分子生物學(xué)檢查課件

分子生物學(xué)檢查南京中醫(yī)藥大學(xué)西內(nèi)教研室徐慶分子生物學(xué)定義分子生物學(xué)〔molecularbiology)是從分子程度研討生命景象的科學(xué)。它的中心內(nèi)容是經(jīng)過生物的物質(zhì)根底—核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的構(gòu)造、功能及其相互作用等運(yùn)動(dòng)規(guī)律的研討來闡明生命分子根底，從而探求生命奧妙分子生物學(xué)開展簡史1871年Miesscher初次從萊茵河鮭魚精子中分別到DNA1953年Watson和Ｃrick闡明DNA雙螺旋構(gòu)造1958年Meselson和Stahl提出DNA半保管復(fù)制模型1965年發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒1966年Nirenberg等破譯全部遺傳密碼1970年Smith分別到第一種核酸內(nèi)切限制酶1973年Boyer和Cohen建立DNA重組技術(shù)1977年Sanger以及Maxam和Gilbert發(fā)明快速DNA測序技術(shù)1981年P(guān)almiter和Brinster勝利獲得第一只基因小鼠1985年P(guān)CR方法問世；Watson出任“人類基因組方案〞首席科學(xué)家1990年美國同意第一個(gè)體細(xì)胞基因治療方案分子生物學(xué)開展簡史2019年英國“自然〞雜志發(fā)表人類基因組全物理圖2019年英國愛丁堡羅斯林研討所培育出第一只克隆羊多莉2019年中國正式參與“人類基因組方案〔HGP〕〞2000年全部人類基因組測序任務(wù)宣告完成，進(jìn)入后基因組方案時(shí)代(基因克隆方案、基因組多樣性方案、cDNA方案、蛋白質(zhì)方案、細(xì)胞方案〕分子生物學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一、分子生物學(xué)在發(fā)病機(jī)制中的運(yùn)用1阿爾茲海默病〔AD〕的基因定位2生物活性多肽及蛋白質(zhì)mRNA研討確證腎素血管緊張素系統(tǒng)在遺傳性高血壓發(fā)病中起重要作用3對某些病毒致病作用的研討發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞DNA整合有HBV-DNA，以為乙肝與肝癌發(fā)病親密相關(guān)4認(rèn)識(shí)了某些遺傳疾病的發(fā)病機(jī)制地中海貧血是或基因缺失或點(diǎn)突變所致二、分子生物學(xué)在疾病診斷中的作用發(fā)病過程：基因突變---mRNA---蛋白質(zhì)〔激素〕---細(xì)胞病變---組織器官病變---臨床病癥根據(jù)基因突變檢測、基因延續(xù)性分析、mRNA檢測三種途徑，運(yùn)用核酸分子雜交和PCR技術(shù)，進(jìn)展分子生物學(xué)檢查，使遺傳性疾病、感染性疾病和腫瘤等的診斷提早到基因和mRNA程度

三、分子生物學(xué)在疾病治療中的運(yùn)用基因治療：將目的基因加以修飾，轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞中，以到達(dá)治療作用運(yùn)用：單基因遺傳病、腫瘤、心血管、本身免疫疾病及病毒感染等危害較大且目前無有效治療途徑的疾病四、重組DNA技術(shù)與新藥研討重組微生物、基因疫苗、細(xì)胞因子合成、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等分子生物學(xué)的普通原理和研討方法一、核酸的構(gòu)造和功能1核酸的一級(jí)構(gòu)造：磷酸二酯鍵銜接成的核苷酸鏈核苷酸：戊糖、磷酸基團(tuán)、堿基堿基：DNA：A、G、T、CRNA：A、G、U、C核酸是極性分子，5’端為磷酸基團(tuán)，3’端為羥基，核酸序列的習(xí)慣寫法是5’端3’端核酸的構(gòu)造和功能2DNA的二級(jí)構(gòu)造：著名的雙螺旋構(gòu)造兩條核苷酸鏈經(jīng)過堿基間氫鍵相連〔A—T，C—G〕，走向相反。DNA的變性與復(fù)性：誘導(dǎo)要素：加熱、酸、堿、乙醇、丙酮、高鹽等運(yùn)用：分子雜交的根底核酸的構(gòu)造和功能3DNA的三級(jí)構(gòu)造：DNA雙螺旋和核小體串珠裝狀的核小體緊縮成螺旋形，進(jìn)一步折疊成染色單體，DNA長度因此縮短10000倍4DNA功能攜帶和傳送遺傳信息，表達(dá)遺傳過程的相對保守性遺傳的中心法那么

DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制〔病毒〕翻譯核酸的構(gòu)造和功能5DNA的半保管復(fù)制原那么核酸的構(gòu)造和功能6RNA：rRNA：組成核糖體mRNA：傳送遺傳信息由核內(nèi)至胞漿的核糖體tRNA：轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸密碼子：共64個(gè)密碼子，有61個(gè)用于編碼20個(gè)氨基酸，另外還有3個(gè)作為終止密碼(UAA、UAG、UGA)二、基因及其表達(dá)調(diào)控基因：合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核酸序列。一個(gè)基因不僅包括編碼序列，還包括所需的調(diào)控序列、5’端不翻譯序列、內(nèi)含子和3’非翻譯序列等一切核酸序列基因組：一個(gè)生物體的一切基因。人類指23對染色體中的一切基因基因及其表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)調(diào)控：多層次DNA及染色體程度轉(zhuǎn)錄程度轉(zhuǎn)錄后程度翻譯程度蛋白質(zhì)加工程度三、人類基因缺陷的主要類型突變指突變體中DNA構(gòu)造的任何改動(dòng)，致使基因作用〔構(gòu)造蛋白、酶等〕，以致個(gè)體表型改動(dòng)〔一〕點(diǎn)突變：單個(gè)核苷酸的置換〔1〕同義突變：GAUGAC均是天門冬氨酸密碼子〔2〕錯(cuò)義突變：翻譯出的氨基酸改動(dòng)〔3〕無義突變：產(chǎn)生提早出現(xiàn)的終止密碼子〔4〕延伸突變：終止密碼子突變?yōu)榘被崦艽a子人類基因缺陷的主要類型〔二〕缺失或插入小的缺失或插入，堿基數(shù)量非3的整倍數(shù)，稱移碼突變，假設(shè)為3的整倍數(shù)，出現(xiàn)密碼子的插入或缺失〔三〕染色體畸變?nèi)旧w構(gòu)造發(fā)生大范圍改動(dòng)：倒位、缺失、插入、易位四、基因工程基因工程是指在體外的條件下，人工將DNA分子“剪切〞并重新“拼接〞，構(gòu)成一個(gè)新的雜合的DNA分子，然后將它導(dǎo)入微生物或真核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)展擴(kuò)增，使該基因在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，從而產(chǎn)生人類需求的基因產(chǎn)物或改造、發(fā)明新的生物類型基因工程基因工程的根本程序〔1〕帶有目的基因的DNA片段的獲得〔2〕DNA片段與載體DNA銜接〔體外重組〕〔3〕銜接產(chǎn)物導(dǎo)入宿主細(xì)胞〔4〕重組體的擴(kuò)增、挑選與鑒定〔5〕目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)〔6〕表達(dá)產(chǎn)物的分別、鑒定等基因工程〔一〕基因工程的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶核酸修飾酶：銜接酶、聚合酶、核酸酶、堿性磷酸酶等〔二〕基因工程的宿主細(xì)胞和載體原核細(xì)胞：大腸桿菌、枯草桿菌宿主細(xì)胞真核細(xì)胞：哺乳動(dòng)物細(xì)胞

大腸桿菌：質(zhì)粒、噬菌體衍生載體常用載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞：單鏈?zhǔn)删w載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒基因工程〔三〕目的基因的分別知基因的獲得：限制性內(nèi)切酶酶切法PCR法、RT-PCR法、人工合成DNA片段法基因文庫挑選法未知基因的獲得：蛋白質(zhì)DNA戰(zhàn)略

基因工程〔四〕目的基因與載體的銜接工具：DNA銜接酶產(chǎn)物：重組體〔五〕重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化：導(dǎo)入細(xì)菌轉(zhuǎn)染：導(dǎo)入噬菌體、病毒宿主菌必需是限制酶缺陷型和DNA重組缺陷型基因工程〔六〕重組體的挑選直接挑選法：借助遺傳表型進(jìn)展挑選插入失活法：pBR322質(zhì)粒結(jié)合氨芐青霉素〔Ap〕和四環(huán)素〔Tc〕抗性基因，插入后失活Tc插入表達(dá)法：pTR262質(zhì)粒的四環(huán)素抗性〔Tcr〕基因上游cI基因，插入后cI基因失活，抗性表達(dá)〔七〕克隆基因的表達(dá)基因工程插入失活法挑選重組體表示圖基因診斷一、基因診斷的根本原理運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)方法檢測基因構(gòu)造及其表達(dá)功能能否正常，從而對人體形狀和疾病作出診斷?；蛟\斷檢測的靶物是DNA或mRNA基因診斷二、基因診斷的特點(diǎn)1高度特異性2高靈敏度及準(zhǔn)確性：PCR方法克檢測出pg級(jí)程度靶基因3早期快速：結(jié)合桿菌培育需幾周，痰涂片染色陽性率低，PCR方法一個(gè)任務(wù)日確診4被測基因不一定處于活化形狀三、基因診斷的臨床意義1優(yōu)生優(yōu)育3預(yù)防醫(yī)學(xué)2器官移植4感染性疾病核酸分子雜交技術(shù)定義：根據(jù)DNA雙鏈堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性原理，用知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針檢測樣本中能否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列的方法核酸分子雜交技術(shù)一、探針的特征和種類探針是一段與被測核苷酸序列互補(bǔ)的帶標(biāo)志的核苷酸片段特征：1要加以標(biāo)志，帶示蹤物2單鏈3選取基因編碼序列4高度特異性5長度十幾到幾千堿基6標(biāo)志探針高靈敏度、穩(wěn)定，標(biāo)志方法簡便、平安種類：基因組DNA探針、cDNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針核酸分子雜交技術(shù)二、探針的標(biāo)志物放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物質(zhì)：生物素、地高辛、熒光素、酶〔辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、半乳糖苷酶等〕及金屬Hg等三、核酸分子雜交方法液相雜交；固相雜交固相載體：硝酸纖維素膜、尼龍膜、乳膠、磁珠等核酸分子雜交技術(shù)雜交根本程序核酸分子雜交技術(shù)幾種固相核酸分子雜交方法：1Southern印跡雜交法：DNA分子經(jīng)酶切核瓊脂糖凝膠電泳后，放入堿溶液中變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠上吸印到硝酸纖維素膜或尼龍膜上用與雜交核酸分子雜交技術(shù)2Northern印跡雜交法：經(jīng)典的RNA分析法，類似Southern印跡，主要區(qū)別是在變性劑存在下，以瓊脂糖凝膠電泳分別RNA3斑點(diǎn)或狹縫雜交4原位雜交：核酸分子探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)展雜交核酸分子雜交技術(shù)四、雜交信號(hào)的檢測1放射自顯影：X光片檢測放射性核素標(biāo)志物2非放射性探針檢測：〔1〕偶聯(lián)〔2〕顯色：酶促、熒光、化學(xué)發(fā)光聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕

1985年KaryBM創(chuàng)建了聚合酶鏈反響〔polymerasechainreaction,PCR)技術(shù)，又稱體外基因擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可擴(kuò)增核酸靶序列，添加106倍，極大提高檢測靈敏度原理：利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，模擬體內(nèi)的復(fù)制過程，在附加的一對引物之間誘發(fā)聚合酶反響。PCR全過程由DNA模板變性、模板與引物結(jié)合及引物延伸三個(gè)步驟組成聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕PCR反響的原理表示圖1DNA模板變性2模板與引物結(jié)合3引物延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕PCR條件的優(yōu)化1模板核酸：來源廣泛、需部分純化、去除DNA聚合酶抑制劑普通宜用ng級(jí)的克隆DNA，g程度的染色體DNA或104拷貝的待擴(kuò)增模板用于檢測目的，擴(kuò)增片段長度普通不超越500bp，以100-300bp為好2引物應(yīng)純化，濃度不宜過高普通終濃度為0.2-1.0mol/L聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕3緩沖液目前最常用PCR反響的緩沖液體系為10-50mmol/LTris-HCl〔PH8.3-8.8，20°C〕偏堿性有利于TaqDNA聚合酶作用緩沖液中50mmol/LKCl利于引物退火Mg2+對產(chǎn)量和特異性有顯著影響，過高特異性下降；過低產(chǎn)量減少。在各種dNTP濃度為200mol/L時(shí)Mg2+為1.5-2.0mmol/L較適宜聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕4dNTP濃度常采用50-200mol/L的dNTP4種dNTP濃度要一致5TaqDNA聚合酶用量在100l總反響液中，普通所需TaqDNA聚合酶用量為0.5-5U，通常參與2.5U，足以到達(dá)每分鐘延伸1000-4000個(gè)核苷酸速度聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕6循環(huán)參數(shù)〔1〕變性溫度與時(shí)間94°C30s〔2〕退火溫度與時(shí)間退火溫度決議反響特異性取決于引物的長度、濃度和堿基組成〔G+C含量〕。長度為15-25bp時(shí)，退火溫度可根據(jù)Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕〔3〕延伸溫度與時(shí)間72°C待擴(kuò)增片段〈1kb，1min；〉1kb3-4min〔4〕循環(huán)次數(shù)20-25個(gè)循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR