過氧亞硝基傳感檢測的熒光探針合成與應用

背景介紹過氧亞硝基陰離子（ONOO-）是生物體內(nèi)許多病理過程的信號分子之一。在生理條件下，ONOO-的有效濃度一般維持在極低的水平，且壽命也極短，通常為10ms左右。小分子熒光探針具有靈敏度高、選擇性好、生物兼容性好等優(yōu)點，將其與熒光成像技術(shù)相結(jié)合，用于活細胞、活體中目標分子的識別、影像以及監(jiān)控目標分子動態(tài)變化，設計合成可特異性識別ONOO-的小分子熒光探針，并結(jié)合生物成像技術(shù)挖掘熒光探針在體內(nèi)ONOO-檢測與監(jiān)測依然是研究的熱點。文章亮點1.提供了一種基于硼酸酯為識別基團的小分子熒光探針TPE-BCO的合成方法，并考察了TPE-BCO用于體外ONOO-檢測的可行性及檢測條件；2.通過核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜表征了TPE-BCO的結(jié)構(gòu)，研究了TPE-BCO的光譜性質(zhì)，探討了TPE-BCO用于ONOO-檢測的響應機理；3.為用于ONOO-檢測的小分子熒光探針合成及其在ONOO-檢測中的應用提供了新思路。內(nèi)容介紹1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗方法1.2.1

TPE-BCO的合成在25mL的單口燒瓶中加入34.8mg（0.1mmol）1-（4-羥基苯）-1,2,2-三苯乙烯（TPE-OH）、34.8mg（1.45mmol）氫化鈉（NaH）以及5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），25

℃充分攪拌反應0.5h，隨后加入35.5mg（0.12mmol）4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯，繼續(xù)反應24h。將濾液在室溫下旋蒸至無溶劑，置于真空中干燥，得到除去溶劑的粗產(chǎn)品。用硅膠柱層析法（V（石油醚）∶V（CH2Cl2）=5∶2）分離純化粗產(chǎn)品，旋蒸后得到0.0274g純的探針TPE-BCO，產(chǎn)率78.4%。具體合成路線如圖1所示。1.2.2

溶液的配制ONOO-溶液的配制[32]：分別取1.5mL（0.7mol/L）H2O2溶液和1.5mL（0.6mol/L）HCl溶液于燒瓶中，快速混入3.0mL（0.6mol/L）NaNO2溶液和3.0mL（1.5mol/L）NaOH溶液，在室溫下快速攪拌得到ONOO-溶液。2

結(jié)果與討論2.1

TPE-BCO的紫外-可見吸收光譜通過掃描獲得了1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO的吸收光譜以及加入1.4×10-5

mol/L

ONOO-后的吸收光譜（圖2）。2.2

TPE-BCO的熒光光譜TPE-BCO的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖如圖3所示。為了便于比較，實驗同時掃描了TPE-OH的熒光光譜圖。2.3

TPE-BCO在PBS緩沖溶液中的穩(wěn)定性研究以330nm為激發(fā)波長，考察了

1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO在磷酸緩沖溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）中的穩(wěn)定性（圖4）。2.4

TPE-BCO用于ONOO-檢測的可行性研究2.4.1

響應時間實驗以1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO與

1.4×10-5mol/L

ONOO-在不同響應時間的熒光強度（λ=465nm）變化探討了反應時間對ONOO-檢測熒光強度信號的影響（圖5）。2.4.2

pH的影響pH是影響熒光強度的重要參數(shù)之一，實驗考察了pH4.0～10.0

的PBS緩沖溶液（0.01mol/L）中

1.0×10-5

mol/L

TPE-BCO與

1.4×10-5mol/L

的ONOO-的響應情況（圖6）。2.4.3

ONOO-的響應情況2.4.4

選擇性2.5

反應體系檢測ONOO-機理推測硼酸酯對過氧亞硝基等氧化自由基有良好的響應能力[33]。實驗發(fā)現(xiàn)，TPE-BCO與前驅(qū)體TPE-OH的熒光光譜基本重疊，但硼酸酯作為過氧亞硝基識別基團的引入降低了TPE-BCO的溶解度，增強了TPE-BCO的熒光強度。3

結(jié)論本文設計合成了以1-（4-羥基苯）-1,2,2-三苯乙烯為熒光部分，4-溴甲基苯硼酸頻哪醇酯為識別部分的熒光探針TPE-BCO，并對其與ONOO-的響應性能進行了研究。該探針最大發(fā)射波長為465nm，ONOO-對TPE-BCO的熒光有猝滅響應，TPE-BCO的熒光強度與0~7.0×10-5

mol/L

ONOO-的濃度符合指數(shù)函數(shù)關(guān)系（R2

=0.9949），在ONOO-濃度7.0×10-6~2.8×10-5

mol/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，T