(高清版)GBT 19180-2020 牛海綿狀腦病診斷技術(shù)

代替GB/T19180—2003國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T19180—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T19180—2003《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T19180—2003相比，除 增補(bǔ)了H·E組織病理染色法、免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法的適用范圍，刪除了“也可用于其他動(dòng)物的傳染性海綿狀腦病的診斷”(見第1章);組織病理染色法操作步驟(見5.1)和免疫組織化學(xué)方法操作步驟(見5.2);——增補(bǔ)了免疫印跡方法(見5.3)。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB/T19180—2003ⅡGB/T19180—2020牛海綿狀腦病(BovineSpongiformEncephalopathy,BSE)是由朊病毒引起的牛的一種慢性致死性神經(jīng)性疾病，對(duì)動(dòng)物和人構(gòu)成較大危害。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)將其歸為一類動(dòng)物疫病。我國(guó)現(xiàn)行《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180—2003)系2003年6月4日由原國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布，2003年12月1日起實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)僅包括臨床癥狀、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等三種診斷方法，未包括OIE陸生動(dòng)物手冊(cè)指定的另一種確診方法即免疫印跡。免疫印跡方法比免疫組織化學(xué)方法更靈敏，特異性更好。因此，免疫印跡方法是牛海綿狀腦病診斷技術(shù)中一種更好的確診方法，它能更好地服務(wù)于我國(guó)瘋牛病的監(jiān)測(cè)工作。BSE分為典型BSE和非典型BSE。典型BSE是由于牛采食污染牛羊朊病毒的肉骨粉或者飼料而引起，非典型BSE為自然發(fā)生的一種散發(fā)性BSE。自然條件下，BSE經(jīng)由消化道傳播，未發(fā)現(xiàn)水平和垂直傳播的證據(jù)。典型BSE的潛伏期一般為2年～8年，平均為4年～5年，多發(fā)于4～6歲的牛，2歲以下罕見，6歲以上明顯減少。根據(jù)病原的分子量大小，非典型BSE又分為H型和L型。非典型BSE的平均發(fā)病年齡為11歲。BSE病程多為數(shù)月至一年，最終死亡。大多數(shù)BSE病牛無典型臨床癥狀，因此BSE的診斷應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)。BSE的病原是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)朊蛋白的異構(gòu)體，在病牛血清里檢測(cè)不到BSE朊病毒抗體，所以血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于BSE來說是無意義的。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷方法多以檢測(cè)BSE病原為目的，包括免疫組織化學(xué)方法、免疫印跡方法、ELISA方法等，其中免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法是OIE手冊(cè)規(guī)定的BSE確診方法。BSE病牛的中樞神經(jīng)被朊病毒侵害會(huì)出現(xiàn)海綿狀空泡變性，在中樞神經(jīng)保存良好且未發(fā)生自溶的情況下，應(yīng)用H·E組織病理染色法可以觀察到這些病變情況。OIE手冊(cè)規(guī)定H·E組織病理染色法是確診BSE的輔助方法，在使用免疫組織化學(xué)方法診斷BSE時(shí)應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診；在使用免疫印跡方法診斷BSE時(shí)，如果樣品適合進(jìn)行H·E組織病理染色，那么也應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。1GB/T19180—2020牛海綿狀腦病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了BSE診斷的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷及綜合判定技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于BSE的診斷，其中臨床診斷適用于BSE的監(jiān)測(cè)和色法適用于BSE中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理診斷，免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法適用于BSE的病原學(xué)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BSE:牛海綿狀腦病(BovineSpongiformEncephalopathy)H·E:蘇木精伊紅(Hematoxylinandeosin)HRP:辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase)PBS:磷酸鹽緩沖溶液(Phosphatebufferedsolution)PK酶：蛋白酶K(ProteinasePVDF:聚偏氟乙烯(Polyvinylidenefluoride)SDS:十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate)TBST:等滲緩沖鹽溶液(Tris-HClbufferedsolutionwithTween)欄等。病牛的特征性臨床表現(xiàn)。2GB/T19180—20203.3病理變化剖檢無明顯病變。3.4結(jié)果判定易感動(dòng)物出現(xiàn)上述臨床癥狀，又不能確定為其他疾病時(shí)，可判定為疑似BSE。確診應(yīng)采集易感動(dòng)物的腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。4實(shí)驗(yàn)室診斷4.1H·E組織病理染色法4.1.1實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全Ⅱ級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。涉及有毒揮發(fā)性試劑的操作應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，通風(fēng)櫥。4.1.3.210%中性福爾馬林固定液(見附錄A中A.1)。4.1.3.4二甲苯。4.1.3.7硬蠟(熔點(diǎn)60℃)。4.1.3.8蘇木素染液(H·E染液，見A.2)。4.1.3.91%鹽酸酒精(見A.3)。4.1.3.10飽和碳酸鋰水溶液(見A.4)。4.1.3.1195%酒精伊紅溶液(見A.5)。將牛頭固定，用電鋸從前額兩牛角根部向枕骨大孔背側(cè)緣方向鋸開，使腦部暴露。剪開腦膜并切斷樣勺(國(guó)家牛海綿狀腦病參考實(shí)驗(yàn)室提供)從枕骨大孔處取出延腦部組織即可。采樣勺取樣時(shí)，先上下左右四個(gè)方向剪開腦硬膜，再用戴一次性乳膠手套的手指繞延腦轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)以切斷腦神經(jīng)和血管，然后緊貼顱腔壁插入采樣勺，插入深度約5cm～7cm。用力將采樣勺的手柄往上翹，再往下切斷腦組織，右切斷腦組織，最后將切下的腦組織往外摳出。3GB/T19180—2020將所有組織直接放入10倍體積的10%中性福爾馬林固定液中滲透固定96h,換新配制的固定液再固定48h?？鹕w。投入新配制的10倍體積的固定液再固定72h。將裝有組織塊的脫水筐移入98%甲酸中作用1h,自來水沖洗20min,然后再移入新配制固定液中處理3h。a)75%酒精浸泡2h。b)85%酒精浸泡2h。c)95%酒精I(xiàn)浸泡2h。f)100%酒精Ⅱ浸泡2h。4.1.6.5.1氯仿I浸泡2.5h或者二甲苯I浸泡40min。4.1.6.5.2氯仿Ⅱ浸泡3h或者二甲苯Ⅱ浸泡30min。依次在以下石蠟中浸蠟，溫度為60℃:a)軟蠟I浸泡40min。b)軟蠟Ⅱ浸泡1h。c)硬蠟浸泡1h?；男掠蚕灥谷氚衲＞呃?，直至倒?jié)M，然后將浸好蠟的組織塊放入其中(待切片的一面4GB/T19180—20204.1.6.7.2如果包埋模具為凹型的用于單個(gè)組織包埋的模具(常見包埋機(jī)所用模具),則先將模具加熱至70℃,放置在同樣溫度的金屬臺(tái)面上，然后滴滿熔化的新硬蠟，再將浸好蠟的組織塊放入其中(待切給每個(gè)組織塊貼上標(biāo)簽。應(yīng)焚燒處理。組織薄片用干凈的粘附劑預(yù)處理過的載玻片貼片(組織應(yīng)貼在磨砂面/標(biāo)記面的同側(cè)，以便給玻片做標(biāo)記),然后用鉛筆在載玻片上做好標(biāo)記。貼好組織薄片的載玻片先在自然條件下晾干，然后放入烘烤箱中50℃烘烤4h以上。a)二甲苯I10min。c)100%酒精I(xiàn)2min。e)95%酒精I(xiàn)2min。h)75%酒精2min。i)自來水洗2min。4.1.7.2.1蘇木素染液15min。4.1.7.2.31%鹽酸酒精10s。4.1.7.2.5飽和碳酸鋰水溶液30s。4.1.7.2.6自來水漂洗10min。4.1.7.2.775%酒精2min。4.1.7.2.885%酒精2min。4.1.7.2.995%酒精伊紅液1min。4.1.7.3.195%酒精2min。4.1.7.3.2100%酒精I(xiàn)2min。5GB/T19180—20204.1.7.3.3100%酒精Ⅱ2min。4.1.7.3.4二甲苯I2min。臺(tái)面上使其自然干燥。4.1.7.5.1分別在倍數(shù)為10×10、10×20和10×40的光學(xué)顯微鏡下觀察切片。4.1.7.5.2陽(yáng)性結(jié)果?；屹|(zhì)區(qū)出現(xiàn)空泡變性，特別是神經(jīng)纖維網(wǎng)漿和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)有規(guī)則的圓形或卵圓4.1.7.5.3陰性結(jié)果?；屹|(zhì)區(qū)無特征性空泡變性。注意區(qū)別。若在腦干灰質(zhì)區(qū)未發(fā)現(xiàn)雙側(cè)對(duì)稱性海綿狀空泡病變，見4.1.1。4.2.3.1蒸餾水。4.2.3.210%中性福爾馬林固定液(見A.1)。4.2.3.4二甲苯。4.2.3.6軟蠟(熔點(diǎn)56℃)。4.2.3.7硬蠟(熔點(diǎn)60℃)。4.2.3.8蛋白酶K緩沖液(見附錄B中B.1)。4.2.3.9蛋白酶K工作液(見B.2)。4.2.3.10高壓緩沖液(見B.3)。4.2.3.113%雙氧水-甲醇(見B.4,如果免疫組織化學(xué)顯色試劑盒中帶有類似的試劑，則使用試劑盒中4.2.3.120.1mol/LPBS(見B.5)。6GB/T19180—20204.2.3.135%正常豬血清(見B.6,如果免疫組織化學(xué)顯色試劑盒中帶有類似的試劑，則使用試劑盒中4.2.3.14Mayer氏蘇木素液(商品化產(chǎn)品)。4.2.3.17一抗(商品化產(chǎn)品)工作液(見B.7)。4.2.3.18無機(jī)試劑原料均為分析純。4.2.7.2脫蠟和脫二甲苯。取烘烤好的玻片和對(duì)照切片整齊放入染色架上，依次在以下試劑中脫蠟和a)二甲苯I10min。c)100%酒精I(xiàn)2min。e)95%酒精I(xiàn)2min。g)85%酒精2min。h)75%酒精2min。i)自來水洗2min。4.2.7.3從自來水中取出裝有玻片的染色架，在PBS中洗5min×3次。在洗第一次PBS的同時(shí)，配制適量的蛋白酶K緩沖液，并放入水浴鍋中預(yù)熱37℃。另外，取出冷凍的蛋白酶K母液使其化凍，以待用。4.2.7.4在最后一次PBS漂洗時(shí)，配制好蛋白酶K工作液。PBS洗完后，立即將玻片放入裝有蛋白酶K工作液的染色缸中，并確保玻片全部浸入液體，在37℃水浴中消化處理15min。與此同時(shí)，準(zhǔn)備好4.2.7.5將高壓緩沖液倒入陶瓷鍋，并立即將玻片放入其中，確保玻片完全浸入水中，蓋好盒蓋，在121℃(約103kPa)高壓處理20min,自然冷卻至60℃以下取出。4.2.7.6在PBS中洗5min×3次，洗最后一遍時(shí)配制好3%雙氧水甲醇溶液。4.2.7.7將玻片完全浸入3%雙氧水甲醇溶液中室溫處理5min。4.2.7.8在PBS中洗5min×3次。如果正常豬血清是冷凍的，則需要提前取出化凍，用前5min配制好。4.2.7.9在玻片的組織上滴滿5%正常豬血清，置濕盒中輕輕蓋上蓋子，室溫作用20min。同時(shí)，取出GB/T19180—20204.2.7.10棄去正常豬血清，用吸水紙吸干組織四周的液體。4.2.7.11將一抗工作液滴加在組織上，確保組織完全覆蓋，濕盒中37℃作用4h,或者在2℃~8℃下作用過夜。4.2.7.12在PBS中洗5min×3次，同時(shí)取出2℃~8℃下保存的免疫組織化學(xué)顯色試劑盒，使其回溫至室溫狀態(tài)。4.2.7.13洗完后用吸水紙吸干組織四周的液體，然后在組織上滴滿顯色試劑盒中的標(biāo)記聚合物-HRP4.2.7.14在PBS中洗5min×3次。4.2.7.15洗完后用吸水紙吸干組織四周的液體，然后在組織上滴滿試劑盒中的底物顯色液，確保組織完全覆蓋，濕盒中室溫作用5min～10min。4.2.7.16在蒸餾水中漂洗3min×3次。4.2.7.17將玻片放入Mayer氏蘇木素液復(fù)染作用1min。4.2.7.18在蒸餾水中漂洗5min。4.2.7.19用水溶性封片劑封片。4.2.8.1在陽(yáng)性和陰性對(duì)照片染色結(jié)果正確的情況下，分別在倍數(shù)為10×10、10×20和10×40的光學(xué)4.2.8.2陽(yáng)性結(jié)果：腦組織灰質(zhì)區(qū)特別是腦閂部的迷走神經(jīng)背核、孤束核和三叉神經(jīng)脊束核等處出現(xiàn)特異性顆粒狀染色，則判定為瘋牛病陽(yáng)性。4.3免疫印跡方法見4.1.1,但組織勻漿、消化及變性時(shí)需在負(fù)壓罩下操作。4.3.3.1蒸餾水。4.3.3.210道泳道的12%SDSNuPage膠(又稱預(yù)制膠，商品化產(chǎn)品)。4.3.3.3預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(商品化產(chǎn)品，應(yīng)含有15kDa～35kDa之間的蛋白條帶)。4.3.3.4勻漿緩沖液(見附錄C中C.1)。4.3.3.5蛋白酶K溶液(見C.2)。4.3.3.6消化阻止液(見C.3)。4.3.3.7上樣緩沖液(見C.4)。4.3.3.8電泳緩沖液(商品化產(chǎn)品，與12%SDSNuPage匹配)。78GB/T19180—20204.3.3.11轉(zhuǎn)印緩沖液(見C.6)。4.3.3.12封閉液(見C.7)。4.3.3.143MM濾紙。4.3.3.15一抗(商品化產(chǎn)品)工作液(見C.8)。4.3.3.16標(biāo)記HRP的兔抗鼠IgG(商品化產(chǎn)品)工作液(見C.9)。4.3.3.17化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(商品化產(chǎn)品)。4.3.3.18陽(yáng)性對(duì)照(見C.10)。4.3.3.19陰性對(duì)照(見C.11)。4.3.3.20無機(jī)試劑原料均為分析純。取100mg～130mg腦閂部組織放入1.5mL的專用勻漿管中，加入1.2mL勻漿緩沖液。用勻漿機(jī)以6200r/min的速度勻漿45sec。將勻漿好的樣品吸取到1.5mL離心管中，以7000g離心5min,然后將上清移至另一離心管中。中離心管蓋被熱氣體撐開，可以加一重物如鐵塊壓住蓋子。消化完后各加入3pL消化阻止液阻止蛋白水解反應(yīng)。端1/3處和電泳槽中的導(dǎo)熱絲(總共需要約400mL電泳緩沖液)。如果電泳儀與預(yù)制膠不匹配，則可以自行配制12%SDSPage膠，配方及操作可參見相關(guān)資料。9GB/T19180—2020液線以下部分。在膠上倒一點(diǎn)轉(zhuǎn)印緩沖液，使膠保持濕潤(rùn)。然后按照膠的大小，剪好PVDF膜及4張濾紙，PVDF膜應(yīng)比濾紙稍大。將PVDF膜放入100%甲醇中浸濕1min,之后將濾紙和膜放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡平衡15min。4.3.5.5.2在玻璃板上先放置兩層對(duì)齊的濾紙，用玻璃棒沿一個(gè)方向輕趕氣泡，用鏟刀將膠取出放于濾慢慢往另一端放下，直至完全覆蓋在膠上。如果發(fā)現(xiàn)膜與膠之間有白點(diǎn)，說明它們之間存在氣泡，則用轉(zhuǎn)印結(jié)束后，棄去膠和濾紙。觀察Marker轉(zhuǎn)印效率，如果膜上有清晰的Marker條帶，說明轉(zhuǎn)印效率良好，否則轉(zhuǎn)印失敗。將膜放入裝有封閉液的平皿中，確保膜完全(至少有蛋白的區(qū)域)浸沒，4℃作用過夜或者37℃作用1h。注意與膠接觸的一面朝上，以后的步驟都是這樣。封閉結(jié)束，置搖床上用TBST搖洗3次，每次5min。將膜放入一抗工作液中，確保膜完全浸沒，室溫下置搖床搖振孵育1.5h。作用完后，置搖床上用TBST搖洗6次，每次5min。將膜放入標(biāo)記HRP的兔抗鼠IgG工作液中，確保膜完全浸沒，室溫下置搖床搖振孵育1h。孵育40min后，打開化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行預(yù)熱。孵育完后，置搖床上用TBST搖洗6次，每次5min。按照化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒說明書配制好化學(xué)發(fā)光底物溶液(至少5mL),混合均勻。將膜放置在一按照5倍于膜的大小剪一塊保鮮膜，并將其展平放于桌上。底物作用完后，將膜取出。再將膜平放在保鮮膜中間位置，拿起保鮮膜的一邊，沿PVDF膜的一邊折起，覆蓋在PVDF膜上，再將周邊的保鮮膜稍微折疊，即可放入化學(xué)發(fā)光成像儀中或通過X光膠片曝光。一般情況曝光2min～3min即可。若4.3.6.1在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立的條件下，才可判定其余樣品的結(jié)果。4.3.6.2陽(yáng)性結(jié)果：曝光照片上的樣品泳道出現(xiàn)三條特異性黑色條帶，且對(duì)比膠上的蛋白質(zhì)Marker分析條帶大小在17ku～33ku之間，則判定為瘋牛病陽(yáng)性。4.3.6.3陰性結(jié)果：曝光照片上的樣品泳道沒有特異性黑色條帶，或者有個(gè)別雜條帶，但對(duì)比膠上的蛋白質(zhì)Marker分析條帶大小不在17ku～33ku之間，則判定為瘋牛病陰性。GB/T19180—20205綜合判定5.1臨床無明顯特征性癥狀或判定為疑似的易感動(dòng)物，經(jīng)4.2(免疫組織化學(xué)方法)或者4.3(免疫印跡方法)檢測(cè)出牛海綿狀腦病病原，則可判定為感染牛海綿狀腦病。5.2免疫組織化學(xué)方法診斷BSE時(shí)應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。5.3免疫印跡方法診斷BSE時(shí)，如果樣品適合進(jìn)行H·E組織病理染色，那么也應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。GB/T19180—2020(規(guī)范性附錄)H·E組織病理染色法試劑配制氯化鈉蒸餾水甲醛A.2蘇木素染色液A.2.1配方蘇木精無水乙醇蒸餾水氧化汞冰乙酸鉀明礬200mLA.2.2配法A.31%鹽酸酒精在100mL的70%或80%酒精中加入1mL的濃鹽酸。A.4飽和碳酸鋰水溶液A.595%酒精伊紅溶液伊紅0.5g加入100mL95%酒精中溶解。(規(guī)范性附錄)免疫組織化學(xué)方法試劑配制B.1蛋白酶K緩沖液鹽酸三羥甲基氨基甲烷(1mol/L,pH8.0)加蒸餾水至2.50.75mLmLmLB.2蛋白酶K工作液使用前在蛋白酶K緩沖液中加入17μL蛋白酶K母液(蒸餾水配制，濃度為14.7mg/mL),使其工B.3高壓緩沖液0.1mol/L檸檬酸鈉123mL0.1mol/L檸檬酸27mL煮沸的蒸餾水1350mL配制時(shí)，先將蒸餾水煮沸，然后加入0.1mol/L檸檬酸鈉和0.1mol/L檸檬酸混勻即可。B.43%雙氧水一甲醇(使用前5min配制)雙氧水(30%)50mL氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀 1.44gg加水800mL溶解，用濃鹽酸調(diào)pH值到7.4,加水至1L。B.65%正常豬血清0.1mol/LPBS(pH7.4)正常豬血清200μLB.7一抗工作液一抗為商品化的鼠抗牛朊蛋白單克隆抗體，用0.1mol/LPBS(pH7.4)稀釋單抗，使其工作濃度達(dá)GB/T19180—2020