生物制藥工藝學(xué) 13章

生物制藥工藝學(xué)王曉杰

博士溫州醫(yī)科大學(xué)第十三章雙水相萃取技術(shù)

基本要求：掌握雙水相分離理論重點(diǎn)：雙水相的形成；相圖；物質(zhì)在兩相中的分配；雙水相提取胞內(nèi)酶的具體操作。難點(diǎn)：相圖第一節(jié)雙水相萃取概述過濾和離心技術(shù):固液分離微生物細(xì)胞器、除去細(xì)胞碎片、提取和濃縮胞內(nèi)物質(zhì)等操作。有機(jī)溶劑萃取:蛋白質(zhì)：（1）許多蛋白質(zhì)都有極強(qiáng)的親水性，不溶于有機(jī)溶劑；（2）蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑相中易變性失活。在一定條件下，水相也可以形成兩相（即雙水相系統(tǒng)）或多相。雙水相系統(tǒng):將水溶性的酶、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)從一個(gè)雙水相系統(tǒng)水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)水相中。聚合物的不相溶性，是一種普遍現(xiàn)象。其溶劑可以是水，也可以是有機(jī)溶劑。雙水相是由于聚合物分子的空間阻礙作用，相互間無法滲透，當(dāng)聚合物的濃度達(dá)到一定值時(shí)，就不能形成單一的水相，當(dāng)兩種聚合物在排斥力作用下達(dá)到平衡時(shí)，就形成了穩(wěn)定的兩相，兩種聚合物分別位于兩個(gè)互不相溶的兩相中。聚合物可以是天然或合成的，但必須具有親水性。某些聚合物的溶液與某些無機(jī)鹽的溶液可以形成雙相，即聚合物-鹽雙水相體系。一些有機(jī)溶劑和無機(jī)鹽也可以形成雙水相。雙水相萃取的優(yōu)點(diǎn)：（1）萃取操作條件比較溫和；（2）產(chǎn)品活性損失少，無有機(jī)溶劑殘留、污染；（3）萃取體系具有較好的可調(diào)性；（4）設(shè)備投資小，操作簡(jiǎn)單；（5）含水量高（70％～90％），適宜提取水溶性的蛋白質(zhì)、酶等生物活性物質(zhì)且不易引起蛋白質(zhì)的變性失活；（6）易于放大，各種參數(shù)可按比例放大而產(chǎn)物收率并不降低，這是其他分離技術(shù)無法比擬的。β―半乳糖苷酶不同純化方法的比較不同方法除去細(xì)胞碎片的比較注：(a)酶滯留比R=0；(b)酶滯留比0.7雙水相萃取的技術(shù)特征：（1）體系具有生物親和性雙水相體系水分含量高，操作條件溫和，分相時(shí)間短，對(duì)蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)無毒害，并有保護(hù)作用。（2）體系能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化生物反應(yīng)通常在一相中進(jìn)行，同時(shí)生成的產(chǎn)物被連續(xù)萃取到另一相中，既解決了產(chǎn)物反饋抑制的問題，而且，酶在高聚合物溶液中更穩(wěn)定。（3）體系能和細(xì)胞相結(jié)合：如和細(xì)胞破碎結(jié)合，即將細(xì)胞懸浮液中加入PEG和無機(jī)鹽，再進(jìn)入珠磨機(jī)進(jìn)行破碎，然后用離心機(jī)分相，既節(jié)約了萃取設(shè)備和時(shí)間，又可避免酶損失。（4）將親和萃取中的配體和聚合物結(jié)合，可以大大提高雙水相萃取的專一性。（5）將雙水相萃取和親和沉淀兩個(gè)單元操作合為一個(gè)過程，顯示高效和節(jié)能的優(yōu)勢(shì)。體系熵的增加熵的增加與分子數(shù)量有關(guān)，與分子大小無關(guān)。當(dāng)分子的物質(zhì)的量相同時(shí)，大分子與小分子間的混合，熵的增加是相同的。

分子間作用力。分子間的作用力看做分子中各基團(tuán)間相互作用力之和。分子量越大，分子間的作用力也越大，故大分子間的混合，分子間的作用力與熵相比，其決定混合效果。兩種被混合分子間，如存在空間排斥力，它們的線團(tuán)結(jié)構(gòu)無法相互滲透，則在達(dá)到平衡后就可能分成兩相，形成雙水相。雙水相的形成：幾種典型的雙水相系統(tǒng)備注選擇依據(jù)A聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯醇葡聚糖（Dex）羥丙基葡聚糖兩種非離子型聚合物雙水相系統(tǒng)的選擇原則：必須有利于目的物的萃取和分離，同時(shí)又要兼顧到聚合物的物理性質(zhì)。聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇葡聚糖（Dex）甲基纖維素B硫酸葡聚糖鈉鹽羧基甲基葡聚糖鈉鹽聚丙烯乙二醇甲基纖維素其中一種為帶電荷的聚電解質(zhì)C羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽兩種都為聚點(diǎn)解質(zhì)D聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨硫酸鈉硫酸鎂酒石酸鈉一種為聚合物，一種為鹽類PEG/Dex體系的相圖是一條雙節(jié)線。雙節(jié)線下方為一相區(qū)，雙節(jié)線上方即為兩相區(qū)，兩相分別有不同的組成和密度。上相組成用T表示，下相組成用B表示；上相主要含PEG，下相主要含Dex。兩相平衡時(shí)，VT、VB表示上相、下相體積C點(diǎn)為系統(tǒng)臨界點(diǎn)。

=VTVBBMMT二、相圖：雙節(jié)線的位置和形狀與聚合物的分子量有關(guān)。聚合物Dex的分子量越高，相分離所需的濃度越低；兩種聚合物分子量相差越大，雙節(jié)線的形狀越不對(duì)稱,如圖：三、物質(zhì)在兩相中的分配和溶劑萃取法一樣，物質(zhì)在兩水相中的分配用分配系數(shù)K表示。

CT、CB分別代表上相、下相中溶質(zhì)的濃度。K—與溫度、壓力以及溶質(zhì)和溶劑的性質(zhì)有關(guān)，與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。影響聚合物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的因素如下：

K=CTCB第三節(jié)影響雙水相萃取的因素分子或粒子在溶液中的分配，總是選擇兩相中相互作用最充分或系統(tǒng)能量達(dá)到最低的那個(gè)相。

lnK=－△E/kTLnK=Mr

λ/kT因大分子的Mr值很大，λ的微小改變就會(huì)引起分配系數(shù)K很大變化，故利用不同的表面性質(zhì)，可以達(dá)到分離大分子的目的。雙水相系統(tǒng)適合生物大分子的分離。1、表面自由能的影響2、表面電荷的影響如粒子帶有電荷，當(dāng)在兩相中分配不相等時(shí)，就會(huì)于相間產(chǎn)生電位，稱為道南電位：當(dāng)KAZ＋≠KBZ-時(shí)，U2-U1≠0如一種鹽的正負(fù)離子對(duì)兩相有不同親和力，則在相間產(chǎn)生點(diǎn)位。正負(fù)離子價(jià)之和越大，電位差越小。兩相系統(tǒng)中如有鹽存在，會(huì)對(duì)大分子在兩相中的分配產(chǎn)生較大的影響，這稱為鹽效應(yīng)。

3、綜合考慮綜合以上兩種影響分配系數(shù)的主要因素，可用Gerson提出的公式表示。-lgK=A△γ+δ△φ+β

大分子的表面積A都很大，△γ的微小變化都會(huì)引起蛋白質(zhì)大分子的分配系數(shù)產(chǎn)生很大變化；加入系統(tǒng)的鹽，以及體系的pH會(huì)影響相間電位差△φ和蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)δ，因而也對(duì)分配系數(shù)產(chǎn)生大的影響。

成相聚合物的分子量和濃度；體系的pH；體系中鹽的種類和濃度；體系中菌體或細(xì)胞的種類和濃度；體系溫度等。4、影響分配平衡的參數(shù)

（1）聚合物的影響

聚合物的平均分子量對(duì)分配率的影響；聚合物的濃度對(duì)分配率的影響。典型的PEG/Dex雙水相系統(tǒng)中，PEG分子量的減少，會(huì)使蛋白質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)明顯增大。成相聚合物的疏水性對(duì)酶等親水性物質(zhì)的分配產(chǎn)生較大的影響。同一聚合物的疏水性隨分子量的增加而增加，當(dāng)PEG的分子量增加時(shí)，在質(zhì)量濃度不變的情況下，其兩端羥基數(shù)目減少，疏水性增加，親水性的蛋白質(zhì)不再向富含PEG相中聚集，而轉(zhuǎn)向另一相。

Dex水解程度不同，對(duì)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)也有一定的影響(2)體系中無機(jī)鹽離子的影響在PEG/Dex體系中，無機(jī)鹽離子在兩相中也有不同的分配（表），因此在兩相間形成電位差。由于各相要保持電中性，使得帶電生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分別向兩相移動(dòng)分配。(3)體系pH的影響

pH影響蛋白質(zhì)中可離解基團(tuán)的離解度，因而改變蛋白質(zhì)所帶電荷和分配系數(shù)；pH還影響系統(tǒng)緩沖物質(zhì)磷酸鹽的離解程度，影響H2PO4-和HPO42-之間的比例，影響相間電位差U2-U1，從而影響分配系數(shù)。pH微小變化有時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)改變2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。對(duì)一特定的蛋白質(zhì)，在不同的鹽系統(tǒng)中，在等電點(diǎn)時(shí)，得到的均為不帶電時(shí)分子的分配系數(shù)。對(duì)不同的鹽系統(tǒng)，其等電點(diǎn)時(shí)的分配系數(shù)應(yīng)相等，兩條pH和分配系數(shù)關(guān)系的曲線必交于一點(diǎn)，該點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的pH為等電點(diǎn)。根據(jù)該原則測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法，稱為交錯(cuò)分配法。（4）體系溫度的影響溫度影響相圖，同時(shí)影響分配率和蛋白質(zhì)的生物活性。一般地，臨界點(diǎn)附近，溫度對(duì)分配率的影響較大，遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時(shí)，影響較小。分離后，上、下相的溫度上升不多。

對(duì)于同一種雙水相體系，微生物也會(huì)影響體系上下相的比例以及胞內(nèi)蛋白質(zhì)在體系中的分配系數(shù)。這種分配的差異主要是由細(xì)胞破碎程度引起的，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)也會(huì)導(dǎo)致體系上下比例的改變。（5）體系中微生物的影響K在細(xì)胞濃度>30%和S>20%時(shí)，其上下相的體積比例基本不變。隨著細(xì)胞濃度的增加，細(xì)胞破碎后釋放的內(nèi)含物的分配系數(shù)迅速下降。兩種酶隨著細(xì)胞濃度的增加，而分配系數(shù)下降。PEG是一種常見的絮凝劑和沉淀劑，在該體系中，細(xì)胞物質(zhì)的絮凝和在不同相中的分配同時(shí)發(fā)生。PEG的存在改變了物質(zhì)的溶解曲線。第四節(jié)雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用雙水相萃取主要應(yīng)用于胞內(nèi)酶的提取和精制。傳統(tǒng)胞內(nèi)酶的提?。杭?xì)胞破碎，離心除去細(xì)胞碎片。能耗大，細(xì)胞碎片難以去除干凈。一、雙水相萃取的工藝流程雙水相萃取的工藝流程一般包括三部分：（1）目的物的萃?。?）PEG的循環(huán)（3）無機(jī)鹽的循環(huán)雙水相萃取，應(yīng)滿足的條件：（1）欲提取的酶和細(xì)胞碎片應(yīng)分配在不同的相中；（2）酶的分配系數(shù)應(yīng)足夠大，使在一定的相體積比時(shí)，經(jīng)過一次萃取，就能得到較高的收率；（3）兩相用離心機(jī)很容易分離。在雙水相體系中，通常將目的蛋白質(zhì)分配在上相（PEG），而細(xì)胞碎片分配在下相（鹽）。因?yàn)槿绻舷喙绦挝锖扛?，?huì)使離心機(jī)的性能受到很大影響。PEG/鹽系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的提取，由于PEG價(jià)格低廉以及該系統(tǒng)的選擇性高于PEG/粗Dex系統(tǒng)。萃取操作時(shí)，單位重量相系統(tǒng)中勻漿液的加入量是一個(gè)重要的參數(shù)。一般每1kg萃取相系統(tǒng)以處理200~400g濕菌體為宜。使用PEG/鹽系統(tǒng)提取胞內(nèi)酶的步驟：（1）用PEG/鹽系統(tǒng)處理細(xì)胞勻漿液，細(xì)胞碎片能全部轉(zhuǎn)入下相（鹽相）；（2）在上相中加入適量鹽，進(jìn)行第二次雙水相萃取，除去核酸和多糖（下相），蛋白質(zhì)在上相PEG中；（3）第三次萃取，調(diào)節(jié)pH，使蛋白質(zhì)分配在鹽相（下相）中，與主體PEG分離；（4）鹽相中的蛋白質(zhì)用超濾法除去殘余的PEG，主體PEG可循環(huán)使用。二、雙水相提取胞內(nèi)酶的具體操作在7g/100mlPEG4000、1.25g/100ml粗Dex的體系中分離C.boidinii細(xì)胞培養(yǎng)液，提取甲酸脫氫酶（FDH）。由實(shí)驗(yàn)室10毫升試管規(guī)模放大到工業(yè)上50Kg菌體處理量的規(guī)模，其中分配系數(shù)是從實(shí)驗(yàn)室放大到工業(yè)規(guī)模的主要數(shù)據(jù)。放大過程中遇到的主要問題是含細(xì)胞碎片相的粘度問題和達(dá)到萃取平衡所需的時(shí)間以及相與相的分離問題。說明雙水相萃取法的分配系數(shù)K值重演性好。1、萃取和平衡雖然在高粘度的體系中，分子擴(kuò)散的速度降低，但是由于體系的表面張力很低，所以分配能在幾分鐘內(nèi)達(dá)到平衡。而且由于界面張力很小，則界面能低，攪拌時(shí)，只需較小的剪切力就能得到分散度很高的懸浮液，能耗小。2、上下相的分離分離基本上依靠?jī)煞N力：重力和離心力。前者為重力沉降，后者為離心分離。

由于PEG/鹽系統(tǒng)相對(duì)于PEG/Dex系統(tǒng)，其液滴直徑大，兩相之間密度差小、粘度低，而更適用重力沉降。一般沉降30~90min后，可以得到分層明顯的沉降物。重力沉降可用于任何規(guī)模的提取中，能耗低，易于自動(dòng)控制。由于PEG/Dex系統(tǒng)沉降時(shí)間過長(zhǎng)，難以用重力沉降法進(jìn)行，需用離心機(jī)分離。雙水相萃取中用于液液分離的離心機(jī)一般為碟片式離心機(jī)。澄清型離心機(jī)和分離型離心機(jī)。澄清型離心機(jī)用于懸浮液中的固、液相分離，適合雙水相單級(jí)萃取流程中第一次萃取后的上下相分離（下相粘度大，含有細(xì)胞碎片等固形物）。分離型離心機(jī)多用于分離輕重不同、互不相溶的兩種液體，適合于雙水相單級(jí)萃取流程中第二、三、四次等的分離。3、多聚物的分離如目的蛋白質(zhì)是分配在PEG富集的上相中時(shí)，當(dāng)相與相分離后，在上相中加入鹽，形成新的雙水相體系，在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)重新被萃取進(jìn)入鹽相，而大量的PEG得到回收，鹽相中少量殘余的PEG可用超濾或透析除去。一般用的PEG的分子量小于60000，可用此法分離分子量大于60000的蛋白質(zhì)。第五節(jié)雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展目的物含有少量的核酸和多糖，提高目的蛋白的純度，可從雙水相體系和萃取操作方式進(jìn)行改進(jìn)。1、PEG衍生物在PEG上引入親和基團(tuán)或離子基團(tuán)，在同樣的操作條件下，使用PEG衍生物，目的蛋白的得率和純度都有很大的提高。2、操作方式當(dāng)改變體系多聚物以提高體系選擇性，仍不能滿足目的產(chǎn)物純度和得率要求時(shí)，通常采用多級(jí)萃取。

雙水相萃取技術(shù)存在問題：（1）雙水相萃取技術(shù)還不十分成熟，技術(shù)上還沒有達(dá)到最佳操作。（2）常用的聚合物價(jià)格昂貴，開發(fā)新的聚合物是該技術(shù)急需解決的問題。思考題：1、交錯(cuò)分配法2、雙水相是怎樣形成的？簡(jiǎn)述雙水相萃取的基本原理及影響因素。3、雙水相中，上、下兩相的組分是不同的，但上、下兩相的密度是相同的，對(duì)嗎？4、圖7-2中，T、B各表示什么，BM、TM表示什么？5、交錯(cuò)分配法測(cè)