浙科版高考生物一輪復(fù)習(xí)熱點練8新情境下細胞工程的綜合應(yīng)用課件

熱點練(八)新情境下細胞工程的綜合應(yīng)用123451.(2024浙江稽陽聯(lián)誼學(xué)校聯(lián)考)番茄中含有豐富的番茄紅素,具有較高的營養(yǎng)價值,科研人員擬將抗寒基因(目的基因)轉(zhuǎn)入番茄紅素高表達番茄的核基因組中,培育具有抗寒性狀的番茄紅素高表達番茄,且研究抗寒基因的導(dǎo)入是否影響此番茄中番茄紅素的高表達。其基本過程包括目的基因的獲取并形成重組DNA、將重組DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌、受體材料的消毒、轉(zhuǎn)化番茄細胞、番茄細胞大量培養(yǎng)及番茄紅素的檢測、植株再生和抗寒性狀的鑒定等?；卮鹣铝袉栴}。12345(1)為了獲得目的基因,根據(jù)

的原理,在冰川凍土中尋找具有目的基因的細菌,提取并分離出抗寒基因;選用限制酶和DNA連接酶切割并連接形成重組DNA。限制酶選擇的依據(jù)有哪些?

。A.目的基因不能破壞B.質(zhì)粒上復(fù)制起點不能破壞C.酶切后的黏性末端能互補連接D.只能選擇一種限制酶進行切割(2)將重組DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌,并將受體菌接種在

(填“含”或“不含”)抗生素的培養(yǎng)液中,置于

上慢速培養(yǎng)一段時間,使CaCl2處理過的農(nóng)桿菌恢復(fù)細胞的正常狀態(tài),便于篩選。

生物與環(huán)境相適應(yīng)ABC含搖床12345(3)取番茄的幼嫩葉片,經(jīng)自來水沖洗,先用75%酒精浸泡,再用

浸泡,最后用無菌水沖洗,作為轉(zhuǎn)基因的受體材料。

(4)將消毒后的番茄葉片剪成小片,在導(dǎo)入目的基因的農(nóng)桿菌溶液中浸泡后,取出并轉(zhuǎn)移至添加有

的MS培養(yǎng)基,使小葉先脫分化形成愈傷組織,適度分化形成特定的番茄細胞并大量培養(yǎng),提取并檢測番茄紅素的含量,從而確定抗寒基因的導(dǎo)入是否影響番茄紅素的高表達。能影響細胞的生長速率和產(chǎn)物合成的因素有

(至少答出兩點)。

10%次氯酸鈉溶液適當(dāng)配比的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)溫度、pH、營養(yǎng)成分等12345(5)為了培育成植株,可將愈傷組織先后轉(zhuǎn)移至發(fā)芽培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基,進一步發(fā)育形成完整植株;也可將愈傷組織

,提取其中的胚性細胞發(fā)育形成

,經(jīng)培養(yǎng)可直接形成根、芽,從而快速形成試管苗。然后將上述試管苗在適宜的光照、溫度和80%以上的

等條件下進行煉苗后室外大量栽培。為了鑒定

,可提取葉片組織的DNA,采用PCR擴增技術(shù)。

液體懸浮培養(yǎng)胚狀體濕度目的基因是否導(dǎo)入了受體細胞12345(6)為研究轉(zhuǎn)基因番茄中抗寒基因是否成功表達,可有多種方法進行驗證:①取轉(zhuǎn)基因番茄的體細胞,進行低溫培養(yǎng)且

處理,再用

方法檢測抗寒蛋白是否存在;

②將轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株置于

環(huán)境中培養(yǎng),若

,基本能確定抗寒的番茄培育成功。破壁(“研磨”或“破碎”)抗原-抗體雜交低溫且相同轉(zhuǎn)基因植株存活率明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株12345解析

(1)在冰川凍土中有適應(yīng)寒冷環(huán)境的細菌,依據(jù)是生物與環(huán)境相適應(yīng)的原理。限制酶選擇的依據(jù)是不能將目的基因切斷;不能破壞質(zhì)粒上的復(fù)制起點,否則質(zhì)粒不能復(fù)制。酶切后的黏性末端能互補連接,否則質(zhì)粒和目的基因不能連接,可以選擇一種酶或產(chǎn)生相同黏性末端的不同酶切割,故選A、B、C。(2)將重組DNA導(dǎo)入農(nóng)桿菌,重組Ti質(zhì)粒上帶有抗生素抗性基因,將受體菌接種在含抗生素的培養(yǎng)液中,置于搖床上慢速培養(yǎng),農(nóng)桿菌是好氧菌,搖床有利于提供充足氧氣。(3)外植體(幼嫩葉片)需要消毒,先用75%酒精浸泡,再用10%次氯酸鈉溶液浸泡,殺死部分微生物,避免雜菌污染。12345(4)農(nóng)桿菌侵染后的番茄葉片,進行脫分化培養(yǎng),培養(yǎng)時需加入適當(dāng)配比的植物生長調(diào)節(jié)劑,誘導(dǎo)脫分化。能影響細胞的生長速率和產(chǎn)物合成的因素有培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH等。(5)可將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng),提取胚性細胞發(fā)育形成胚狀體,繼而發(fā)育成幼苗。煉苗時,提供適宜的光照、溫度和80%以上的濕度等條件。為了鑒定目的基因是否導(dǎo)入受體細胞,可用PCR擴增技術(shù),進行DNA分子雜交。(6)探究抗寒基因是否表達:①將轉(zhuǎn)基因番茄的體細胞低溫培養(yǎng)且去除細胞壁,再用抗原-抗體雜交技術(shù)檢測抗寒蛋白;②從個體水平檢測,將轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株置于低溫且相同環(huán)境中培養(yǎng),若轉(zhuǎn)基因植株存活率明顯高于非轉(zhuǎn)基因植株,則抗寒的番茄培育成功。123452.新型冠狀病毒是一種具有很強傳染能力的RNA病毒。快速、準(zhǔn)確地檢測新型冠狀病毒對病情的確診尤為重要,疫苗及藥物的研制等都離不開生物技術(shù)與工程的支持。(1)新冠核酸檢測采用實時熒光PCR技術(shù):通過咽拭子采集的樣本轉(zhuǎn)移至含病毒保存液的采樣管中。病毒RNA需要經(jīng)過

酶的作用生產(chǎn)cDNA,才能作為PCR的模板。

逆轉(zhuǎn)錄12345(2)效應(yīng)細胞毒性T細胞能識別被感染細胞表面的

。陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染,可能產(chǎn)生假陰性的因素有

。a.取樣太早,樣本中病毒量少,達不到實時熒光PCR檢測閾值b.樣本被污染,RNA酶將病毒RNA降解c.病毒發(fā)生變異(3)利用

技術(shù)將骨髓瘤細胞和

細胞相互融合形成

細胞,此細胞生產(chǎn)的抗新冠病毒的單克隆抗體,不僅可以用于對患者的治療,還能作為特異探針,利用

技術(shù)對人群進行檢測。

抗原-MHC復(fù)合體abc細胞融合/電脈沖誘導(dǎo)/激光融合B淋巴雜交瘤抗原-抗體雜交12345解析

(1)以病毒的RNA為模板合成cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄過程,需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用。(2)效應(yīng)細胞毒性T細胞表面含有針對抗原-MHC復(fù)合體的受體,因此效應(yīng)細胞毒性T細胞能識別被感染細胞表面的抗原-MHC復(fù)合體。利用實時熒光PCR技術(shù)檢測新型冠狀病毒的核酸,若檢測到新型冠狀病毒的核酸,則出現(xiàn)陽性反應(yīng)(出現(xiàn)熒光標(biāo)記),否則為陰性反應(yīng)。取樣太早,樣本中病毒量少,達不到實時熒光PCR檢測閾值;樣本被污染,RNA酶將病毒RNA降解;病毒發(fā)生變異等都可能導(dǎo)致檢測不到新型冠狀病毒的核酸,出現(xiàn)假陰性的結(jié)果,因此陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染。(3)利用細胞融合(或“電脈沖誘導(dǎo)”或“激光融合”)技術(shù)能夠使骨髓瘤細胞和B淋巴細胞相互融合,二者融合后形成的細胞為雜交瘤細胞。將抗新冠病毒的單克隆抗體作為特異探針,利用抗原-抗體雜交技術(shù)對人群進行檢測。123453.(2023浙江溫州第三次適應(yīng)性考試)水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一種蛋白質(zhì),是一種優(yōu)良的凝血酶抑制劑,在血栓治療上有著重要的醫(yī)學(xué)價值。已知天然水蛭素的抗凝血活性較低,產(chǎn)量和來源有限,某科研團隊擬通過一定的技術(shù)手段改造水蛭素基因,通過制備山羊乳腺生物反應(yīng)器獲得活性高、產(chǎn)量大的重組水蛭素?；卮鹣铝袉栴}。(1)水蛭素基因的改造:研究發(fā)現(xiàn),將水蛭素的第47位天冬酰胺替換為賴氨酸,可以提高其活性。通過建立功能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系,運用

工程對水蛭素分子進行改造,從預(yù)期的水蛭素功能出發(fā),設(shè)計水蛭素的

,推測出其氨基酸序列,再依據(jù)

推測出水蛭素基因的核苷酸序列,進而運用基因定點突變技術(shù)改造水蛭素基因。

蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)中心法則12345(2)水蛭素基因表達載體的構(gòu)建:應(yīng)用PCR技術(shù)對改造后的水蛭素基因進行擴增,在設(shè)計引物時,應(yīng)在引物5'端添加特定限制酶的識別序列,其目的是

。將水蛭素基因和表達載體用

酶處理獲得重組DNA分子。

便于將水蛭素基因與載體連接限制酶、DNA連接12345(3)山羊成纖維細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化:將無菌條件下采集制備的

(填“雌性”或“雄性”)山羊成纖維細胞懸液作為初始材料進行

培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后,加入胰蛋白酶使細胞松散,當(dāng)貼壁細胞趨于球形時加入過量新鮮培養(yǎng)液,目的是

。將帶有重組DNA分子的脂質(zhì)體與成纖維細胞共培養(yǎng),獲得含有目的基因的受體細胞。應(yīng)用PCR技術(shù)可精準(zhǔn)鑒定受體細胞中是否導(dǎo)入了水蛭素基因,若PCR反應(yīng)出現(xiàn)無擴增條帶的假陰性結(jié)果,可能的原因有哪幾項?

(A.反應(yīng)溫度不適宜B.引物量不夠C.模板量不夠D.重組DNA未導(dǎo)入)

雌性原代終止酶解反應(yīng)ABC12345(4)轉(zhuǎn)基因奶山羊的克隆:將成功轉(zhuǎn)化的成纖維細胞的核取出,移入去核的

細胞中,用電刺激后進行胚胎體外培養(yǎng),將早期胚胎移植到經(jīng)

處理的代孕母體子宮內(nèi),經(jīng)妊娠、分娩獲得轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊。(5)重組水蛭素的獲取和檢測:收集轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁,從中提取得到

,分子水平上采用

技術(shù)鑒定是否含有重組水蛭素,最后使用離子交換層析實現(xiàn)重組水蛭素的

。卵母同期發(fā)情蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交分離(純化)12345解析

(1)蛋白質(zhì)工程是通過修改基因或創(chuàng)造合成新基因來改變生物的遺傳和表達性狀,合成新的蛋白質(zhì),通過建立功能與結(jié)構(gòu)的聯(lián)系,運用蛋白質(zhì)工程對水蛭素分子進行改造。蛋白質(zhì)工程的一般流程為:從預(yù)期的水蛭素功能出發(fā),設(shè)計水蛭素的空間結(jié)構(gòu),推測出其氨基酸序列,再依據(jù)中心法則推測出水蛭素基因的核苷酸序列,進而運用基因定點突變技術(shù)改造水蛭素基因。(2)在設(shè)計引物時,應(yīng)在引物5'端添加特定限制酶的識別序列,其目的是便于將水蛭素基因與載體連接,使水蛭素基因能正確擴增。將水蛭素基因和表達載體用限制酶(切割目的基因和載體)和DNA連接酶(連接切割后的目的基因和載體)處理獲得重組DNA分子。12345(3)分析題意可知,本技術(shù)最終是通過制備山羊乳腺生物反應(yīng)器獲得活性高、產(chǎn)量大的重組水蛭素,需要從乳汁中獲取產(chǎn)品,故應(yīng)選擇雌性山羊成纖維細胞懸液作為初始材料進行原代培養(yǎng)(分瓶前的培養(yǎng));當(dāng)貼壁細胞趨于球形時加入過量新鮮培養(yǎng)液,目的是終止酶解反應(yīng)。PCR是一項通過控制反應(yīng)溫度實現(xiàn)擴增DNA的技術(shù),若反應(yīng)溫度不適宜,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,A項符合題意;PCR擴增過程中需要引物與模板通過堿基互補配對完成退火(復(fù)性)、延伸等過程,若引物量不夠或模板量不夠,可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,B、C兩項符合題意;分析題意可知,在用PCR擴增前,已獲得含有目的基因的受體細胞,不會出現(xiàn)重組DNA未導(dǎo)入的假陰性情況,D項不符合題意。12345(4)核移植技術(shù)過程中,需要將成功轉(zhuǎn)化的成纖維細胞的核取出,移入去核的卵母細胞中;將早期胚胎移植到經(jīng)同期發(fā)情處理(使其與供體有相同的生理狀態(tài))的代孕母體子宮內(nèi),經(jīng)妊娠、分娩獲得轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊。(5)分析題意可知,水蛭素是水蛭唾液腺分泌的一種蛋白質(zhì),故收集轉(zhuǎn)基因奶山羊乳汁,從中提取得到蛋白質(zhì);抗原與抗體的結(jié)合具有特異性,故分子水平上采用抗原-抗體雜交技術(shù)鑒定是否含有重組水蛭素,最后使用離子交換層析實現(xiàn)重組水蛭素的分離(純化)。123454.(2023浙江紹興一模)植酸又名肌醇六磷酸,通常不能被豬等單胃動物吸收,傳統(tǒng)的做法是在飼料中添加基因工程來源的外源性植酸酶,植酸酶能將植酸中的有機磷降解為動物可吸收的無機磷,不僅可提高豬的生長效率,還能降低豬糞對環(huán)境的污染?；卮鹣铝袉栴}。(1)培育生產(chǎn)植酸酶的轉(zhuǎn)基因酵母時,將酵母菌與重組質(zhì)粒共培養(yǎng)一段時間后,使用

法將培養(yǎng)物接種到含有特定抗生素的平板上進行篩選,再將平板上的

稀釋后,分別接種到含植酸的液體培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng),選取培養(yǎng)基中

含量低的酵母菌種。用于酵母菌擴大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基,與分離所用的平板相比,最主要的差別是

。涂布單菌落植酸未加入瓊脂12345(2)培育轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米時,由于農(nóng)桿菌難以感染單子葉植物細胞,通常需要先使用

法制備原生質(zhì)體,再進行顯微注射。原生質(zhì)體發(fā)育成試管苗的關(guān)鍵是培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的

。轉(zhuǎn)基因玉米的果穗、秸稈可直接制成復(fù)合飼料,免去了

所需的成本。

酶解種類和配比獲取植酸酶12345(3)近年來,科研人員又進行了以豬腮腺作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)內(nèi)源性分泌型植酸酶的研究。將無菌采集的豬胚胎組織建成胚胎成纖維細胞系,長滿培養(yǎng)瓶后的細胞需經(jīng)

后轉(zhuǎn)移到多個培養(yǎng)瓶進行傳代培養(yǎng)。將植酸酶基因?qū)肱咛コ衫w維細胞,使用的表達載體上需要具有綠色熒光蛋白EGFP基因以及豬腮腺分泌蛋白基因的啟動子和終止子,以便于

、

。收集EGFP表達陽性的細胞進行克隆,一部分細胞進行破碎后用限制酶切DNA,利用核酸分子雜交技術(shù)或PCR與

技術(shù)進行植酸酶基因鑒定,另一部分細胞用于轉(zhuǎn)基因克隆胚胎構(gòu)建。通過比較轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬糞便中

,可說明轉(zhuǎn)基因模型豬腮腺生物反應(yīng)器的表達效率。

分離并稀釋篩選成功導(dǎo)入重組DNA的胚胎成纖維細胞植酸酶基因在豬腮腺細胞中成功表達(凝膠)電泳磷含量12345解析

(1)酵母菌和重組質(zhì)粒用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)在一起,獲得轉(zhuǎn)基因酵母菌,使用涂布法將培養(yǎng)物接種到含有特定抗生素的平板上進行篩選,再將平板上的單菌落稀釋,進行擴大培養(yǎng);若轉(zhuǎn)植酸酶基因成功,酵母菌合成植酸酶,會使植酸被降解,因此植酸含量低的酵母菌植酸酶的含量高,為轉(zhuǎn)基因成功的酵母菌種。平板是固體培養(yǎng)基,需要加入瓊脂,液體培養(yǎng)基不需加入瓊脂。(2)使用纖維素酶和果膠酶可以降解植物細胞壁,獲得原生質(zhì)體,該方法稱為酶解法。原生質(zhì)體發(fā)育成試管苗用到植物組織培養(yǎng)技術(shù),其中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和比例影響較大。轉(zhuǎn)基因玉米含有植酸酶,其果穗、秸稈可直接制成復(fù)合飼料,免去了獲取植酸酶所需的成本。12345(3)動物細胞培養(yǎng)通常會有接觸抑制現(xiàn)象,長滿培養(yǎng)瓶后的細胞需經(jīng)分離(胰蛋白酶處理)并稀釋。表達載體上需要具有綠色熒光蛋白EGFP基因,以便篩選成功導(dǎo)入重組DNA的胚胎成纖維細胞,啟動子、終止子參與目的基因的表達。PCR可以對目的基因進行擴增,瓊脂糖凝膠電泳可以檢測目的基因的有無。若轉(zhuǎn)基因模型豬腮腺生物反應(yīng)器的表達效率較高,則植酸酶含量較高,可以將植酸中的有機磷降解為動物可吸收的無機磷,因此轉(zhuǎn)基因豬糞便中磷含量較低。123455.(2024浙江新陣地教育聯(lián)盟聯(lián)考)某DNA病毒對動物養(yǎng)殖業(yè)危害十分嚴(yán)重。研究人員擬以該病毒抗原蛋白A來制備單克隆抗體,以期快速檢測該病毒,其主要技術(shù)路線如圖所示。12345回答下列問題。(1)獲取基因A:用于制備蛋白A的基因稱為

,獲取該基因的常用方法是先建立

,用一定方法“釣取”相應(yīng)基因克隆片段后通過

技術(shù)擴增,擴增的原料是

。下列對引物的敘述,錯誤的是

。

A.兩個引物之間不應(yīng)有互補性B.引物自身不存在互補序列C.引物與模板鏈復(fù)制起始端堿基互補D.引物的堿基包含A、G、C、U四種目的基因基因組文庫PCRdNTPD12345(2)工程菌轉(zhuǎn)化:將工程菌放于低溫、低濃度的

溶液中,造成細胞膜通透性改變,成為

細胞,通過一定手段將外源DNA導(dǎo)入細胞完成轉(zhuǎn)化。

(3)篩選獲得雜交瘤細胞:在雜交瘤細胞篩選中,常使用特殊選擇培養(yǎng)基如

培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基對

和

兩類細胞的存活和繁殖具有抑制作用。

CaCl2感受態(tài)HAT未融合細胞同種核融合細胞12345(4)特定雜交瘤細胞的培養(yǎng)和單克隆抗體的篩選:特定雜交瘤細胞培養(yǎng)常用攪拌式發(fā)酵罐,培養(yǎng)時需注意控制如

等條件(寫出2點)。發(fā)酵罐中營養(yǎng)物質(zhì)通常需加入葡萄糖、氨基酸、激素、無機鹽和

,以及誘導(dǎo)抗體分泌的化學(xué)物質(zhì),如丁酸鈉。發(fā)酵罐內(nèi)細胞增殖形成

(填“細胞株”或“細胞系