臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：第八章 酶免疫技術(shù)

第八章酶免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)

是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶的高效催化反應(yīng)的專一性相結(jié)合的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。酶免疫技術(shù)概念：能定性、定位、定量主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶結(jié)合物特點(diǎn)：免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性酶高效催化反應(yīng)的專一性基本原理

＋Ag

-Ab-E(Ag-E-Ab)

S顯色反應(yīng)Ag(Ab)定性、定量、定位分析基本原理Ab-E(Ag-E)

+

Ag(Ab)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法特點(diǎn)

標(biāo)記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉

一、酶和酶作用底物糖蛋白（主酶）：與酶活性無(wú)關(guān)亞鐵血紅素（輔基）：酶的活性基團(tuán)常用酶及底物1、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）來(lái)源：辣根分子量小(44KD)，易穿透細(xì)胞內(nèi)部；等電點(diǎn)pH7.2，63℃加熱15min穩(wěn)定；疊氮鈉、氰化物、氟化物、強(qiáng)酸可使HRP滅活。酶純度（RZ）=A403nm/A275nm≥3.0RZ值與酶活性無(wú)關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最廣的標(biāo)記酶DH2+H2O2→D+2H2OHRP供氫體底物：鄰苯二胺（OPD）：橙黃色→棕黃色492nm

四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：藍(lán)色→黃色，450nm

最常用

受氫體：

專一性高，過(guò)氧化物（H2O2，醇過(guò)氧化物，尿素過(guò)氧化物）HRP底物HRP常用的供氫體底物及其反應(yīng)產(chǎn)物供氫體底物反應(yīng)產(chǎn)物終止劑測(cè)讀波長(zhǎng)二氨基聯(lián)苯胺(diamido-benzidine,DAB)棕色、不溶性2mol/LHCL或H2SO4492nm聯(lián)苯胺(benzidine)藍(lán)色、不溶性450nm鄰苯二胺(o-phenylenediamin,OPD)黃色、可溶性同上492nm四甲基聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethyl-benzidine,TMB)藍(lán)色(黃色)、可溶性同上450nm5-氨基水楊酸(5-aminosalicylicacid,5-ASA)棕色、可溶性3mol/LNaOH550nmABTS(2,2-azino-bis(3-ethylbenzithiazoline-6-sulfonicacd)綠色、可溶性1%SDS405nm注：括號(hào)內(nèi)為終止后的顯色及測(cè)讀波長(zhǎng)堿性磷酸酶（ALP）：菌源性ALP（80KD,最適pH8.0）腸粘膜ALP(100KD,最適pH9.6）對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）→對(duì)硝基酚（黃色）→405nmALPELISA中禁止使用磷酸鹽緩沖液2、堿性磷酸酶（ALP）NaOH3、β–半乳糖苷酶（β-Gal）血標(biāo)本中缺乏，不易受內(nèi)源性酶的干擾，用于均相酶免疫測(cè)定4-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷（4MUG）→4MUβ-Gal360nm

激發(fā)光450nm熒光酶免疫技術(shù)的核心組成部分

二、酶標(biāo)記抗體或抗原酶結(jié)合物（conjugate）/酶標(biāo)記物：

通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

抗原要求純度高，抗原性完整

抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定，不形成聚合物制備方法要求直接法：酶分子中的多糖羥基被過(guò)碘酸鈉氧化為醛基后再與抗原或抗體分子的氨基結(jié)合

改良過(guò)碘酸鈉法

HRP標(biāo)記最常用的方法

交聯(lián)法：具有雙功能或多功能化學(xué)基團(tuán)的交聯(lián)劑為橋，分別與酶和抗體（抗原)結(jié)合。

戊二醛交聯(lián)法HRP、AP的標(biāo)記

制備方法酶結(jié)合物的純化葡聚糖凝膠G-200/G-150過(guò)柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶結(jié)合物的鑒定質(zhì)量鑒定：酶活性、抗體（抗原）的免疫活性酶標(biāo)記率的測(cè)定酶量：1mg/mlHRP/IgG：1.5~2.0酶的標(biāo)記率>0.3塑料：聚苯乙烯（最常用）(小珠、小試管、微量反應(yīng)板)

聚氯乙烯微粒：需特殊的儀器膜載體：硝酸纖維素膜、尼龍膜、玻璃纖維素膜固相抗體或抗原：把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面三、固相載體包被(coating)：將抗原或抗體結(jié)合于固相載體上的過(guò)程封閉(blocking)：用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異吸附。包被與封閉(pH9.6碳酸鹽緩沖液)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相

異相固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定

利用酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。一、均相酶免疫測(cè)定酶放大免疫分析技術(shù)（EMIT）

enzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、溶菌酶

注意點(diǎn)!1.Ag－E—Ab:酶活性↓（∵Ab的空間位阻，影響酶活性中心）2.游離酶(Ag-E)有酶活性EMITEMIT

基本原理:

＋

Ag(待測(cè)）競(jìng)爭(zhēng)

Ab（限量）Ag-E當(dāng)Ag多時(shí)Ag-Ab

(多)Ag-E

–Ab＋Ag-E(少)（多）酶活性↑S當(dāng)Ag少時(shí)Ag-Ab(少)Ag-E

–Ab＋Ag-E

(多)（少）酶活性↓酶活性與待測(cè)Ag含量呈正相關(guān)克隆酶供體免疫分析（CEDIA）

clonedenzymedonorimmunoassayβ-D-半乳糖苷酶CEDIA：注意點(diǎn)!2.形成Ag-ED—Ab時(shí)，Ab阻止ED與EA結(jié)合,酶活性↓

EAEDAgEDAg抗體活性酶1.酶EA(大)ED(小)

單獨(dú)無(wú)活性，結(jié)合為全酶方具活性

EAED

EAED3.結(jié)合力:Ag與Ab＞EA與EDCEDIA原理示意圖：

EA

EAED活性酶AgEDAg抗體EDAg抗體抗體AgAg

EACEDIA基本原理：Ag（待測(cè)）競(jìng)爭(zhēng)EAAbAg-ED（限量）Ag多Ag－Ab（多）＋

Ag-ED－

Ab（少）Ag-ED（多）EAAg-ED－EA（多）（酶活性↑）SAg少Ag－Ab（少）＋

Ag-ED－Ab（多）Ag-ED（少）

EAAg-ED－EA（少）（酶活性↓）S酶活性與待測(cè)Ag含量呈正相關(guān)分類：液相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定

與均相不同之處：需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物二、異相酶免疫測(cè)定

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

enzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）

一、基本原理二、方法類型及反應(yīng)原理三個(gè)必要試劑固相的抗原或抗體酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）酶反應(yīng)的底物

夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法ABS-ELISA雙抗體夾心法雙抗原夾心法三大基本方法1、雙抗體夾心法測(cè)抗原最常用的方法二價(jià)及二價(jià)以上的大分子抗原ELISA檢測(cè)抗原的方法1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測(cè)抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無(wú)抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYYEEEEEEEEELISA結(jié)果：陽(yáng)性陰性空白注意標(biāo)本中類風(fēng)濕因子的干擾2、雙位點(diǎn)一步法選擇針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同且空間距離較遠(yuǎn)的抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體鉤狀效應(yīng)（hookeffect）：雙位點(diǎn)一步法中，當(dāng)標(biāo)本中的待測(cè)抗原濃度過(guò)高時(shí)，過(guò)量的抗原可分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體結(jié)合而抑制夾心復(fù)合物的形成，顯色降低，使最終測(cè)定結(jié)果低于實(shí)際含量，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。洗滌洗滌3、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE測(cè)小分子抗原或半抗原EEEEEEEE1、間接法（最常用）原理：酶標(biāo)記的抗抗體（酶標(biāo)二抗）檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體酶標(biāo)抗人Ig測(cè)總抗體酶標(biāo)抗人IgG測(cè)IgG類抗體酶標(biāo)抗人IgM測(cè)IgM類抗體只需更換固相抗原，可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)標(biāo)本中多種針對(duì)不同抗原的抗體標(biāo)本需稀釋ELISA檢測(cè)抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無(wú)抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用的底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYYYYYYYEYYYYYYYY+EEEEEEEEE2、雙抗原夾心法反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同：以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。3、競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法

應(yīng)用：HBcAb、HBeAb的檢測(cè)YYYEYEYEY待測(cè)HBcAb酶標(biāo)HBcAb溫育、洗板YEYY溫育加入酶作用的底物YEYY顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中的HBcAb的含量成反比固相HBcAg競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)HBcAbEEEEEYYYEYEYEY待測(cè)HBeAb酶標(biāo)HBeAb溫育洗板加入酶作用的底物顯色的強(qiáng)弱與待測(cè)標(biāo)本中的HBeAb的含量成反比固相HBeAb競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)HBeAbYYY中和抗原HBeAgYYY溫育洗板YYYEYEY溫育YYYEYEYEEEEEEE4、捕獲法

測(cè)IgM類抗體常用于測(cè)定病原體急性感染診斷中的IgM型抗體抗人IgMμ鏈抗體樣本（IgM1、2）抗人IgMμ鏈抗體IgM1特異抗原（Ag1）抗人IgMμ鏈抗體抗人IgMμ鏈抗