T-SPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病綜合防控技術規(guī)程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetable湖南省植物保護學會發(fā)布I本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖南省植物保護學會提出。本文件由湖南省植物保護學會歸口。本文件起草單位為湖南省農業(yè)科學院、寧波大學、全國農業(yè)技術推廣服務中心、沈陽農業(yè)大學、中國農業(yè)科學院植物保護研究所、江蘇省農業(yè)科學院植物保護研究所、廣東省農業(yè)科學院、云南農業(yè)大學、山東省農業(yè)科學院。本文件主要起草人：劉勇、燕飛、張松柏、章東方、張卓、史曉斌、張德詠、孫書娥、嚴丹侃、鄭紅英、顧江濤、張海珊、張安盛、季英華、吳元華、李方方、何自福、劉慧、李凡。1豆科蔬菜主要病毒病綠色綜合防控技術規(guī)程本標準規(guī)定了豆科蔬菜主要病毒病的術語和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、防治原則、防治方法、加強病蟲測報，實行統(tǒng)防統(tǒng)治、建立防治檔案等技術要求。本標準適用于豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4285農藥安全使用標準GB/T8321農藥合理使用準則3術語和定義GB/T35333和界定的以及下列術語和定義適用于本文件。下列術語和定義適用于本標準。3.1綜合防控技術IntegratedPreventionandControlTechnology綜合防控是基于“預防為主、綜合防治”的植保方針，以確保農業(yè)生產、農產品質量和農業(yè)生態(tài)環(huán)境安全為目標，以減少農藥使用為目的，優(yōu)先采取生態(tài)調控、生物防治、物理防治和科學用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術來控制農作物病蟲害的植物保護措施。3.2豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等蔬菜。3.3病毒病VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、專一性或廣譜性等特性。3.4鑒別寄主DifferentialHost對特定病原物有特殊反應或表現(xiàn)特定癥狀的植物稱為鑒別寄主。3.5陽性對照PositiveControl2凡是確定可以出現(xiàn)預期結果的處理，稱為陽性對照。3.6陰性對照NegativeControl凡是確定不會出現(xiàn)預期結果的處理，稱為陰性對照。3.7空白對照BlankControl凡是不加處理因素的處理，稱為空白對照。4發(fā)生流行規(guī)律豆科蔬菜病毒病主要由黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus，BBWV）、紫云英矮縮病毒（Milkvetchdvirus，MDV）等病毒引起。常表現(xiàn)為多種病毒的混合侵染。CMV、TMV和BBWV均可由蚜蟲或汁液接觸傳播，而MDV主要由蚜蟲以持久方式進行傳播。病毒可在多種植物上越冬，病殘體、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源。通過有翅蚜蟲遷飛傳播擴散蔓延，全年均可發(fā)病，以春秋季發(fā)病最為嚴重。整枝，打叉，搭架，采果等農事活動中，只要造成寄主微創(chuàng)口，即可侵入危害。此外，土壤瘠薄、黏重、板結、排水不良和偏施氮肥都會加重病情發(fā)展。5病害診斷5.1病害田間診斷豆科植物感染病毒后，癥狀表型多樣，主要有花葉斑駁、明脈皺縮、矮化等類型癥狀。癥狀類型參見附錄A。5.2生物學檢測具體方法和檢測結果見附錄B。5.3血清學檢測具體方法和檢測結果見附錄B。5.4分子生物學檢測具體方法和檢測結果見附錄B。6防治原則根據(jù)豆科蔬菜病毒病和傳毒害蟲的發(fā)生規(guī)律及危害特點，本著“預防為主，綜合防治”的指導思想，從農田生態(tài)系統(tǒng)整體出發(fā)，保護生物多樣性，控制生產環(huán)境，減少病毒來源，優(yōu)先選擇農業(yè)防治、物理防治、生物防治技術，盡量減少化學農藥的使用。7防治方法37.1農業(yè)防治7.1.1種植抗病品種根據(jù)各地栽培條件選用抗病品種。7.1.2留種設立無病留種田，在留種田淘汰病株，減少毒源，從無病優(yōu)質的良種株上采集種子。7.1.3種子消毒播種前將種子在清水中浸泡（蠶豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸種），再放入10%磷酸三鈉溶液中浸種20～30min，撈出后用清水沖洗干凈后播種；選用30%噻蟲嗪拌種；或者選用商品包衣種子。7.1.4合理輪作盡量避免與豆科作物重茬栽培，選用空茬地或倒茬地，與非豆科作物合理輪作。7.1.5田間衛(wèi)生清除田間及周邊雜草，加強肥水管理，及時摘除病葉，拔除病株。7.2物理防治7.2.1使用防蟲網(wǎng)大棚豆科蔬菜選擇60目以上的防蟲網(wǎng)。7.2.2色板誘殺對于矮桿豆科作物（豌豆、蠶豆等）可采用色板誘殺蚜蟲，在田間放置30cm×40cm的誘蟲黃板300~450塊/hm2，呈棋盤式均勻插置田間，黃板底部略高出植株頂端10~20cm左右，黃板粘滿害蟲后及時更換。7.3藥劑防治藥劑使用應符合GB4285和GB8321的相關規(guī)定。7.3.1病毒病防治病毒病防控以預防為主，當病情指數(shù)≥5%時，選擇使用高效、低毒、低殘留農藥進行防治。由于豆科蔬菜，尤其是大棚內種植，采收之前7~10d，必須停止用藥。防治病毒病常用藥劑的用量及用法見附錄C。7.3.2蚜蟲防治抓好早治蚜連續(xù)治蚜，減少蟲媒傳毒。當蚜株率≥5%時，優(yōu)先采用植物源農藥，嚴禁使用禁用農藥或高毒農藥，防治蚜蟲常用藥劑的用量及用法見附錄C。8加強病蟲測報，實行統(tǒng)防統(tǒng)治4根據(jù)田間調查情況結合氣象因素分析，及時對病蟲害進行預測預報，當病蟲害達到影響經(jīng)濟閥值時，當?shù)卣畱M織種植戶對整片作物進行科學的病蟲害防治。9建立防治檔案在田間調查豆科病毒病發(fā)生情況時，具體調查內容參見附錄D。5附錄A（資料性附錄）豆科蔬菜病毒病癥狀豇豆病毒病主要表現(xiàn)為花葉、明脈、矮縮等癥狀。以花葉癥狀最為常見，葉片受害后，在新葉上表現(xiàn)黃綠相間的花斑或不規(guī)則花葉；明脈型主要表現(xiàn)在葉片上，嫩葉初呈明脈、失綠或皺縮；矮縮型表現(xiàn)為葉片皺縮、卷葉，葉色濃綠，腋芽簇生，基本不能開花結實，嚴重矮化，甚至整株死亡（圖A1）。圖A1豇豆病毒病癥狀蠶豆感病后表現(xiàn)褪綠花葉，葉片皺縮，葉脈黃化，植物矮小，少花，不結實或結實率低。生長后期感病后，頂部葉片稍顯花葉，基部葉片正常；嚴重的頂部葉片向上合攏，呈現(xiàn)花葉、皺縮、卷曲癥狀（圖A2）。圖圖A4豌豆病毒病癥狀圖A2蠶豆病毒病癥狀菜豆感病后，表現(xiàn)花葉，葉片出現(xiàn)明脈、產生褪綠帶、斑駁或綠色部分凹凸不平，葉片皺縮、扭曲、畸形，株形矮小，開花遲緩或落花，開花結莢明顯減少，豆莢短?。▓DA3）。圖A3菜豆病毒病癥狀豌豆感病后常表現(xiàn)葉脈半透明、花葉、葉皺、小葉下卷、苗卷曲、早枯、節(jié)間縮短、株矮、結莢少或不結莢等癥狀（圖A4）。圖A4豌豆病毒病癥狀7（規(guī)范性附錄）豆科蔬菜病毒病生物學、血清學檢測B.1病毒生物學檢測B.1.1病毒摩擦接種方法將少許感染病毒的病葉，放于研缽，加入適量接種緩沖液，充分研磨。用噴粉器將金剛砂（200~400目）撒到待接種葉的表面（也可直接將金剛砂加在研磨液中在營養(yǎng)缽內插上標簽，注明處理及時間；用手指或研棒蘸取少許汁液，在待接種葉面上輕輕均勻地涂擦，沿一個方向抹，一般沿葉基到葉尖方向，涂擦時用另一只手指托住葉片，注意用手涂擦前需用肥皂洗凈手指；用清水沖洗接過種的葉片，將植株放于溫室（最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對照；將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液接種的方法接種于枯斑寄主上，待枯斑寄主表現(xiàn)單斑后，將單個斑點剪下，用接種緩沖液研磨再次接種至枯斑寄主，出現(xiàn)單斑癥狀后再次取下單斑接種于枯斑寄主，出現(xiàn)斑點后再取單個斑點接種于系統(tǒng)寄主，出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后再取葉片進行保存和檢測。B.1.2病毒的保存與測定將經(jīng)過三次單斑純化后的毒源，再次接種至系統(tǒng)寄主上，待其出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后，取發(fā)病葉片冷凍干燥處理后，寫明標簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病毒分離物分別接種至病毒敏感植物上，觀察其癥狀（見圖B1、圖B2、圖B3）。圖B1CMV分離物接種至克氏煙上的癥狀：系統(tǒng)花葉。8圖B2TMV分離物接種至本氏煙上的癥狀：系統(tǒng)花葉，皺縮卷曲。圖B3BBWV分離物接種至普通煙上的癥狀：枯斑。B.2病毒的血清檢測植物葉片稱重后，按重量體積比1:10~1:50（g/ml）加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm離心3min；取100μL上清點入已包被抗體的酶標板中，室溫孵育2h；吸出樣本上清液，每孔點入300μLPBST，清洗（4~5次）；吸干酶標孔中PBST，點入100μL的堿性磷酸酶標記的二抗，室溫孵育2h；吸出樣本上清液，每孔點入300μLPBST，清洗（7~8次）；吸干酶標孔中PBST點入300μL1mg/ml的顯色底物PNPP，避光反應30min，待陽性對照顯色明顯后，使用酶標儀OD450nm讀數(shù)，為陰性對照讀數(shù)2倍以上的為陽性，2倍以下的為陰性，見圖B4。9圖B4TMV、CMV和BBWV分離物的DAS-ELISA檢測結果B.3分子生物學檢測B.3.1模板RNA的制備采用硅粒吸附法提取植物總RNA。取病葉0.1g，加1mLGB溶液，研磨至勻漿；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃溫育10min，不時上下顛倒混勻，冰上放置5min，13000rpm離心10min；取300μL上清，加150μL無水乙醇，300μLNaI，25μL硅溶液，混勻，室溫下不停顛倒混勻10min；6000rpm離心1min，倒去上清；加500μL洗滌液（WB:無水乙醇=1:1）洗滌，6000rpm離心1min，倒掉上清，重復該步驟；沉淀加ddH2O150μL，70℃溫育4min，1min后將離心管蓋打開，隨即蓋上；13000rpm離心3min，取上清100μL，-20℃保存。由于MDV為DNA病毒，需進行DNA提取。每份樣品選取10g葉片，將葉片置于液氮中，充分研磨后，按植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，加入BufferLP1和RNaseA，振蕩裂解，加入BufferLP2，12000rpm離心5min，取上清液，加入BufferLP3。加入吸附柱中，12000rpm離心1min。棄掉廢液，向收集管中加入BufferGW，12000rpm離心1min，重復1次。將吸附柱放入新離心管中，滴加100μLBufferGE，靜置5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩.3.2RT-PCR擴增（1）反轉錄以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機引物進行反轉錄，反轉錄合成cDNA，具體反應體系及步驟見表B1。表B1病毒反轉錄體系試劑體積TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover總體積20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存。（2）反應引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物見表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物病毒名稱（前引/后引）引物序列片段長度ATTTAAGTGGASGGAAAAV(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)（3）反應體系TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應體系見表B3表B3TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應體系試劑體積10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP酶0.3μLcDNA加水定容至20μL（4）反應程序TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應程序和MDV的PCR反應程序見表B4表B4TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應程序和MDV的PCR反應程序病毒名稱反應程序TMV94℃預變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。BBWV94℃預變性4min，94℃,45s；56℃,45s；72℃,1min30s，35個循環(huán)7min。CMVMDV94℃預變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。B.3.3瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5μL擴增反應物與2μLSYBRGreen?染料、3μLloadingbuffer混勻，點入樣孔內。電泳緩沖液1×TAE適量，100V，電泳30min。B.3.4目的片段的克隆與分析電泳結束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴增片段與預期目標條帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒，結果見圖B5、圖B6、圖B7和圖B8。圖B5豆科作物攜帶BBWV的檢測圖B6豆科作物攜帶CMV的檢測圖B7豆科作物攜帶TMV的檢測圖B8豆科作物攜帶MDV的檢測B.4病毒分子生物學檢測所用試劑如下：（1）GB溶液4.0M異硫氰酸胍0.2MNaAc(pH5.2)25mMEDTA(pH8.0)2.5%(W/V)PVP-40（2）10%NLS將1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。（3）WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaCl（4）NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3（5）硅溶液將60g二氧化硅溶于500mL水中，靜置24h，