人工血管管壁涂層生物材料的生物相容性評價

人工血管管壁涂層生物材料的生物相容性評價【摘要】對人工血管管壁涂層的生物材料進(jìn)行生物相容性的實(shí)驗(yàn)評價。按照國際標(biāo)準(zhǔn)，對相關(guān)單個和混合材料進(jìn)行急性全身毒性試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)和細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明：本實(shí)驗(yàn)涉及的生物材料膠原蛋白、聚乳酸以及混合組分材料均符合生物相容性評價實(shí)驗(yàn)的安全標(biāo)準(zhǔn)。說明膠原蛋白和聚乳酸作為復(fù)合型人工血管管壁涂層材料具有生物相容性和安全性，可為臨床產(chǎn)品的研制提供依據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】人工血管涂層材料；生物材料；生物相容性；膠原蛋白；聚乳酸Abstract：Tomakeevaluationfarbiocompatibilityofthematerialswhichiscoveredonthevascularprosthesissurface.Withtheinternationalstandardizations，someexperimentsforthematerialsweredone，includeacutesystemictoxicitytest，pyrogentest，hemolysistestandcytotoxicitytest.Resultsshowedthatthecollagenprotein，L-polylacticacidandthemixedmaterialswereallconsistentwiththesafetycontrol.ItprovesthatthecollagenproteinandL-polylacticacidarewithbiocompatibiliyandsafetyforcoatingonthesurfaceofvascularprosthesis.Keywords：Converageofvascularprosthesis;Biomaterial;Biocompatibility;Collagenprotein;L-polylacticacid1引言人工血管主要與血液接觸，因此生物材料的血液相容性是最關(guān)鍵的問題。另外，蛋白質(zhì)［1］、粒-單系細(xì)胞［2］、補(bǔ)體和細(xì)胞因子［3］等對于生物材料的相容性也有一定程度的影響。表面特性對于接觸血液形成血栓的影響最為關(guān)鍵，例如外形、表面粗糙程度、可濕性、親水性等［4］。此外，血液的流態(tài)影響也是血栓形成的一個方面。尋找兩個方面彼此適應(yīng)的契合點(diǎn)被認(rèn)為是最好的解決方法。因此，表面涂層技術(shù)被運(yùn)用于改善人工血管的生物相容性。將材料表面覆蓋上一層其他生物相容性好的物質(zhì)，將材料與體液環(huán)境分隔開，避免接觸，從而達(dá)到減少甚至避免排斥反應(yīng)。2試驗(yàn)方法試驗(yàn)所有標(biāo)準(zhǔn)均符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價》GB/T16886.1―1997國家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定。膠原蛋白由黑龍江衛(wèi)世醫(yī)藥有限公司提供，L?簿廴樗嵊杉媚轄”?開元生物材料有限公司提供。混合材料制備方法：將液狀膠原蛋白與聚乳酸等體積混合，充分均勻攪拌，置4℃冰箱中凝固成固體狀備用。2.1急性全身毒性試驗(yàn)2.1.1試驗(yàn)原理將試驗(yàn)材料或材料浸提液通過動物靜脈或腹腔注射到動物體內(nèi)，觀察動物的生物學(xué)反應(yīng)，以判定材料的急性毒性作用。2.1.2材料浸提液將受試材料制成20mm×10mm、厚1mm的立方體長條薄片。按照浸提介質(zhì)：試樣表面積=1m1：3cm2制成，浸提介質(zhì)為0.9%生理鹽水，浸提條件為37℃，72h。0.22um的微孔濾器滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｊ幮詫φ詹捎?.9%生理鹽水。2.1.3實(shí)驗(yàn)動物選取體重20～27g的健康昆明系小鼠，雌雄分籠同養(yǎng)，分六個實(shí)驗(yàn)組，每組5只。2.1.4實(shí)驗(yàn)方法（1）浸提液及陰性對照液，置于37℃恒溫水浴箱中復(fù)溫。（2）將浸提液以及對照液按50ml/kg劑量由小鼠尾靜脈緩慢注入。2.1.5評價方法記錄注射后實(shí)驗(yàn)動物在24h，48h，72h的體重變化，觀察其一般狀態(tài)、毒性表現(xiàn)及死亡情況。材料毒性程度根據(jù)中毒癥狀分為無毒、輕度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用t檢驗(yàn)。2.2熱源試驗(yàn)2.2.1試驗(yàn)原理將材料浸提液由耳緣靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)觀察家兔體溫升高情況，以判斷浸提液中所含熱源的限度是否符合規(guī)定。2.2.2材料浸提液將材料制成10mm×20mm、厚1mm方形薄片。按浸提介質(zhì)：試樣表面積=lml：3cm2制成，浸提介質(zhì)為0.9%生理鹽水，浸提條件為37℃，72h。0.22um的微孔濾器滅菌。陰性對照采用0.9%生理鹽水。2.2.3實(shí)驗(yàn)動物健康新西蘭大白兔，2.3～2.8kg，雌雄不限，3只為一實(shí)驗(yàn)組。2.2.4實(shí)驗(yàn)方法(1)將肛門體溫計(jì)插入家兔肛門，深度約6cm，時間約3min；試驗(yàn)前禁食2h，間隔30min分別測3次體溫，取其平均值為正常體溫值。(2)材料浸提液37℃恒溫箱預(yù)熱后，沿耳緣靜脈緩慢注入，劑量為10ml/kg。(3)注射后每隔lh測量1次，共測3次，以3次中體溫最高值減去正常體溫，即為體溫升高度數(shù)。2.2.5評價標(biāo)準(zhǔn)如果每一實(shí)驗(yàn)組體溫升高均在0.6℃以下，且體溫升高總數(shù)在1.4℃以下，可認(rèn)為試驗(yàn)材料浸提液符合熱源檢查要求；如每一實(shí)驗(yàn)組中體溫升高≥0.6℃的動物數(shù)超過1只，或在復(fù)試的3只兔中，體溫升高≥0.6℃動物數(shù)仍有1只或以上；或初、復(fù)試體溫升高總數(shù)超過3.5℃，則認(rèn)為材料浸提液不符合熱源檢查要求。2.3溶血試驗(yàn)2.3.1試驗(yàn)原理通過試樣材料或其浸提液在體外與動物血液直接接觸，根據(jù)測定紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白量來評價該材料是否對紅細(xì)胞的功能和代謝造成不良影響，對材料是否具有溶血反應(yīng)進(jìn)行客觀評價。2.3.2實(shí)驗(yàn)動物及材料健康新西蘭兔1只，體重2.57kg。陰性對照采用0.9%生理鹽水，陽性對照采用蒸餾水。2.3.3實(shí)驗(yàn)方法(1)將試樣材料制成2.5cm×2cm小條狀，置于生理鹽水40ml中，置37℃恒溫水浴箱中保溫30min。（2）試樣組、陽性、陰性對照組各設(shè)平行樣品試管5個，每管加相應(yīng)浸提液4ml。(3)將肝素一支（12500U）溶于50ml生理鹽水中，使用時按照1ml血配25U肝素的比例使用。（4）心臟采兔血20m1，加入2%肝素1ml，制成新鮮抗凝血，然后按新鮮抗凝血：生理鹽水=4：5的比例制成稀釋兔血。(5)每試管加稀釋兔血0.2m1，混勻，37℃恒溫水浴箱保溫60min。（6）所有試管經(jīng)1500rpm，離心5min，取上清在545nm波長測其吸光度。2.3.4評價方法溶血率(%)=(試樣組吸光度一陰性組吸光度)/(陽性組吸光度一陰性組吸光度)×100%。評判標(biāo)準(zhǔn)：陰性對照管吸光度＜0.03，陽性對照管吸光度為0.8±0.30時實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效，當(dāng)溶血率≤5%時，可判斷該材料不具溶血作用。2.4細(xì)胞毒性試驗(yàn)2.4.1試驗(yàn)原理利用細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法來評價醫(yī)用材料及裝置或其浸提液可濾出成分中潛在性的細(xì)胞毒性。2.4.2實(shí)驗(yàn)方法(1)細(xì)胞形態(tài)觀察法將不同受試材料以及陽性、陰性參照材料分別置于培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入5×104/ml的L-929細(xì)胞懸液3m1于培養(yǎng)皿內(nèi)，每組設(shè)平行樣品5個，加入新鮮培養(yǎng)液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中定時通過倒置顯微鏡觀察受試材料表面及邊緣的細(xì)胞，根據(jù)其形態(tài)和生長狀況把毒性分級分為無毒，輕度、中度、重度毒性。(2)MTT比色法取96孔培養(yǎng)板，加入5×104/mlL-929細(xì)胞懸液100u1/孔，開放培養(yǎng)。24h后，每孔加入試樣浸提液100ul，空白對照組加入100ul新鮮培養(yǎng)液。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別連續(xù)培養(yǎng)2d、4d和7d。觀察時，每孔加入MTT(5mg/ml)50u1，繼續(xù)培養(yǎng)至6h后，棄原培養(yǎng)液，加入DMSO150u1/孔，室溫輕度振蕩15min。使用酶聯(lián)免疫測定儀測試其吸光度值。測試波長為490nm，參考波長為550nm。計(jì)算細(xì)胞相對增值率(relativegrowthrate，RGR)=實(shí)驗(yàn)組吸光度均值/空白對照組吸光度均值)×100%。然后根據(jù)6級毒性評分標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換成毒性分級(0-5級)：大于100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0為5級。3試驗(yàn)結(jié)果3.1急性全身毒性試驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)小鼠均無死亡，活動、進(jìn)食及大小便均正常，精神狀態(tài)良好，無驚厥、抽搐、癱瘓、呼吸抑制等毒性反應(yīng)。不同觀察時間內(nèi)動物體重均有一定程度的增加，但是在正常范圍之內(nèi)（見表1）。結(jié)果陰性對照組比較未見明顯差異(P＞0.05)，表明兩種受試材料均屬無毒級生物材料。表1急性全身毒性試驗(yàn)小鼠體重增加結(jié)果3.2熱源試驗(yàn)結(jié)果見表2。各試驗(yàn)組動物注射材料浸提液后，體溫升高均在0.6℃以下，且溫度升高總數(shù)在1.4℃以下，符合熱源檢測有關(guān)規(guī)定，表明受試材料及其浸提液不含致熱源物質(zhì)，材料植入體內(nèi)后無熱源作用。表2人工血管涂層材料試樣熱源試驗(yàn)結(jié)果3.3溶血試驗(yàn)結(jié)果見表3。本實(shí)驗(yàn)中，試樣管離心后上層均為清亮無色液體，下層為紅細(xì)胞沉淀物，涂片鏡檢未見紅細(xì)胞破裂或凝聚。陰性對照管的吸光度小于0.03，陽性對照管吸光度在0.8±0.3范圍內(nèi)，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)非直接接觸血液的醫(yī)用生物材料性能測試所提出的溶血率小于5%標(biāo)準(zhǔn)，判定兩種受試材料體外試驗(yàn)不引起溶血反應(yīng)。表3人工血管涂層材料試樣溶血試驗(yàn)結(jié)果3.4細(xì)胞毒性試驗(yàn)3.4.1細(xì)胞形態(tài)觀察見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5。3.4.2MTT法試樣材料MTT法檢測結(jié)果見表4、表5、表6。表4MTT法培養(yǎng)2天的試驗(yàn)結(jié)果表5MTT法培養(yǎng)4天的試驗(yàn)結(jié)果表6MTT法培養(yǎng)7天的試驗(yàn)結(jié)果4討論急性全身毒性試驗(yàn)是一種非特異性急性毒性試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腹腔注射途徑，結(jié)果顯示，72h內(nèi)所有實(shí)驗(yàn)組小鼠均無死亡，活動正常，精神狀態(tài)良好，沒有毒性反應(yīng)。與陰性對照組比較沒有明顯差異（P＞0.05)，表明兩種材料均屬無毒級的生物材料，而且材料混合后也沒有產(chǎn)生另外的毒性物質(zhì)，符合生物材料的安全性標(biāo)準(zhǔn)。生物材料在制備過程中可能殘留的單體、輔助添加劑或被內(nèi)毒素污染等都會含有致熱源物質(zhì)，在植入體內(nèi)后會引起恒溫動物體溫的異常上升。熱源試驗(yàn)［5］過程中應(yīng)該盡量杜絕室溫，注射液溫度，驚嚇等影響因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種材料均不含致熱源物質(zhì)；并且組份材料混合后也未產(chǎn)生新的致熱源物質(zhì)。溶血試驗(yàn)［6］可以作為體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的一個重要補(bǔ)充。如果材料有溶血作用，則提示材料可能具有細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，陰性對照管的吸光度小于0.03，陽性對照管吸光度在0.8士0.3范圍內(nèi)，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。兩種材料溶血率分別為0.20%、0.18%，混合材料組的溶血率為0.15%，均符合醫(yī)用生物材料的應(yīng)用要求?？梢哉J(rèn)為這兩種材料沒有溶血作用。細(xì)胞毒性是指利用生物材料及其浸提液與細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法來評價醫(yī)用材料及裝置或其浸提液可濾出成分中潛在性的細(xì)胞毒性。目前，幾乎所有的生物材料都必須通過相關(guān)試驗(yàn)檢測其是否具有細(xì)胞毒性。聚全氟乙丙烯是已知并通過實(shí)驗(yàn)論證的無毒聚合材料，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療用品的生產(chǎn)制備，本實(shí)驗(yàn)作為陰性對照材料；聚氯乙烯則為已知有毒材料，本實(shí)驗(yàn)用作陽性對照材料。從圖1～5可以看出，兩種材料以及混合材料組的細(xì)胞形態(tài)均正常，貼壁生長良好，與陰性對照組無明顯差別；而陽性對照組中大部分細(xì)胞變成圓形，胞核固縮，凋亡細(xì)胞明顯增多，材料表面細(xì)胞稀少，基本不貼壁。根據(jù)已知的細(xì)胞形態(tài)分析標(biāo)準(zhǔn)，人工血管兩種涂層材料均不具備細(xì)胞毒性。MTT比色法的生物學(xué)終點(diǎn)是線粒體活性的檢測。細(xì)胞生命活動旺盛時，線粒體數(shù)量就增多，衰退時則減少。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，聚乳酸組L-929細(xì)胞在體外共同培育時，2d、4d時細(xì)胞毒性均為1級，RGR分別為88.61%和95.7%，而在7d時細(xì)胞毒性評級［7-8］就轉(zhuǎn)評為0級，并且RGR處于逐漸升高狀態(tài)，這種現(xiàn)象可能與隨著培養(yǎng)時間的延長，輕度受損后的細(xì)胞其活力得到一定的恢復(fù)有關(guān)。膠原蛋白、混合材料和聚全氟乙丙烯與L-929細(xì)胞在體外共同培育時，細(xì)胞毒性評級一直處于0級水平。陽性對照組的細(xì)胞RGR在培育期間呈逐漸下降趨勢，其細(xì)胞毒性分級在2d時為1級，而在4d為2級，7d時則增加到3級。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種受試材料表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞相容性。5結(jié)論及展望隨著心臟血管外科技術(shù)的成熟與發(fā)展，處理好生物材料在體內(nèi)生物相容性的問題，會對新材料的研制和開發(fā)產(chǎn)生重要的影響。參考文獻(xiàn)

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