酶免檢測技術(shù)影響

關(guān)于酶免檢測技術(shù)影響酶免技術(shù)的分類實驗注意事項實驗中常見問題及解決方法第2頁,共24頁，星期六，2024年，5月

均相法雙抗原夾心法（測抗體）直接法雙抗體夾心法（測抗原）

酶免法間接法測抗體、抗原EIA非均相法

ELISA競相法測抗體、抗原

捕獲法測IgM抗體enzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶免技術(shù)的分類第3頁,共24頁，星期六，2024年，5月雙抗體夾心法

HBsAg、HBeAg雙抗原夾心法

HBsAb夾心法第4頁,共24頁，星期六，2024年，5月HBcAb、HBeAb競爭法第5頁,共24頁，星期六，2024年，5月HDVIgG/M、HEVIgG/M

測IgG測IgM間接法第6頁,共24頁，星期六，2024年，5月HAV-IgM捕獲法測IgM第7頁,共24頁，星期六，2024年，5月第8頁,共24頁，星期六，2024年，5月實驗注意事項1、標本避免溶血盡量新鮮，避免細菌污染

一般5天內(nèi)檢測的血清可4℃保存，否則低溫保存。

第9頁,共24頁，星期六，2024年，5月2、試劑使用前平衡至室溫配置洗液應使用去離子水或蒸餾水，保證水的新鮮3、設(shè)計實驗設(shè)計好孔位，通常陰陽對照孔各2孔、空白1孔。必要時做好標注，避免錯誤第10頁,共24頁，星期六，2024年，5月4、加樣樣品應全部加于反應孔底部，避免液體懸掛在孔壁上。加樣量準確！加下一標本時更換吸嘴第11頁,共24頁，星期六，2024年，5月5、加酶結(jié)合物一般使用滴瓶滴加滴加時應保持瓶身垂直、加液速度適中，使液滴大小均勻一致一步法時先加樣本后加酶，不可顛倒順序一般空白孔只加底物和終止液，而不能加入其它物質(zhì)，尤其是酶結(jié)合物第12頁,共24頁，星期六，2024年，5月6、溫育溫度、時間要嚴格控制！最好使反應杯盡快升溫到所需溫度最好放入濕盒或水浴箱中反應板貼上即時貼

微孔板放入水浴箱后，孔內(nèi)溫度上升到37℃需要一定時間。但實際工作中很少有人注意這個問題，通常是放入即計時，導致實際溫育時間不夠，弱陽性標本漏檢。解決：微孔板放水面上或濕盒中紗布浸透水，使板底部直接與37℃接觸，迅速達到溫度。第13頁,共24頁，星期六，2024年，5月7、洗板使用專用洗滌液一般洗滌4~6次若手工洗滌，前兩次洗滌應不溢出反應孔污染后面幾次洗滌應加滿所有孔干凈每次加洗滌液后應浸泡30秒再甩去洗液反應板倒扣吸水紙上拍干洗板時應注意非離子去垢劑的濃度。洗液中Tween20高于0.2%,可使包被子固相上的抗體抗原解吸附而影響測定下限。第14頁,共24頁，星期六，2024年，5月8、加底物底物A液通常是H2O2還原劑底物B液通常是TMB（3、3′、5、5′-四甲基聯(lián)苯胺）氧化劑TMB氧化后呈藍色，被2NH2SO4終止后呈黃色，450nm波長處有最大吸收峰底物B應避光保存，實驗時加完底物A、B保溫時也應避光保存。第15頁,共24頁，星期六，2024年，5月9、比色空白孔校零，讀取各孔OD值單波長or雙波長的選擇：

單波長通常是對顯色具有最大吸收的450nm或492nm

雙波長酶標儀則在敏感波長450nm和非敏感波長630nm下各測定一次。使用雙波長時不必設(shè)定空白孔，否則會造成孔吸光度數(shù)為負數(shù)。若底物為OPD（鄰苯二胺），波長為492nm

若底物為TMB，波長為450nm第16頁,共24頁，星期六，2024年，5月10、結(jié)果判讀不同試劑，CUTOFF值計算方法不同第17頁,共24頁，星期六，2024年，5月常見問題及解決辦法內(nèi)源性標本因素：1、類風濕因子：一般為IgM型，可與變性IgGFc段非特異結(jié)合，因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標IgG結(jié)合而產(chǎn)生假陽性。2、補體：包被抗體及隨后加入的酶標抗體均能激活補體而與補體C1q位點結(jié)合而產(chǎn)生假陽性，也可降低檢測物與固相結(jié)合而引起假陰性或測值偏低3、異嗜性抗體：人血清中含有抗齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標二抗出現(xiàn)假陽性。4、溶菌酶：可與等電點5的低等電點蛋白強結(jié)合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。外源性標本因素：1、溶血：Hb中的血紅素集團有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。2、細菌污染：細菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標抗體作用，并且細菌引起標本混濁。3、標本4℃存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議<1周4、標本凝固不全：殘留纖維蛋白原形成的纖維蛋白塊，造成假陽性。第18頁,共24頁，星期六，2024年，5月第19頁,共24頁，星期六，2024年，5月第20頁,共24頁，星期六，2024年，5月第21頁,共24頁，星期六，2024年，5月設(shè)備管理人員第22頁,共24頁，星期六，2024年，5月你愿意…

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