T-SPPHN 003-2024 豆科蔬菜主要病毒病綜合防控技術(shù)規(guī)程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofIntegralPreventionTechnologyoftheEpidemicLegumeVegetable湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)發(fā)布I本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)提出。本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)歸口。本文件起草單位為湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、寧波大學(xué)、全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：劉勇、燕飛、張松柏、章東方、張卓、史曉斌、張德詠、孫書(shū)娥、嚴(yán)丹侃、鄭紅英、顧江濤、張海珊、張安盛、季英華、吳元華、李方方、何自福、劉慧、李凡。1豆科蔬菜主要病毒病綠色綜合防控技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豆科蔬菜主要病毒病的術(shù)語(yǔ)和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、防治原則、防治方法、加強(qiáng)病蟲(chóng)測(cè)報(bào)，實(shí)行統(tǒng)防統(tǒng)治、建立防治檔案等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等豆科蔬菜主要病毒病的綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4285農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T8321農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和定義GB/T35333和界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1綜合防控技術(shù)IntegratedPreventionandControlTechnology綜合防控是基于“預(yù)防為主、綜合防治”的植保方針，以確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全為目標(biāo)，以減少農(nóng)藥使用為目的，優(yōu)先采取生態(tài)調(diào)控、生物防治、物理防治和科學(xué)用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術(shù)來(lái)控制農(nóng)作物病蟲(chóng)害的植物保護(hù)措施。3.2豆科蔬菜LegumeVegetables豆科蔬菜主要包括豇豆、蠶豆、菜豆和豌豆等蔬菜。3.3病毒病VirusDisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、專(zhuān)一性或廣譜性等特性。3.4鑒別寄主DifferentialHost對(duì)特定病原物有特殊反應(yīng)或表現(xiàn)特定癥狀的植物稱(chēng)為鑒別寄主。3.5陽(yáng)性對(duì)照PositiveControl2凡是確定可以出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的處理，稱(chēng)為陽(yáng)性對(duì)照。3.6陰性對(duì)照NegativeControl凡是確定不會(huì)出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的處理，稱(chēng)為陰性對(duì)照。3.7空白對(duì)照BlankControl凡是不加處理因素的處理，稱(chēng)為空白對(duì)照。4發(fā)生流行規(guī)律豆科蔬菜病毒病主要由黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）、蠶豆萎蔫病毒（Broadbeanwiltvirus，BBWV）、紫云英矮縮病毒（Milkvetchdvirus，MDV）等病毒引起。常表現(xiàn)為多種病毒的混合侵染。CMV、TMV和BBWV均可由蚜蟲(chóng)或汁液接觸傳播，而MDV主要由蚜蟲(chóng)以持久方式進(jìn)行傳播。病毒可在多種植物上越冬，病殘?bào)w、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源。通過(guò)有翅蚜蟲(chóng)遷飛傳播擴(kuò)散蔓延，全年均可發(fā)病，以春秋季發(fā)病最為嚴(yán)重。整枝，打叉，搭架，采果等農(nóng)事活動(dòng)中，只要造成寄主微創(chuàng)口，即可侵入危害。此外，土壤瘠薄、黏重、板結(jié)、排水不良和偏施氮肥都會(huì)加重病情發(fā)展。5病害診斷5.1病害田間診斷豆科植物感染病毒后，癥狀表型多樣，主要有花葉斑駁、明脈皺縮、矮化等類(lèi)型癥狀。癥狀類(lèi)型參見(jiàn)附錄A。5.2生物學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。5.3血清學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。5.4分子生物學(xué)檢測(cè)具體方法和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附錄B。6防治原則根據(jù)豆科蔬菜病毒病和傳毒害蟲(chóng)的發(fā)生規(guī)律及危害特點(diǎn)，本著“預(yù)防為主，綜合防治”的指導(dǎo)思想，從農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)整體出發(fā)，保護(hù)生物多樣性，控制生產(chǎn)環(huán)境，減少病毒來(lái)源，優(yōu)先選擇農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治技術(shù)，盡量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。7防治方法37.1農(nóng)業(yè)防治7.1.1種植抗病品種根據(jù)各地栽培條件選用抗病品種。7.1.2留種設(shè)立無(wú)病留種田，在留種田淘汰病株，減少毒源，從無(wú)病優(yōu)質(zhì)的良種株上采集種子。7.1.3種子消毒播種前將種子在清水中浸泡（蠶豆浸泡2~3d，豌豆1d，菜豆3~4h，豇豆不能浸種），再放入10%磷酸三鈉溶液中浸種20～30min，撈出后用清水沖洗干凈后播種；選用30%噻蟲(chóng)嗪拌種；或者選用商品包衣種子。7.1.4合理輪作盡量避免與豆科作物重茬栽培，選用空茬地或倒茬地，與非豆科作物合理輪作。7.1.5田間衛(wèi)生清除田間及周邊雜草，加強(qiáng)肥水管理，及時(shí)摘除病葉，拔除病株。7.2物理防治7.2.1使用防蟲(chóng)網(wǎng)大棚豆科蔬菜選擇60目以上的防蟲(chóng)網(wǎng)。7.2.2色板誘殺對(duì)于矮桿豆科作物（豌豆、蠶豆等）可采用色板誘殺蚜蟲(chóng)，在田間放置30cm×40cm的誘蟲(chóng)黃板300~450塊/hm2，呈棋盤(pán)式均勻插置田間，黃板底部略高出植株頂端10~20cm左右，黃板粘滿害蟲(chóng)后及時(shí)更換。7.3藥劑防治藥劑使用應(yīng)符合GB4285和GB8321的相關(guān)規(guī)定。7.3.1病毒病防治病毒病防控以預(yù)防為主，當(dāng)病情指數(shù)≥5%時(shí)，選擇使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥進(jìn)行防治。由于豆科蔬菜，尤其是大棚內(nèi)種植，采收之前7~10d，必須停止用藥。防治病毒病常用藥劑的用量及用法見(jiàn)附錄C。7.3.2蚜蟲(chóng)防治抓好早治蚜連續(xù)治蚜，減少蟲(chóng)媒傳毒。當(dāng)蚜株率≥5%時(shí)，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，嚴(yán)禁使用禁用農(nóng)藥或高毒農(nóng)藥，防治蚜蟲(chóng)常用藥劑的用量及用法見(jiàn)附錄C。8加強(qiáng)病蟲(chóng)測(cè)報(bào)，實(shí)行統(tǒng)防統(tǒng)治4根據(jù)田間調(diào)查情況結(jié)合氣象因素分析，及時(shí)對(duì)病蟲(chóng)害進(jìn)行預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，當(dāng)病蟲(chóng)害達(dá)到影響經(jīng)濟(jì)閥值時(shí)，當(dāng)?shù)卣畱?yīng)組織種植戶對(duì)整片作物進(jìn)行科學(xué)的病蟲(chóng)害防治。9建立防治檔案在田間調(diào)查豆科病毒病發(fā)生情況時(shí)，具體調(diào)查內(nèi)容參見(jiàn)附錄D。5附錄A（資料性附錄）豆科蔬菜病毒病癥狀豇豆病毒病主要表現(xiàn)為花葉、明脈、矮縮等癥狀。以花葉癥狀最為常見(jiàn)，葉片受害后，在新葉上表現(xiàn)黃綠相間的花斑或不規(guī)則花葉；明脈型主要表現(xiàn)在葉片上，嫩葉初呈明脈、失綠或皺縮；矮縮型表現(xiàn)為葉片皺縮、卷葉，葉色濃綠，腋芽簇生，基本不能開(kāi)花結(jié)實(shí)，嚴(yán)重矮化，甚至整株死亡（圖A1）。圖A1豇豆病毒病癥狀蠶豆感病后表現(xiàn)褪綠花葉，葉片皺縮，葉脈黃化，植物矮小，少花，不結(jié)實(shí)或結(jié)實(shí)率低。生長(zhǎng)后期感病后，頂部葉片稍顯花葉，基部葉片正常；嚴(yán)重的頂部葉片向上合攏，呈現(xiàn)花葉、皺縮、卷曲癥狀（圖A2）。圖圖A4豌豆病毒病癥狀圖A2蠶豆病毒病癥狀菜豆感病后，表現(xiàn)花葉，葉片出現(xiàn)明脈、產(chǎn)生褪綠帶、斑駁或綠色部分凹凸不平，葉片皺縮、扭曲、畸形，株形矮小，開(kāi)花遲緩或落花，開(kāi)花結(jié)莢明顯減少，豆莢短?。▓DA3）。圖A3菜豆病毒病癥狀豌豆感病后常表現(xiàn)葉脈半透明、花葉、葉皺、小葉下卷、苗卷曲、早枯、節(jié)間縮短、株矮、結(jié)莢少或不結(jié)莢等癥狀（圖A4）。圖A4豌豆病毒病癥狀7（規(guī)范性附錄）豆科蔬菜病毒病生物學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)B.1病毒生物學(xué)檢測(cè)B.1.1病毒摩擦接種方法將少許感染病毒的病葉，放于研缽，加入適量接種緩沖液，充分研磨。用噴粉器將金剛砂（200~400目）撒到待接種葉的表面（也可直接將金剛砂加在研磨液中在營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)插上標(biāo)簽，注明處理及時(shí)間；用手指或研棒蘸取少許汁液，在待接種葉面上輕輕均勻地涂擦，沿一個(gè)方向抹，一般沿葉基到葉尖方向，涂擦?xí)r用另一只手指托住葉片，注意用手涂擦前需用肥皂洗凈手指；用清水沖洗接過(guò)種的葉片，將植株放于溫室（最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對(duì)照；將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液接種的方法接種于枯斑寄主上，待枯斑寄主表現(xiàn)單斑后，將單個(gè)斑點(diǎn)剪下，用接種緩沖液研磨再次接種至枯斑寄主，出現(xiàn)單斑癥狀后再次取下單斑接種于枯斑寄主，出現(xiàn)斑點(diǎn)后再取單個(gè)斑點(diǎn)接種于系統(tǒng)寄主，出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后再取葉片進(jìn)行保存和檢測(cè)。B.1.2病毒的保存與測(cè)定將經(jīng)過(guò)三次單斑純化后的毒源，再次接種至系統(tǒng)寄主上，待其出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后，取發(fā)病葉片冷凍干燥處理后，寫(xiě)明標(biāo)簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病毒分離物分別接種至病毒敏感植物上，觀察其癥狀（見(jiàn)圖B1、圖B2、圖B3）。圖B1CMV分離物接種至克氏煙上的癥狀：系統(tǒng)花葉。8圖B2TMV分離物接種至本氏煙上的癥狀：系統(tǒng)花葉，皺縮卷曲。圖B3BBWV分離物接種至普通煙上的癥狀：枯斑。B.2病毒的血清檢測(cè)植物葉片稱(chēng)重后，按重量體積比1:10~1:50（g/ml）加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm離心3min；取100μL上清點(diǎn)入已包被抗體的酶標(biāo)板中，室溫孵育2h；吸出樣本上清液，每孔點(diǎn)入300μLPBST，清洗（4~5次）；吸干酶標(biāo)孔中PBST，點(diǎn)入100μL的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h；吸出樣本上清液，每孔點(diǎn)入300μLPBST，清洗（7~8次）；吸干酶標(biāo)孔中PBST點(diǎn)入300μL1mg/ml的顯色底物PNPP，避光反應(yīng)30min，待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯后，使用酶標(biāo)儀OD450nm讀數(shù)，為陰性對(duì)照讀數(shù)2倍以上的為陽(yáng)性，2倍以下的為陰性，見(jiàn)圖B4。9圖B4TMV、CMV和BBWV分離物的DAS-ELISA檢測(cè)結(jié)果B.3分子生物學(xué)檢測(cè)B.3.1模板RNA的制備采用硅粒吸附法提取植物總RNA。取病葉0.1g，加1mLGB溶液，研磨至勻漿；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃溫育10min，不時(shí)上下顛倒混勻，冰上放置5min，13000rpm離心10min；取300μL上清，加150μL無(wú)水乙醇，300μLNaI，25μL硅溶液，混勻，室溫下不停顛倒混勻10min；6000rpm離心1min，倒去上清；加500μL洗滌液（WB:無(wú)水乙醇=1:1）洗滌，6000rpm離心1min，倒掉上清，重復(fù)該步驟；沉淀加ddH2O150μL，70℃溫育4min，1min后將離心管蓋打開(kāi)，隨即蓋上；13000rpm離心3min，取上清100μL，-20℃保存。由于MDV為DNA病毒，需進(jìn)行DNA提取。每份樣品選取10g葉片，將葉片置于液氮中，充分研磨后，按植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取DNA，加入BufferLP1和RNaseA，振蕩裂解，加入BufferLP2，12000rpm離心5min，取上清液，加入BufferLP3。加入吸附柱中，12000rpm離心1min。棄掉廢液，向收集管中加入BufferGW，12000rpm離心1min，重復(fù)1次。將吸附柱放入新離心管中，滴加100μLBufferGE，靜置5min，12000rpm離心1min，收集DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆?。B.3.2RT-PCR擴(kuò)增（1）反轉(zhuǎn)錄以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體反應(yīng)體系及步驟見(jiàn)表B1。表B1病毒反轉(zhuǎn)錄體系試劑體積TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover總體積20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存。（2）反應(yīng)引物TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物見(jiàn)表B2。表B2TMV、BBWV、CMV、MDV的特異性引物病毒名稱(chēng)（前引/后引）引物序列片段長(zhǎng)度ATTTAAGTGGASGGAAAAV(W=A或T；M=A/C；S=G/C,V=G/A)（3）反應(yīng)體系TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表B3表B3TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR和MDV的PCR反應(yīng)體系試劑體積10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP酶0.3μLcDNA加水定容至20μL（4）反應(yīng)程序TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應(yīng)程序和MDV的PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表B4表B4TMV、BBWV、CMV特異性RT-PCR反應(yīng)程序和MDV的PCR反應(yīng)程序病毒名稱(chēng)反應(yīng)程序TMV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。BBWV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；56℃,45s；72℃,1min30s，35個(gè)循環(huán)7min。CMVMDV94℃預(yù)變性4min，94℃,45s；55℃,45s；72℃,1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。B.3.3瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，取5μL擴(kuò)增反應(yīng)物與2μLSYBRGreen?染料、3μLloadingbuffer混勻，點(diǎn)入樣孔內(nèi)。電泳緩沖液1×TAE適量，100V，電泳30min。B.3.4目的片段的克隆與分析電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴(kuò)增片段與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，則為陽(yáng)性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒，結(jié)果見(jiàn)圖B5、圖B6、圖B7和圖B8。圖B5豆科作物攜帶BBWV的檢測(cè)圖B6豆科作物攜帶CMV的檢測(cè)圖B7豆科作物攜帶TMV的檢測(cè)圖B8豆科作物攜帶MDV的檢測(cè)B.4病毒分子生物學(xué)檢測(cè)所用試劑如下：（1）GB溶液4.0M異硫氰酸胍0.2MNaAc(pH5.2)25mMEDTA(pH8.0)2.5%(W/V)PVP-40（2）10%NLS將1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。（3）WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaCl（4）NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3（5）硅溶液將60g二氧化硅溶于500mL水中，靜置24h，