內(nèi)毒素光度測定法檢查技術(shù)

光度測定法BET檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2009年3月1、光度測定法方法學(xué)分類2、光度測定法原理3、動(dòng)態(tài)比濁法BET4、終點(diǎn)比色法BET2024/7/16Page2Http://1、光度測定法方法學(xué)分類2024/7/16Http://Page3光度測定法（定量法檢測）濁度法顯色法動(dòng)態(tài)濁度法終點(diǎn)濁度法動(dòng)態(tài)顯色法終點(diǎn)顯色法(比濁法)(比色法)2、光度測定法原理光電轉(zhuǎn)換原理光度測定法是利用鱟試劑與內(nèi)毒素的混合物在反應(yīng)過程的透光度變化與內(nèi)毒素濃度的關(guān)系來定量檢測內(nèi)毒素的一種方法。當(dāng)一束光線進(jìn)入如下光電轉(zhuǎn)換裝置時(shí)，該裝置將產(chǎn)生電流I，我們稱I為透光強(qiáng)度。2024/7/16Http://Page4入射光反應(yīng)混合物透射光光電池I透光容器設(shè)：初始時(shí)的透光強(qiáng)度為Is，某時(shí)刻的透光強(qiáng)度為It

定義1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始時(shí)It=Is，Rt=100%，Rt曲線變化趨勢是由高至低。定義2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始時(shí)It=Is，OD=0，OD曲線變化趨勢是由低至升高。選擇不同的參數(shù)(Rt或OD)將得到不同變化趨勢的動(dòng)態(tài)曲線。2024/7/16Http://Page5T(分)IsItIeITAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線(Rt-T曲線)以透光度（Rt）為縱座標(biāo)，時(shí)間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液透光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如圖：2024/7/16Http://Page6Rt（%）T（分）動(dòng)態(tài)曲線100孕育期反應(yīng)期結(jié)束TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線(OD-T曲線)以吸光度（OD）為縱座標(biāo)，時(shí)間（T）為橫座標(biāo)，把TAL與內(nèi)毒素反應(yīng)引起反應(yīng)混合液吸光度的變化連續(xù)地描繪在座標(biāo)系中，便得到該反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如圖：2024/7/16Http://Page7ODT（分）動(dòng)態(tài)曲線0孕育期反應(yīng)期結(jié)束動(dòng)態(tài)曲線的特點(diǎn)把標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成三個(gè)濃度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分別與TAL反應(yīng)，描繪出反應(yīng)的動(dòng)態(tài)曲線如下圖：2024/7/16Http://Page8C3Rt（%）T（分）C2C1分析動(dòng)態(tài)曲線可看出：內(nèi)毒素濃度越高，孕育期越短；內(nèi)毒素濃度越高，反應(yīng)期曲線越陡；內(nèi)毒素濃度越高，進(jìn)入結(jié)束期越快。光度測定法BET試驗(yàn)的相關(guān)變量2024/7/16Http://Page9C3100Rt（%）T（分）C2C1相關(guān)變量：

內(nèi)毒素濃度(C)

透光度(Rt或OD)

反應(yīng)時(shí)間(T)1）動(dòng)態(tài)法原理固定透光度(Rt)，建立內(nèi)毒素濃度與反應(yīng)時(shí)間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-T曲線），用供試品的反應(yīng)時(shí)間比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。這里的反應(yīng)時(shí)間是指反應(yīng)混合液的透光度到達(dá)預(yù)設(shè)透光度值（Rt）的時(shí)間。2024/7/16Http://Page10回歸分析Rt%預(yù)設(shè)透光度值R0T1T2T392100T(分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cs）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品(S)反應(yīng)，得到反應(yīng)時(shí)間Ts，比對C-T關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cs。2024/7/16Http://Page11比對標(biāo)準(zhǔn)曲線TsT(分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT922）終點(diǎn)法原理固定反應(yīng)時(shí)間（T），建立內(nèi)毒素濃度與透光度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（C-Rt曲線），用供試品的透光度比對標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出供試品的內(nèi)毒素濃度。2024/7/16Http://Page12Rt(%)T(分)C1C2C3100R1R2R3預(yù)設(shè)反應(yīng)終止時(shí)間T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-K·C回歸分析（1）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）測定樣品內(nèi)毒素濃度（Cx）用鱟試劑與未知內(nèi)毒素含量的供試品（X）反應(yīng)，得到透光度值Rx，比對C-Rt關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得出供試品的內(nèi)毒素含量Cx。2024/7/16Http://Page13CxToT(分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-K·CRxCx比對標(biāo)準(zhǔn)曲線3、動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)儀器及器具動(dòng)態(tài)微孔平板儀或試管儀BET軟件微孔平板、反應(yīng)試管等2024/7/16Http://Page142024/7/16Http://Page15英國LabKinetics公司ATi動(dòng)態(tài)試管儀,96孔湛江安度斯公司開發(fā)的BET專用軟件“生物探針-2002”

2024/7/16Http://Page16美國CharlesRiverEndosafe便攜式檢測系統(tǒng)（PTS）美國BioTek公司超級酶標(biāo)儀，ELx808IU,使用96孔微孔板LKM細(xì)菌內(nèi)毒素動(dòng)態(tài)試管儀制造商：英國萊伯金耐特公司（LabKineticsLtd.）世界上第一臺(tái)動(dòng)態(tài)試管儀的生產(chǎn)商目前世界上銷量最大的動(dòng)態(tài)試管儀已經(jīng)取得醫(yī)療器械許可證完善的售后服務(wù)2024/7/16Http://Page17儀器特點(diǎn)：

1、體積小巧，占用空間??；2、恒溫性能、光學(xué)性能精密，各孔溫度均在37±0.2℃，這是國內(nèi)同類儀器無法達(dá)到的。3、配有專業(yè)的、操作簡單的軟件系統(tǒng)。ELx808IU型動(dòng)態(tài)酶標(biāo)儀制造商：美國伯騰公司（BioTek）功能強(qiáng)大的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測儀器豐富的面板操作及數(shù)據(jù)分析，無需電腦可獨(dú)立操作可使用多個(gè)波長同時(shí)分析2024/7/16Http://Page18動(dòng)態(tài)比濁法試驗(yàn)程序1、器具的準(zhǔn)備2、驗(yàn)證試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)干擾試驗(yàn)3、檢查法2024/7/16Http://Page191）試驗(yàn)器具的準(zhǔn)備器具分類器具名稱反應(yīng)試管玻璃試管（外徑8×75mm或10×75mm）稀釋容器大口徑玻璃試管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及無熱原吸頭等其他試管架、酒精燈、異丙醇浸泡的無紡布、鑷子、剪刀、砂輪、封口膜或醫(yī)用膠布、標(biāo)記紙等2024/7/16Http://Page20凡是與供試品或反應(yīng)試劑接觸的器具，必須經(jīng)除熱原處理。通常玻璃器具需經(jīng)250℃、60分鐘的干烤處理2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)試驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET試驗(yàn)的要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)技能是否滿足BET試驗(yàn)的要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET水等）是否滿足BET試驗(yàn)要求2024/7/16Http://Page211、試劑2024/7/16Http://Page22試劑名稱廠家裝量規(guī)格動(dòng)態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10EU/ml~0.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml2、反應(yīng)項(xiàng)目將標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素制備成至少3個(gè)濃度的稀釋液，相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限實(shí)驗(yàn)前，先預(yù)熱動(dòng)態(tài)儀，使其達(dá)到反應(yīng)溫度2024/7/16Http://Page23項(xiàng)目平行管陰性對照溶液(D)OOOOOOOOOOO內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（C）(EU/mL)0.030.252.03、溶液C的制備2024/7/16Http://Page24E1003.6mlWE100.4ml3.2mlWE20.8ml2.8mlWE0.250.4ml2.8mlWE0.030.4ml30s0.4ml30s0.4ml30s0.8ml30s0.4mlBET水1.0ml2.8ml2.8ml3.6ml3.2mlCSE混合5分鐘E10E2E0.25E0.03CSE/E1004、鱟試劑的準(zhǔn)備①取TAL1支，用砂輪在安瓿頸劃痕，擦拭后從安瓿頸處折斷（避免玻璃屑落入安瓿內(nèi)）；

②用刻度吸管或移液器準(zhǔn)確吸取BET水1.25ml沿瓶壁加入安瓿內(nèi)，輕輕搖勻，使內(nèi)容物全部溶解（避免產(chǎn)生氣泡）；2024/7/16Http://Page25③取反應(yīng)試管11支，按2.0EU/ml、0.25EU/ml、0.03EU/ml各濃度平行3管，NC平行2管標(biāo)記；

5、軟件系統(tǒng)的設(shè)置進(jìn)入動(dòng)態(tài)儀系統(tǒng)軟件，根據(jù)試驗(yàn)要求，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如反應(yīng)時(shí)間、預(yù)設(shè)透光度值等。填寫相關(guān)的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，使軟件進(jìn)入待采集狀態(tài)2024/7/16Page26Http://6、加樣反應(yīng)先將復(fù)溶好的鱟試劑分裝至各反應(yīng)試管中，0.1ml/管；分別將反應(yīng)溶液加入各相應(yīng)反應(yīng)管中，一般按照從低濃度到高濃度的順序加樣，首先加陰性對照溶液；加樣完成后，將每支反應(yīng)管內(nèi)的混合液輕輕混勻后，插入動(dòng)態(tài)儀中反應(yīng)TAL2.0EU/ml0.1ml0.1ml0.1ml0.25EU/mlCSE0.1ml0.03EU/ml0.1mlNCBET水0.1ml0.1ml0.1ml加樣順序從低濃度到高濃度2024/7/16Page27Http://在動(dòng)態(tài)儀中插入反應(yīng)試管后，開始數(shù)據(jù)采集。

2024/7/16Page28Http://7、結(jié)果判斷藥典要求1、陰性對照的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|≥0.980廠家建議值3、變異系數(shù)CV%<10%關(guān)于相關(guān)系數(shù)當(dāng)對一組數(shù)據(jù)作線性回歸分析時(shí)，以相關(guān)系數(shù)r表示其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性狀況，即該組數(shù)據(jù)的相關(guān)狀況。當(dāng)r值為正時(shí)，表示該組數(shù)據(jù)呈正相關(guān)關(guān)系；r值為負(fù)時(shí)，該組數(shù)據(jù)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)r值的絕對值|r|=1時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性最好。2024/7/16Page29Http://2024/7/16Http://Page30試驗(yàn)完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析2024/7/16Page31Http://試驗(yàn)完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析2024/7/16Page32Http://試驗(yàn)完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析E0.3125E0.25E23）干擾初篩試驗(yàn)?zāi)康募霸碇挥性跓o干擾情況下，樣品的內(nèi)毒素檢測結(jié)果才是有效的。通過檢測從供試品原液到其MVD或MVC之間的稀釋液，計(jì)算內(nèi)毒素回收率，判斷供試品濃度對BET的干擾情況。2024/7/16Page33Http://試驗(yàn)步驟1、供試品限值的確定2、試劑的選擇3、供試品最大有效稀釋的計(jì)算4、反應(yīng)溶液的制備5、加樣及反應(yīng)6、結(jié)果判斷2024/7/16Page34Http://干擾初篩試驗(yàn)舉例供試品限值硫酸慶大霉素，100ml/瓶，5000U/ml；藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U2024/7/16Page35Http://試劑本試驗(yàn)使用鱟試劑的檢測范圍為10~0.03EU/ml，選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為2、0.25、0.03EU/ml2024/7/16Page36Http://試劑名稱廠家裝量規(guī)格動(dòng)態(tài)濁度法TAL安度斯1.25ml/支10~0.03EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）安度斯10ng/支10EU/ng（CoA）BET水（W）安度斯25ml/瓶內(nèi)毒素<0.003EU/ml最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算光度測定法中，供試品最大有效稀釋倍數(shù)計(jì)算公式： MVD=cL/λ，其中λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度本試驗(yàn)，2024/7/16Page37Http://MVD=5000U/mlx0.5EU/1000U0.03EU/ml=80（倍）各反應(yīng)溶液的制備溶液C的制備E1000.4ml3.6mlWE100.8ml3.2mlWE20.4ml2.8mlWE0.25S原液0.4ml3.6mlWS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS80備用液0.4ml2.8mlWE0.03溶液A的制備E0.50.8ml2.4mlW備用液2024/7/16Page38Http://溶液B的制備E0.5S100.5ml0.5mlS20E0.25E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.5S200.5ml0.5mlS40E0.252024/7/16Page39Http://加樣及反應(yīng)取TAL兩支，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性試驗(yàn)中的方法將其復(fù)溶；復(fù)溶鱟試劑后，運(yùn)行軟件，使其進(jìn)入待采集狀態(tài)；將兩支復(fù)溶好的鱟試劑溶液合并在一起，輕輕混勻避免產(chǎn)生氣泡；將鱟試劑液分裝至20支反應(yīng)試管中，0.1ml/管；將相應(yīng)的溶液A、B、C、D加至反應(yīng)管中，0.1mL/管，每濃度平行2管E0.03E0.25E2溶液C溶液DWS20S40S80S20E0.25S40E0.25S80E0.25溶液A溶液A溶液A溶液B溶液B溶液B2024/7/16Page40Http://結(jié)果判斷藥典要求1、陰性對照的反應(yīng)時(shí)間（TD）大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間（Tλ）2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9803、回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%2024/7/16Page41Http://回收率的計(jì)算光度測定法試驗(yàn)中，在供試品檢查濃度的溶液中,添加標(biāo)準(zhǔn)曲線中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度,根據(jù)回收的內(nèi)毒素濃度與添加的內(nèi)毒素濃度的比值(回收率R)，判斷供試品溶液對試驗(yàn)的干擾程度。R的計(jì)算公式如下：2024/7/16Http://Page42Ct：試驗(yàn)測出的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Cs

：試驗(yàn)測出的加入

m標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量

m：標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)或靠近中點(diǎn)的已知濃度內(nèi)毒素光度測定法規(guī)定：當(dāng)R在50~200%之間時(shí)，認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下該供試品溶液對試驗(yàn)無干擾。Cs-Ct

mR=本試驗(yàn)結(jié)果2024/7/16Page43Http://相關(guān)系數(shù)絕對值|r|=0.9949>0.980TD（>3600s）>Tλ20倍回收率40倍回收率80倍回收率試驗(yàn)有效試驗(yàn)有效有干擾有干擾無干擾4）干擾試驗(yàn)根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果，確定選擇供試品的無干擾濃度選擇3批供試品進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)溶液的制備方法與干擾初篩試驗(yàn)相同2024/7/16Page44Http://有干擾不理想無干擾溶液的制備A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液

B為加入

m內(nèi)毒素且與A溶液有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液

C為用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液

D為陰性對照編號內(nèi)毒素濃度配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無供試品溶液不少于2個(gè)B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的濃度（設(shè)為λm）供試品溶液不少于2個(gè)C至少3個(gè)濃度（最低點(diǎn)設(shè)定為λ）檢查用水每一濃度不少于2個(gè)D無檢查用水不少于2個(gè)2024/7/16Page45Http://反應(yīng)項(xiàng)目設(shè)置3批樣品都在同一濃度做干擾驗(yàn)證試驗(yàn)每濃度平行2管溶液編號項(xiàng)目平行管D陰性對照OOC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOA1S80OOB1S80E0.25OOA2S80OOB2S80E0.25OOA3S80OOB3S80E0.25OO2024/7/16Page46Http://接受標(biāo)準(zhǔn)藥典要求1、陰性對照的反應(yīng)時(shí)間（TD）大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間（Tλ）2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9803、各批樣品的回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%2024/7/16Page47Http://5）檢查法（日常檢查）根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，選擇無干擾的供試品濃度進(jìn)行BET日常檢查各反應(yīng)溶液的制備及反應(yīng)項(xiàng)目設(shè)置與干擾試驗(yàn)相同2024/7/16Page48Http://溶液編號項(xiàng)目平行管D陰性對照OOC內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)(EU/mL)E0.031OOE0.25OOE2OOAS80OOBS80E0.25OO結(jié)果判斷藥典要求1、陰性對照的反應(yīng)時(shí)間(TD)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反應(yīng)時(shí)間(Tλ)2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)|r|≥0.9803、各批樣品的回收率R滿足：50%≤R≤200%廠家建議值4、變異系數(shù)CV%<10%若供試品溶液A所有平行管的內(nèi)毒素濃度平均值乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定，否則判供試品不符合規(guī)定無復(fù)測要求2024/7/16Page49Http://4、終點(diǎn)比色法BET原理當(dāng)鱟試驗(yàn)的顯色反應(yīng)到達(dá)預(yù)設(shè)的反應(yīng)終止時(shí)間（T0)時(shí)，反應(yīng)混合液的吸光度值（OD）與內(nèi)毒素濃度（C）成正比，利用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素建立OD-C的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量測定供試品的內(nèi)毒素含量。儀器分光光度計(jì)酶標(biāo)儀37℃恒溫儀2024/7/16Page50Http://試驗(yàn)程序1.試驗(yàn)準(zhǔn)備：儀器及用具等2.確定藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）3.選擇終點(diǎn)比色法試劑盒終點(diǎn)比色法鱟試劑顯色基質(zhì)（底物）工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE）4.計(jì)算供試品的最大有效稀釋（MVD）或最低有效濃度（MVC）5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)6.干擾試驗(yàn)（驗(yàn)證）7.檢查法（日常檢查）2024/7/16Page51Http://終點(diǎn)比色法日常檢查舉例試劑及器具終點(diǎn)比色法試劑盒終點(diǎn)比色法試劑

顯色基質(zhì)（底物）

工作標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素（CSE