蘆丁與彈性蛋白酶相互作用的研究

摘要天然產物蘆?。≧utin）可以抑制彈性蛋白酶的活性，采用多光譜法與分子對接技術研究蘆丁與彈性蛋白酶（PPE）的相互作用。研究結果表明，Rutin對PPE存在熒光猝滅效應，且為靜態(tài)猝滅。Rutin與PPE能形成1∶1復合物，在298

K下其結合常數(shù)為4.90×104

L/mol，主要結合力為氫鍵和范德華力。根據(jù)F?rster's非輻射能量轉移理論，計算得到Rutin與PPE的結合距離r為4.55

nm。紫外光譜與同步熒光光譜結果表明，Rutin可使PPE周圍微環(huán)境發(fā)生改變，極性增加、親水性增加和疏水性減弱。傅里葉變換紅外光譜與圓二色光譜分析表明，Rutin使PPE的α-螺旋、β-折疊含量降低，酶結構變得松散，改變了PPE的二級結構。分子對接模擬表明，Rutin與PPE距離在0.4nm之內的氨基酸殘基共有11個，共形成5條氫鍵，同時還有強大的范德華力與π-陽離子相互作用，多種作用力使Rutin與PPE形成穩(wěn)定的復合物，抑制了彈性蛋白酶的活性。引言目前，心腦血管疾病嚴重威脅著人類生命健康，已成為世界大多數(shù)國家三大死亡原因之一[1]，研究表明，炎癥反應、氧化應激等因素的持續(xù)性存在可導致患者引發(fā)心腦血管疾病，彈性蛋白酶（Elastase，PPE）是一種蛋白水解酶，其水解作用為持續(xù)性、破壞性的，該酶已成為抗炎藥物篩選的較佳酶靶。炎癥刺激會導致白細胞釋放彈性蛋白酶，彈性蛋白酶過度表達時會對機體組織、基質造成嚴重危害，表現(xiàn)為破壞血管中彈性蛋白，從而破壞血管，使組織液更容易滲出，繼而導致心腦血管疾病。早年常以天然產物蘆丁作為主要原料，制成藥物后應用于心腦血管類疾病的治療，蘆丁是一種天然黃酮類化合物，來源廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗血小板凝集、增加毛細血管韌性，保護心腦血管等多種藥理活性。蘆丁具有多個苯環(huán)、雜環(huán)結構和較長的共軛體系，以及多羥基結構，其結構如下圖。煙臺大學陳立平等[7]研究表明蘆丁對彈性蛋白酶有很好的抑制效果，按其實驗方法，天然產物蘆丁對彈性蛋白酶的抑制率可達50.68%。即可以抑制彈性蛋白酶活性，減少彈性蛋白酶對心腦血管的危害，從而保護心腦血管。對于在分子層面上解釋蛋白質與小分子的相互作用的研究，常采用光譜學手段與分子對接技術，如蘆丁與人血清白蛋白相互作用機制的研究，但蘆丁與彈性蛋白酶間的相互作用研究暫未見報道。為探究蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用機制以及構效關系，本文通過光譜法分析蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用的結合常數(shù)、結合位點、猝滅類型、作用力、作用距離、構象變化以及彈性蛋白酶與蘆丁之間的能量轉移。通過分子對接模擬了蘆丁與PPE的相互作用，對蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用機理作了初步探討，并為抗炎活性藥物——彈性蛋白酶抑制劑的研究提供參考。正文部分1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗方法1.2.1

熒光光譜與同步熒光光譜的測定1.2.2

紫外可見吸收光譜的測定1.2.3

傅里葉變換紅外光譜的測定1.2.4

圓二色光譜的測定1.2.5

分子對接模擬2

結果與討論2.1

Rutin與PPE的熒光猝滅光譜及機制圖1為298

K溫度下不同濃度的Rutin與一定濃度的PPE作用熒光發(fā)射光譜圖，PPE在激發(fā)波長280

nm處，發(fā)射波長336

nm處產生最大熒光發(fā)射峰。隨著Rutin濃度的逐漸增加，PPE的熒光強度逐漸下降，但發(fā)射峰的位置僅發(fā)生極微小變化，說明Rutin對PPE的熒光具有猝滅作用。2.2

Rutin與PPE作用的結合常數(shù)及結合位點數(shù)的計算2.3

Rutin與PPE熱力學參數(shù)與作用力類型判斷2.4

Rutin與PPE體系的能量轉移及結合距離的測定2.5

Rutin對PPE二級結構的影響2.5.1

Rutin對PPE作用的紫外光譜的分析在298K溫度下，測量在PPE中加入Rutin反應前后的紫外吸收光譜，如圖3所示。2.5.2

Rutin對PPE作用的同步熒光光譜的分析2.5.3

Rutin對PPE作用的紅外光譜的分析2.5.4

Rutin對PPE作用的圓二色光譜的分析2.5.5

PPE與Rutin的分子對接模擬3

結論結論本文研究了蘆丁與彈性蛋白酶的相互作用，由光譜研究結果得出結論，Rutin對PPE的熒光猝滅類型為靜態(tài)猝滅，結合比例為1∶1，結合距離為4.55nm，且發(fā)生非輻射能量轉移。根據(jù)熱力學方程計算，證明二者間發(fā)生作用，作用類型為自發(fā)、放熱過程，且主要為氫鍵及范德華力。通過紫外光譜、紅外光譜、同步熒光光譜分析，Rutin與PPE發(fā)生了相互作用，影響了PPE的周圍微環(huán)境，使極性增加、親水性增加和疏水性減弱，改變了PPE的二級結構。同時，圓二色光譜數(shù)據(jù)也表明，Rutin使PPE的α-螺旋及β-折疊降低，PPE結構更加松散。分子對接模擬中Rutin與PPE之間存在氫鍵作用、范德華力，這與光譜分析所得結論一致。氫鍵與Rutin的多羥基結構有關，Rutin較長的π-π共軛結構使得范德華作用力更加廣泛，此外