標記免疫反應定量分析技術常用類型

第三章

標記免疫反應定量分析技術常用類型第一節(jié)

放射性核素標記免疫分析技術1.1960年美國的Berson和Yalow將核技術與免疫學技術相結合建立了放射免疫分析法2.首先用于測定血漿胰島素濃度3.該法對醫(yī)學的巨大貢獻，1977年Yalow獲得了NobelPrize。Yalow

Berson

Radioimmunoassay（RIA）1、RIA原理同競爭法免疫反應，利用放射性核素標記抗原（*Ag）和待測抗原（Ag）與同一有限的特異性抗體（Ab）競爭性結合2、IRMA（Immunoradiometricassay）原理IRMA是將放射性核素標記在抗體(*Ab)上，待測抗原與過量的*Ab進行非競爭性免疫結合反應，形成抗原-標記抗體復合物*Ab-Ag及游離的*Ab。測定的對象是抗原-標記抗體復合物。待測抗原的濃度與Ag-*Ab的量呈正相關。IRMA最典型的反應模式是夾心法125I：為電子俘獲衰變，放出γ射線（35.5Kev）和特征X射線（27Kev）T1/2=60.2天有利于125I標記化合物的商品化，廣泛應用于體外放射分析中常用標記核素：125IRIA、IRMA基本操作五步驟

1、加樣

2、溫育

3、分離B與F4、測量樣品放射性

5、數(shù)據(jù)處理（標準曲線、查待測物含量）

1、雙抗體法；

2、聚乙二醇（PEG）法

3、固相分離法

基本試劑標準品（Ag）標記物抗體

分離劑常用的分離技術試劑盒聚乙二醇（PEG)沉淀法◆溶液中的蛋白質分子因表面因具有電荷層及水化層而不易沉淀?！舢敺磻簆H值處于γ球蛋白等電點時，加入適當濃度的聚乙二醇(PEG)

以其吸水作用使蛋白質脫水，致γ球蛋白(包括B)沉淀，從而使B與F分離?！?/p>

優(yōu)點：操作簡便、分離快、PEG來源容易、價格低廉?！?/p>

缺點：分離效果易受pH值、離子強度和溫度影響，非特異性結合較高。

特異性分離技術1、雙抗體法

用抗原免疫動物(一般是兔)產(chǎn)生相應抗體為第一抗體，再以第一抗體(兔γ球蛋白)免疫另一種動物(一般是綿羊)，所產(chǎn)生的抗體為第二抗體。優(yōu)點：分離較為完全，非特異結合低。缺點：第二抗體的結合反應需時較長。2、固相分離法

●將抗體或抗原聯(lián)結在固相載體上(如聚丙烯、聚乙烯制成的試管、纖維素顆粒等)，免疫反應在載體上完成，B依附其上，F(xiàn)溶于液體中，二者極易分離?！癖痉ú僮骱啽憧焖?、分離效果好。注意點：（1）試劑①標準品：是樣品定量的標準。稱量、稀釋不準及在儲存過程中的濃縮都可導致含量不準，使一批樣品的測定結果系統(tǒng)地偏高或偏低。②標記物：在儲存過程中可發(fā)生放射性核素脫落、輻射損傷和標準品免疫活性下降。標記物品質下降可使標準品、樣品的計數(shù)率都下降，NSB記數(shù)率升高，標準曲線斜率變小。③抗血清：在凍干狀態(tài)易保存，溶解后抗體效價會逐漸下降。若反復凍融、保存和使用不當，在室溫環(huán)境下放置過久，則抗體很容易失效。④分離劑：如以第二抗體作為分離劑，則二抗的質量、二抗與載體蛋白的比例、測定管中有無血清蛋白等都可影響沉淀物的形成并改變結合率。如用PEG作為分離劑，PEG的分子量、濃度、溫度等可影響分離效果。（2）加樣誤差：（對競爭法而言相對影響大些）（3）分離誤差

溫度與溫育時間的不同，離心后移去上清液的操作易引起誤差（4）測量誤差放射性測量儀器的準確性、計數(shù)效率、本底大小、有無污染、測定蛋白厚度、幾何位置及被測樣品的體積、計數(shù)誤差等都會有誤差（5）樣品的采集與制備樣品的處理和保存條件是否得當，是影響測定結果準確性的重要因素。①零標準管結合率（Bo%):標準抗原為零時標記抗原與抗體的結合率。要求30%～50%。反映標記物與抗體的質量。②非特異性結合率（NSB%）：不加抗體時標記抗原與非特異物質的結合率。要求＜5～10％。③ED25、ED50、ED75

：指標準曲線結合率在25%、50%和75%時對應的抗原濃度值，反映標準曲線穩(wěn)定性，有助于批間結果的比較。④標準曲線函數(shù)：標準曲線的截距、斜率要求穩(wěn)定，而相關系數(shù)要求其絕對值接近于1。標準曲線的可用部分斜率越大，靈敏度越高，但可測范圍相應變小。技術要求：

RIA和IRMA分析之比較RIAIRMA標記物抗原抗體用量限量過量反應模式競爭法免疫反應非競爭法免疫反應反應時間較慢較快分離技術PEG-雙抗體法固相吸附法測量范圍較窄較寬敏感度較低較高應用范圍常用于小分子半抗原常用于大分子抗原或抗體

其它體外放射分析法原理:是基于受體與配體的特異性結合的分析方法，其競爭結合原理與放射免疫分析相似。放射受體分析法優(yōu)點：①表達配體與受體間的生物活性而不是免疫活性，具有更高的特異性；②受體制劑的多用性：同一組織或細胞上有不同受體，因此某種組織的制劑可用多種配基作受體結合分析。缺點：

穩(wěn)定性差：受體不易保存，不耐熱，在制備和儲存過程中其結構容易發(fā)生改變。方法學評價1、優(yōu)點：①敏感度高，能測到μg/L，甚至ng/L或pg/L；②特異性強，與結構類似物質間的交叉反應少；③準確性、重復性、批間批內誤差能滿足臨床檢測要求2、不足：①放射性核素易衰變以及放射性標記物不穩(wěn)定，試劑的有效期短；②放射性核素易對環(huán)境和實驗室造成污染；③不能實現(xiàn)全自動化是以酶標記抗體或抗原的免疫檢測方法?！羲鼘⒖乖贵w結合的高特異性與酶促反應的高靈敏度有機結合起來，用酶標記抗體（抗原），檢測待測標本中未知抗原（抗體），當相應的抗原抗體特異性結合后，加入相應的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產(chǎn)物。第二節(jié)

酶標記免疫分析技術（Enzymeimmunoassay，EIA）雙抗體夾心法間接法競爭法捕獲法生物素-親和素法類型：1、優(yōu)點：標記簡單，操作簡單、快速、敏感性高、特異性強、實驗設備要求簡單、應用范圍廣泛、無放射性同位素污染等。2、不足：①酶分子量較大，標記抗原時易改變抗原分子空間結構，導致抗原分子失活；②可見光顯色反應決定了該方法可檢測范圍窄，限制了它的臨床應用范圍，目前主要應用于定性分析；③因反應體系為固相，結果重復性較差，在競爭法中尤為明顯方法學評價化學發(fā)光免疫分析（ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA）是將化學發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應相結合，用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術?；瘜W發(fā)光：是指物質在進行化學反應過程中伴隨的一種光輻射現(xiàn)象，其機制為某些化合物（發(fā)光劑或發(fā)光底物）利用化學反應能使其產(chǎn)物分子或反應中間態(tài)分子處于激發(fā)態(tài)狀態(tài)，當回歸至基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放能量（即發(fā)光，Luminescence）。第三節(jié)

化學發(fā)光標記免疫分析技術以發(fā)光物質作為標記物，標記抗原或抗體

化學發(fā)光免疫分析法

其基本原理同RIA和IRMA,采用雙抗體夾心法(或雙抗原夾心法)、競爭法反應模式按化學反應類型化學發(fā)光的分類酶促化學發(fā)光：辣根過氧化物酶系統(tǒng)堿性磷酸酶系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學發(fā)光：

吖啶酯系統(tǒng)草酸酯系統(tǒng)三價鐵-魯米諾系統(tǒng)按發(fā)光持續(xù)時間發(fā)光時間在數(shù)十分鐘以上，如：

HRP-Luminol系統(tǒng)

AP-AMPPD系統(tǒng)黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)無須原位進樣、以速率法測量。發(fā)光時間在數(shù)秒內，如吖啶酯以原位進樣(InSituInjector)和時間積分法測量輝光（Glow）:閃光（Flash）:【化學發(fā)光免疫分析種類】1、直接化學發(fā)光A吖啶酯發(fā)光（分子量：590）原理：納米磁珠分離后的吖啶酯標記的抗原抗體復合物，在含H2O2的強酸、強堿激發(fā)底物的作用下，快速發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關系。特點：發(fā)光過程在5秒內完成，激發(fā)發(fā)光程序簡單，測試速度快，背景噪聲低，但發(fā)光標記物吖啶酯在緩沖液中不穩(wěn)定，易水解，影響試劑穩(wěn)定性。代表儀器：Abbott公司i2000SR。B異魯米諾發(fā)光

（分子量：177）原理：發(fā)光過程和原理與吖啶酯完全相同，但激發(fā)發(fā)光速度更快，在3秒內完成整個過程，測試速度最快，而且克服了吖啶酯在緩沖液不穩(wěn)定、易水解的缺點。代表儀器：德國Byk–Sangtec公司的LIAISON,深圳新產(chǎn)業(yè)公司C電化學發(fā)光原理：納米磁珠分離后的三聯(lián)吡啶釕（分子量：748）標記的抗原抗體復合物，在三丙胺的作用下，發(fā)生氧化還原反應，發(fā)出可見光，通過光電倍增管進行光子計數(shù)，相對光強度RLU與待測抗原濃度成函數(shù)關系。特點：激發(fā)發(fā)光過程復雜，持續(xù)時間長，每一個發(fā)光過程約需25秒，發(fā)光穩(wěn)定，測試速度較慢。代表儀器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS411和610。1、靈敏度高：這是CLIA關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達10-16mol/L（RIA為10-12mol/L）。2、寬的線性動力學范圍：發(fā)光強度在4～6個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系(優(yōu)勢明顯)3、光信號強而穩(wěn)定：背景噪音低4、可實現(xiàn)全自動化：簡化了實驗操作及測量，檢測速度快，結果穩(wěn)定，誤差??；5、試劑穩(wěn)定性、安全性好：試劑有效期長，可達一年；6、分離效果好：為納米級磁粉，除增大包被面積、加快反應外，亦可使清洗及分離更簡易、快捷；7、標記物理想：分子量小，對被標記抗原或抗體的分子空間結構影響??；化學反應簡單、快速，無需催化劑方法學評價2、酶促化學發(fā)光(CLEIA)原理：酶促化學發(fā)光一般是將堿性磷酸酶分子量（56KD）標記在抗體或抗原上，納米磁珠分離后的堿酶標記的抗原、抗體復合物在發(fā)光底物AMPPD作用下，持續(xù)發(fā)出可見光，通過光電倍增管讀取光信號。發(fā)光特點：代表儀器：美國貝克曼公司的DxI800。1、優(yōu)秀的靈敏度：經(jīng)過酶和發(fā)光兩級放大；2、寬的線性動力學范圍；2、試劑穩(wěn)定，試劑效期、開瓶效期和定標周期較長；3、可實現(xiàn)全自動化，重復性；4、試劑價格高，開發(fā)周期長，項目少；5、激發(fā)發(fā)光時間長，測試速度慢；因酶易受環(huán)境溫度的影

響，試劑的穩(wěn)定性不如直接化學發(fā)光好；6、酶標抗體或酶標抗原因非特異性吸附而易產(chǎn)生較高本底，

如血清標本含纖維蛋白、血漿標本含血小板等，實驗評價

時應充分注意；7、若標本中含有影響標記酶活性的物質，會影響結果測定方法學評價全自動化學發(fā)光免疫分析儀1、樣本盤2、試劑盤3、溫育反應系統(tǒng)4、固相載體分離清洗系統(tǒng)5、信號檢測系統(tǒng)6、計算機控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（與LIS相連）光電倍增管高壓高速放大器高速比較器高速分頻器發(fā)光樣品產(chǎn)生光子激發(fā)光陰極產(chǎn)生光電子在陽極上形成較強信號脈沖信號相對發(fā)光單位數(shù)字脈沖(RLU)在各打拿極之間得到能量和數(shù)目的倍增單光子計數(shù)器發(fā)光分析儀的核心部件高靈敏度分類基本原理標記物底物特點直接化學發(fā)光免疫分析用電化學發(fā)光劑（吖啶脂）直接標記抗體（抗原），與待測標本中的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，在H2O2和NaOH作用下，吖啶脂分解發(fā)光，發(fā)光量與抗原量成正比吖啶酯等H2O2，NaOH發(fā)光速度較快，反應體系簡單；化學發(fā)光劑比酶類標記物更穩(wěn)定，不受酸堿和溫度影響，試劑保存期更長化學發(fā)光酶免疫分析酶標記抗體（抗原），與待測樣本中相應抗原發(fā)生免疫反應，之后將化學發(fā)光劑作為反應底物，在酶的催化下發(fā)射光信號堿性磷酸酶AMPPD，魯米諾發(fā)光劑酶類催化底物，發(fā)光速度略慢；易受酸堿度和溫度影響。電化學發(fā)光免疫分析該方法是以電化學發(fā)光劑標記抗體（抗原），在電場中轉移電子而發(fā)生特異化性化學發(fā)光反應三聯(lián)吡啶釕三苯胺包含電化學和化學發(fā)光兩個過程，較復雜，發(fā)光連續(xù)；有交叉反應，攜帶污染風險化學發(fā)光免疫分析法比較

鑭系元素中的銪（Eu）、釤（Sm）、鋱te（Tb）、鏑di（Dy）、鈮(Nb)能發(fā)射離子熒光，標記蛋白質多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞，在紫外光激發(fā)下，產(chǎn)生持續(xù)一定時間、一定光峰的熒光。其它非特異熒光壽命很短，待其衰減后，用特別的TRF儀測定最后產(chǎn)物中鑭系元素的特異熒光強度，根據(jù)熒光強度比值來判斷反應體系中被分析物質的濃度，達到定量分析的目的。時間分辨熒光分析法體外標記免疫分析臨床應用

體外分析測定:蛋白質、激素、

藥物、

腫瘤標志物、

病毒抗原等穩(wěn)定性核素標記技術在臨床中的運用13C呼氣試驗尿素13C呼氣試驗（UBT）是最快速、最便宜的確認幽門螺旋桿菌（HP）感染的非創(chuàng)傷性試驗，是目前全球公認的抗HP治療后HP是否根除的最為準確的方法，無需胃鏡復查。其敏感性和特異性分別高達90-95%和95-98%。同位素13C無放射性，安全準確，無交叉感染，對環(huán)境無污染。原理：正常人胃內沒有尿素酶，不能分解尿素，如果感染HP，則HP能分泌尿素酶，把帶示蹤標記（13C）的尿素分解成NH3和13CO2，收集肺排出的13CO2進行檢測就能判斷是否感染HP

質譜儀工作原理以離子源、質量分析器和離子檢測器為核心。離子源是使試樣分子在高真空條件下離子化的裝置。電離后的分子因接受了過多的能量會進一步碎裂成較小質量的多種碎片離子和中性粒子。它們在加速電場作用下獲取具有相同能量的平均動能而進入質量分析器。質量分析器是將同時進入其中的不同質量的離子，按質荷比離子依次進入離子檢測器，采集放大離子信號，經(jīng)計算機處理，繪制成質譜圖幾種標記/檢測技術靈敏度的比較酶標熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9幾種標記/檢測技術線性范圍的比較酶標熒光放免發(fā)光線性范圍105104103102幾種標記/檢測試劑的有效期比較酶標熒光放免發(fā)光有效期（月）1815129630超微量分析（成也蕭何敗也蕭何）間接測量難以標準化統(tǒng)一的標準物質缺乏抗原、抗體不統(tǒng)一檢驗前、后難標準化方法學不統(tǒng)一標記免疫檢測的不足核醫(yī)學檢驗質量控制體系質量控制(qualitycontrol，QC)

是保證從臨床醫(yī)生開出醫(yī)囑起到發(fā)出報告為止的全過程中能及時發(fā)現(xiàn)檢測過程中出現(xiàn)的各種誤差（隨機誤差和系統(tǒng)誤差），分析產(chǎn)生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測質量質量控制包括以下活動：1、通過室內質控評價檢測系統(tǒng)是否穩(wěn)定2、對新的分析方法進行對比實驗3、室間質量評價4、儀器維護、校準和功能檢查5、技術文件、標準的應用1、檢驗項目的申請2、患者準備3、標本的采集、傳送與保存**需要臨床科室配合晝夜節(jié)律性：F、ALD、瘦素、GH、腎素、I