大果木姜子油SFE-CO2萃取工藝及其質(zhì)量評價方法研究

摘要優(yōu)化大果木姜子超臨界（SFE）-CO2萃取工藝，建立大果木姜子油基于指紋圖譜和化學(xué)模式識別的質(zhì)量評價方法。基于單因素實(shí)驗(yàn)，以大果木姜子油的萃取率為考察指標(biāo)，并結(jié)合響應(yīng)面法綜合優(yōu)化SFE-CO2萃取條件。采用Pntulips?QS-C18(4.6mm×250mm,

5μm)色譜柱，乙腈-0.4%乙酸為流動相，梯度洗脫，流速0.8mL/min，柱溫25℃，檢測波長240nm，建立大果木姜子油HPLC指紋圖譜，利用指紋圖譜相似度，以及主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）評價10批次大果木姜子油產(chǎn)品質(zhì)量。SFE-CO2最優(yōu)萃取條件為：萃取壓力15MPa，萃取溫度35℃，萃取時間64

min，分離釜I壓力14MPa。標(biāo)定大果木姜子油HPLC指紋圖譜中的15個共有特征峰，國家藥典委員會指紋圖譜評價系統(tǒng)得出各批產(chǎn)品指紋圖譜相似度為0.990以上，PCA對其質(zhì)量進(jìn)一步評價，聚類結(jié)果顯示10批樣本為一類，可見大果木姜子油萃取工藝穩(wěn)定可控。優(yōu)化得出大果木姜子SFE-CO2最佳萃取工藝參數(shù)，所建立的HPLC指紋圖譜可有效表征多批次大果木姜子油的質(zhì)量特征，為大果木姜子油的生產(chǎn)和質(zhì)量評價提供研究基礎(chǔ)。引言大果木姜子是樟科樟屬植物米槁（CinnamomummigaoH.W.Li）的干燥成熟果實(shí)，性味辛、溫，無毒，是一種苗族民間用藥。諸多研究表明其揮發(fā)油是大果木姜子藥理作用的主要成分之一，可用于保護(hù)心肌缺血、抗心率失常、抗房顫、抗缺氧、松弛內(nèi)臟平滑肌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛等。傳統(tǒng)提取揮發(fā)油的方法主要包括水蒸氣蒸餾法和溶劑萃取法，存在提取率低、提取時間長、熱敏成分易被破壞等缺點(diǎn)，而超臨界CO2萃取法（SFE-CO2）則有提取率高、生產(chǎn)周期短、不損壞熱敏性成分等優(yōu)勢。目前，已經(jīng)有SFE-CO2法用于大果木姜子油萃取的初步研究報道，但其提取工藝并未展開全面考察和深入研究，且缺乏有效的質(zhì)量評價手段；當(dāng)前多局限于化學(xué)成分的GC-MS定性分析，未涉及其指紋圖譜的建立和全面質(zhì)量評價。中藥指紋圖譜的建立旨在從整體上對復(fù)雜中藥物質(zhì)體系進(jìn)行研究和鑒別，由于其具有指紋特征分析、譜圖整體分析、宏觀推斷分析等優(yōu)勢，適合用于分析復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)組成的穩(wěn)定性。相似度評價作為一項(xiàng)已被國家藥典委員會確定的評價中藥指紋圖譜的重要指標(biāo)，可通過獲得的指紋圖譜，計算并評價各批次產(chǎn)品指紋圖譜間的整體相似度。本文基于單因素實(shí)驗(yàn)，以大果木姜子油萃取率為考察指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化SFE-CO2萃取條件，萃取10批大果木姜子油，建立HPLC指紋圖譜，基于指紋圖譜相似度和模式識別對其質(zhì)量進(jìn)行評價，為大果木姜子油的生產(chǎn)和質(zhì)量評價提供參考。

正文部分1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實(shí)驗(yàn)方法1.2.1

大果木姜子油的制備1.2.2

大果木姜子油的前處理1.2.3

高效液相色譜條件1.3

超臨界CO2萃取大果木姜子油的工藝優(yōu)化1.4

大果木姜子油的HPLC指紋圖譜的方法學(xué)考察1.4.1

精密度試驗(yàn)取同一批次的大果木姜子油供試品溶液，按照HPLC色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各共有特征峰相對保留時間RSD和相對峰面積RSD，評價儀器精密度。1.4.2

重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的大果木姜子油，按照供試品溶液的制備方法平行制備6份，依照HPLC色譜條件檢測，計算各共有特征峰相對保留時間RSD和相對峰面積RSD，評價測定方法的重復(fù)性。1.4.3

穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次大果木姜子油供試品溶液，依照HPLC色譜條件，于0、2、4、8、12、18、24h檢測，計算各共有色譜峰相對保留時間RSD和相對峰面積RSD，評價大果木姜子油供試品溶液的穩(wěn)定性。1.5

大果木姜子油HPLC指紋圖譜的評價采用指紋圖譜相似度、PCA評價10批大果木姜子油的產(chǎn)品質(zhì)量。2

結(jié)果與討論2.1

單因素分析2.1.1

粉碎粒徑對萃取效果的影響超臨界萃取過程中，粉碎粒徑的大小與CO2的接觸面積相關(guān)[18]。本文考察了不同粉碎粒徑（20、50、60、80目）對大果木姜子油萃取率的影響，結(jié)果如圖1所示。2.1.2

夾帶劑對萃取效果的影響2.1.3

萃取壓力對萃取效果的影響萃取壓力是影響超臨界CO2萃取的重要參數(shù)之一，對其的影響主要通過改變CO2的密度來實(shí)現(xiàn)。本文考察了不同萃取壓力（15、30、45、60MPa）對大果木姜子油萃取率的影響，結(jié)果如圖2所示。2.1.4

萃取溫度對萃取效果的影響萃取溫度是超臨界CO2萃取的另一個重要的影響因素，31.06℃是CO2超臨界狀態(tài)。因此，本文考察了不同萃取溫度（35、50、65、80℃）對大果木姜子油萃取率的影響，結(jié)果如圖3所示。2.1.5

萃取時間對萃取效果的影響本文在前期研究基礎(chǔ)上，考察了不同萃取時間（20、40、60、80、100min）對大果木姜子油萃取率的影響，結(jié)果如圖4所示。2.1.6

分離釜I的壓力對萃取效果的影響本文在前期研究基礎(chǔ)上，考察了不同分離釜I壓力（6、9、12、15、18MPa）對大果木姜子油萃取率的影響，結(jié)果如圖5所示。2.2

響應(yīng)面優(yōu)化超臨界流體萃取參數(shù)通過單因素分析，獲取了初步的優(yōu)化工藝參數(shù)；但考慮到實(shí)際工藝過程十分復(fù)雜，影響因素眾多，故在單因素分析結(jié)果基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化超臨界流體萃取參數(shù)。2.3

大果木姜子油HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察根據(jù)測定方法，對大果木姜子油HPLC指紋圖譜方法學(xué)進(jìn)行考察，以保留時間居中、響應(yīng)值高，分離度好的12號峰為參考峰，計算得到各共有特征峰的相對保留時間RSD和相對峰面積RSD，具體見表4。2.4

大果木姜子油HPLC指紋圖譜的建立與分析2.4.1

大果木姜子油HPLC指紋圖譜的建立根據(jù)供試品溶液制備方法，制備10批大果木姜子油供試品，依照指紋圖譜色譜條件，依次進(jìn)樣10μL，經(jīng)HPLC檢測，記錄HPLC色譜圖，結(jié)果見圖6。2.4.2

大果木姜子油指紋圖譜共有峰的選擇2.4.3

指紋圖譜相似度評價結(jié)果2.4.4

PCA評價結(jié)果PCA是通過線性變換的方式將多個變量轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)重要變量，并構(gòu)建成主成分因子，進(jìn)而可以體現(xiàn)樣本間的相似性。本文以10批大果木姜子油HPLC指紋圖譜的15個共有特征峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA13.0軟件，啟動PCA程序進(jìn)行分析，結(jié)果見圖7。3

結(jié)論結(jié)論本文以大果木姜子油萃取率為考察指標(biāo)，采用SFE-CO2萃取裝置對大果木姜子油進(jìn)行萃取，在單因素考察的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并得出最優(yōu)萃取條件為：萃取壓力15MPa，萃取溫度35℃，萃取時間64

min，分離釜I壓力14

MPa。通過對萃取的10批大果木姜子油進(jìn)行HPLC指紋圖譜研究，為大果木姜子的質(zhì)量控制提供了新方法