結(jié)果

干燥時(shí)間

干燥條件

10min20min30min60min120min

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表13可知，金釋放墊在37℃、室溫下干燥時(shí)間大于30min時(shí)檢測結(jié)果差異不顯著，為

減少外界因素對試驗(yàn)的影響，最終選擇37℃下干燥60min作為金釋放墊干燥條件。

（4）樣品墊展開劑的篩選

配制A、B、C、D、E五種不同展開劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到BX-SB06上，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，對比五種展開劑對膠體金層析速度、樣品流動(dòng)性的作用及顯

色情況。結(jié)果見表14。

表14樣品墊展開劑篩選結(jié)果

展開劑種類

ABCDE

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

13

層析速度

174182175163149

（樣本到達(dá)吸水墊的時(shí)間/s）

由表14可知，不同展開劑對樣品的流動(dòng)速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，

金標(biāo)抗體與C、T線有越充足的時(shí)間結(jié)合則顯色越深，不過展開劑A的層析速度較B快，但顯

色比B淺，這可能是由于A中加入的表面活性劑影響了DON抗原抗體的結(jié)合。綜合考慮層析

速度與顯色情況，選擇展開劑E作為樣品墊處理液適宜。

（5）C、T線包被濃度及線寬的確定

利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進(jìn)行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測，

測試結(jié)果顯示：二抗或抗原濃度太低時(shí)，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原

濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對比反差明顯，且對檢測靈敏度有顯著影響。通過不

斷對比試驗(yàn)，綜合考慮陰性顯色程度與陽性樣品添加測試，確定在層析材料上的抗原濃度為

0.2mg/mL，線寬為0.85μL/cm，二抗?jié)舛葹?.15mg/mL，線寬為1.0μL/cm。

（四）試紙條的組裝

試紙條的結(jié)構(gòu)如下所示：

加樣后的樣品流動(dòng)方向

圖5膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

注：1為樣品墊、2為金釋放墊、3為NC膜、4為吸水墊、5為檢測線、6為質(zhì)控線、7為PVC底板

樣品墊、金釋放墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，金釋放墊從起始端

起有1/3區(qū)域被樣品墊覆蓋，金釋放墊的末端與NC膜的始端相連，NC膜的末端與吸水墊的

始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；可將試紙條

組裝入帶有加樣孔和觀察窗的特制塑料盒中制成試紙卡。

（五）試紙條檢測過程的優(yōu)化

1、樣品提取方法的研究

在研制本方法的過程中，盡量簡化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡單、快速。對于

飼料原料樣品，一般需要簡單的過篩、粉碎過程。試驗(yàn)摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，

需加入提取液進(jìn)行提取，將提取后的上清液加入到稀釋液中，混勻后，點(diǎn)樣。具體試驗(yàn)過程

如下：

（1）樣品提取方式的選擇

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入提取

14

液6mL，選擇下述三種方式提取后，取200L上清液加入200L稀釋液混勻后進(jìn)行檢測，結(jié)

果見表15。

表15樣品提取方式的選擇

提取方式

C（渦動(dòng)3min，室溫

添加濃度A（渦動(dòng)3min，室溫B（室溫3000r/min以

3000r/min以上離心

靜置5min）上離心5min）

5min）

0mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

由表15可知，幾種方法處理后，當(dāng)樣品中含有DON標(biāo)準(zhǔn)品≥0.5mg/kg時(shí)，消線情況均良

好，但當(dāng)不加標(biāo)準(zhǔn)品或其濃度較低進(jìn)行陰性測定時(shí)，方法C處理后顯色最好且梯度明顯。方

法A未離心，使得上清液中含有少量的沉淀，影響跑線效果。方法B中沒有渦動(dòng)，導(dǎo)致樣品

與提取液不能充分混勻，提取效果較差。因此在樣品提取時(shí)，必須要渦動(dòng)足夠時(shí)間并低速離

心后吸取上清液進(jìn)行后續(xù)操作。

（2）樣品提取液的選擇

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，分別用水、

10%甲醇的水溶液、84%乙腈水作為提取液，各加入6mL，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離

心5min，取200L上清液加入200L稀釋液混勻后進(jìn)行檢測，結(jié)果見表16。

表16樣品提取液的選擇

提取液

添加濃度

水10%甲醇的水溶液84%乙腈水

0mg/kg＋＋＋＋＋＋—

0.1mg/kg＋＋＋＋—

0.2mg/kg＋＋—

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

由表16可知，當(dāng)提取液為84%乙腈水時(shí)跑不出線條，而用水和10%甲醇的水溶液提取后，

顯色結(jié)果差別不大，T線顯色深淺適中且梯度明顯。為方便現(xiàn)場快速檢測，實(shí)驗(yàn)中樣品提取

液直接選擇水。

（3）樣本稀釋液的選擇

15

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL

水，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心5min，按以下三種方案處理后檢測，結(jié)果見表17。

A：直接吸取上清液200L測定

B：取200L上清液加入200LPBS混勻后進(jìn)行檢測

C：取200L上清液加入200L0.01mol/LpH7.4PBS（10%甲醇，0.05%吐溫-20）混勻后

進(jìn)行檢測

表17樣本稀釋液的選擇

樣本稀釋液

添加濃度

ABC

0mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

通常樣品提取后含有一定的雜質(zhì)，影響跑線速度和特異性結(jié)合率，實(shí)驗(yàn)對比了不加稀釋

液和加兩種不同稀釋液的顯色情況，如表17所示顯色差別不是很大。可能是因?yàn)榍疤幚碇杏?/p>

水提取時(shí)水相充足，足以浸潤樣品中的蛋白，加之離心后使得上清液中基質(zhì)干擾少，所以可

以不加稀釋液直接吸取上清液測定，為方便現(xiàn)場快速檢測，最終選擇方案A。

2、顯色時(shí)間的研究

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)樣品前處理后，向樣品墊中加入100μL上清液，分別在反應(yīng)3min、5min、

8min、10min、15min后觀察結(jié)果，結(jié)果見表18。

表18顯色時(shí)間研究結(jié)果

顯色時(shí)間（min）

添加濃度

3581015

0mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.5mg/kg＋————

1.0mg/kg－————

由表18可知，顯色時(shí)間為3min時(shí)，NC膜上試劑展開不充分，T線顯色淺，顯色梯度不

明顯；顯色時(shí)間為5min、8min、10min、15min時(shí)，T線顯色無明顯差異，考慮到試劑展開的

16

充分性以及實(shí)驗(yàn)的快速性，選擇顯色時(shí)間為5min，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方

案。

由此可見，飼料原料樣品前處理方法及檢測過程為：試樣經(jīng)過篩、粉碎后，稱取

(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL水，渦動(dòng)3min，室溫3000r/min以上離心

5min，向樣品墊中加入100μL上清液，加樣后5min觀察結(jié)果。

（六）檢測方法技術(shù)參數(shù)的確定

1、檢測限

取空白小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各100份，按表19添加至

工作濃度，經(jīng)樣品前處理后進(jìn)行檢測，結(jié)果見表20。

表19添加樣品準(zhǔn)備

添加濃度

小麥大米黃豆玉米豆粕花生粕DDGS

（mg/kg）

020份20份20份20份20份20份20份

0.120份20份20份20份20份20份20份

0.220份20份20份20份20份20份20份

0.520份20份20份20份20份20份20份

1.020份20份20份20份20份20份20份

合計(jì)100份100份100份100份100份100份100份

表20檢測限確定

添加濃度

樣品測定結(jié)果

（mg/kg）

－－－－－－－－－－

0

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

0.1

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

小麥0.2

－－－－－－－－－－

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.5

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1.0

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

－－－－－－－－－－

0

大米－－－－－－－－－－

0.1－－－－－－－－－－

17

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

0.2

－－－－－－－－－－

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.5

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1.0

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

－－－－－－－－－－

0

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

0.1

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

黃豆