菌種保藏技術(shù)（藥品生物檢定課件）

基因重組的概念：來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同細(xì)胞的基因（DNA）所發(fā)生的轉(zhuǎn)移和結(jié)合稱(chēng)為基因重組?；虻霓D(zhuǎn)移和重組大大增加了生物的遺傳多樣性。在微生物中，基因的傳遞可以使病毒將遺傳信息傳給細(xì)菌，使細(xì)菌致病性得以提高以及細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性等。另一方面人為的控制微生物的基因轉(zhuǎn)移和重組的研究成果有助于解決農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學(xué)問(wèn)題以及預(yù)防和治療傳染病的難題。本項(xiàng)目將介紹微生物基因轉(zhuǎn)移和重組的四種現(xiàn)象和機(jī)制。轉(zhuǎn)化受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。通過(guò)轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化因子指有轉(zhuǎn)化活性的外源DNA片段，它是供體菌釋放或人工提取的游離DNA片段。圖6.5轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖

接合

接合是通過(guò)供體菌和受體菌的直接接觸而產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過(guò)程。

細(xì)菌的接合現(xiàn)象在大腸桿菌中研究的最清楚。大腸桿菌有性別分化，決定它們性別的因子稱(chēng)為F因子。F因子是一種質(zhì)粒，在大腸桿菌中每個(gè)細(xì)胞含有約1～4個(gè)F因子。F因子既可脫離染色體在細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立存在，也可整合到染色體組上；它既可經(jīng)過(guò)接合作用而獲得，也可通過(guò)一些理化因素(如吖啶橙、絲裂霉素、利福平、溴化乙錠和加熱等)的處理而從細(xì)胞中消除。含有F因子的大腸桿菌稱(chēng)為F＋菌株，不含有F因子的大腸桿菌稱(chēng)為F－菌株。

F＋菌株可以與不含F(xiàn)因子的F－菌株接合，從而使后者也成為F＋菌株。其過(guò)程大體可分兩個(gè)階段：首先是F＋菌株與F－菌株配對(duì)，并通過(guò)性菌毛接合；然后F因子雙鏈DNA的一條單鏈在一特定的位置斷開(kāi)，通過(guò)性菌毛內(nèi)腔向F－菌株細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，并同時(shí)在兩個(gè)菌株細(xì)胞內(nèi)以一條DNA單鏈為模板，各自復(fù)制合成完整的F因子。F＋和F－接合示意圖轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)缺陷噬菌體的媒介，把供體細(xì)胞的小片段DNA攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)。由轉(zhuǎn)導(dǎo)作用而獲得部分新遺傳性狀的重組細(xì)胞，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象是由J.Lederberg等(1952年)首先在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中發(fā)現(xiàn)的。以后在許多原核微生物中都陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導(dǎo)，如大腸桿菌屬，芽孢桿菌屬，變形桿菌屬，假單胞菌屬，志賀氏菌屬和葡萄球菌屬等。轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象在自然界中比較普通，它在低等生物進(jìn)化過(guò)程中很可能是一種產(chǎn)生新基因組合的重要方式。一、普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過(guò)極少數(shù)完全缺陷噬菌體對(duì)供體菌基因組上任何小片段DNA進(jìn)行“誤包”，而將其遺傳性狀傳遞給受體菌的現(xiàn)象，稱(chēng)為普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體侵入寄主細(xì)胞后，通過(guò)復(fù)制和合成，亦將寄主DNA降解為許多小片段，進(jìn)入裝配階段。正常情況下，噬菌體將自身的DNA包裹在衣殼中，但也有異常的可能。它誤將寄主細(xì)胞DNA的某一片段包裹進(jìn)去。這樣的噬菌體稱(chēng)缺陷噬菌體。體內(nèi)僅含有供體DNA的缺陷噬菌體稱(chēng)完全缺陷噬菌體。體內(nèi)同時(shí)含有供體DNA和噬菌體DNA的缺陷噬菌體稱(chēng)為部分缺陷噬菌體。這種異常情況出現(xiàn)的概率很低（10-5～10-8)。由于噬菌體產(chǎn)生子代數(shù)量很多，所以這種異常情況的出現(xiàn)還是很多的。當(dāng)包裹有寄主DNA片段的噬菌體釋放后，再度感染新的寄主，其中的供體菌的DNA片段進(jìn)入受體菌，并通過(guò)基因重組使受體菌形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。二、局限轉(zhuǎn)導(dǎo)

局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)指通過(guò)部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并與后者的基因組整合、重組，形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子的現(xiàn)象。最初于1954年在大腸桿菌K12中發(fā)現(xiàn)。它只能轉(zhuǎn)導(dǎo)一種或少數(shù)幾種基因（一般為位于附著點(diǎn)兩側(cè)的基因）。原生質(zhì)體融合

通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程，稱(chēng)為原生質(zhì)體融合。由此法獲得的重組子，稱(chēng)為融合子。原核生物原生質(zhì)體融合研究是從20世紀(jì)70年代后期才發(fā)展起來(lái)的一種較有效的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移手段。

原生質(zhì)體融合的主要操作步驟是：先選擇兩株有特殊價(jià)值，并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿福ㄈ缂?xì)菌和放線菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應(yīng)酶處理）去除細(xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體（包括球狀體）進(jìn)行離心聚集，加入促融合劑PEG(聚乙二醇)或借電脈沖等因素促進(jìn)融合，然后用等滲溶液稀釋?zhuān)偻吭谀艽偈顾偕?xì)胞壁和進(jìn)行細(xì)胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。待形成菌落后，再通過(guò)影印平板法，把它接種到各種選擇性培養(yǎng)基平板上，檢驗(yàn)它們是否為穩(wěn)定的融合子，最后再測(cè)定其有關(guān)生物學(xué)性狀或生產(chǎn)性能。參見(jiàn)圖6.8、6.9。圖6.9原生質(zhì)體融合顯微觀察謝謝基因突變的概念基因突變是指遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生的可遺傳的變化。俠義的突變專(zhuān)指點(diǎn)突變，所謂點(diǎn)突變是指一個(gè)基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變，包括一對(duì)或少數(shù)幾對(duì)堿基的缺失、插入或置換，而導(dǎo)致的遺傳變化。廣義的突變包括點(diǎn)突變和染色體畸變，染色體畸變是指大段染色體的缺失、重復(fù)、倒位、易位。在微生物中，點(diǎn)突變是最常見(jiàn)、最易發(fā)生的一種突變現(xiàn)象。從自然界分離到的菌株一般稱(chēng)野生型菌株，或稱(chēng)野生型。野生型經(jīng)突變后形成的帶有新性狀的菌株，稱(chēng)突變株。基因突變的類(lèi)型1.營(yíng)養(yǎng)缺陷型某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長(zhǎng)因子、堿基或氨基酸的能力，因而無(wú)法在基本培養(yǎng)基（MM）上正常生長(zhǎng)繁殖的變異類(lèi)型，稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)缺陷型。它們可在加有相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基本培養(yǎng)基平板上選出。它的基因型常用所需營(yíng)養(yǎng)物的前三個(gè)英文小寫(xiě)斜體字母表示，例如hisC、tryA分表代表組氨酸缺陷型和色氨酸缺陷型，其中的大寫(xiě)字母C和A表示同一表型中不同基因的突變。相應(yīng)的表型則用HisC和TrgA表示。常用hisC-和hisC+分別表示缺陷型和野生型。營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳工程和育種等工作中十分有用。2.抗性突變型抗性突變型是指野生型菌株因發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對(duì)某化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性變異類(lèi)型，它們可在加有相應(yīng)藥物或用相應(yīng)物理因子處理的培養(yǎng)基平板上選出。抗性突變型普遍存在，例如對(duì)一些抗生素具抗藥性的菌株等。這類(lèi)突變類(lèi)型常用所抗藥物的前三個(gè)小寫(xiě)斜體英文字母加上“r”表示，如：strr和strs分別表示對(duì)鏈霉素的抗性和敏感性。在加有相應(yīng)抗生素的平板上，只有抗性突變能生長(zhǎng)，所以抗性突變型菌株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳育種和遺傳工程等研究中極其重要。

基因突變類(lèi)型3.條件致死突變型某菌株或病毒經(jīng)基因突變后，在原本可以生長(zhǎng)、繁殖的條件下卻無(wú)法生長(zhǎng)、繁殖，這種突變類(lèi)型稱(chēng)為條件致死突變型。其中最常用的是溫度敏感條件致死突變株，用ts（temperature-sensitive)表示，這類(lèi)突變株在特定溫度（28～35℃）下能夠增殖，在非特定溫度（37～40℃）下則不能生長(zhǎng)、繁殖，而野生型在兩種溫度均能增殖。顯然是由于在非特定溫度下，突變基因所編碼的蛋白缺乏其應(yīng)有功能。選育病毒ts株是制備疫苗的重要方法，現(xiàn)已從許多動(dòng)物病毒中分離出ts株，選擇遺傳穩(wěn)定性良好的品系用于制備減毒活疫苗，如流感病毒及脊髓灰質(zhì)炎病毒ts株疫苗。另外還通過(guò)條件致死突變株來(lái)研究那些生長(zhǎng)繁殖所必須的基因。4.形態(tài)突變型形態(tài)突變型是指由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的變異。例如，細(xì)菌的鞭毛或莢膜的有無(wú)，霉菌或放線菌的孢子有無(wú)或顏色變化，菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等的突變。5.抗原突變型抗原突變型是指由于基因突變引起的細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類(lèi)型，包括細(xì)胞壁缺陷變異（L型細(xì)菌等）、莢膜或鞭毛成分變異等。6.其它突變型如毒力、糖發(fā)酵能力、代謝產(chǎn)物的種類(lèi)和產(chǎn)量以及對(duì)某種藥物的依賴(lài)性等的突變型?；蛲蛔兊臋C(jī)制:基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的。一、自發(fā)突變

自發(fā)突變是指生物體在無(wú)人工干預(yù)下自然發(fā)生的低頻率突變。隨誘變機(jī)制的研究，對(duì)自發(fā)突變的原因已有所認(rèn)識(shí)，下面討論幾種自發(fā)突變的可能機(jī)制。1、背景輻射和環(huán)境因素的誘變

不少“自發(fā)突變”實(shí)質(zhì)上是由一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長(zhǎng)期的綜合效應(yīng)導(dǎo)致。例如充滿宇宙空間的各種短波輻射、高溫的誘變效應(yīng)以及自然界中普遍存在的一些低濃度的誘變物質(zhì)的作用等。2、微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變

過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物，它對(duì)脈孢菌具有誘變作用。這種作用可因同時(shí)加入過(guò)氧化氫酶而降低，如果同時(shí)再加入過(guò)氧化氫酶抑制劑，則又可提高突變率。這就說(shuō)明，過(guò)氧化氫可能是自發(fā)突變中的一種內(nèi)源誘變劑。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。

3、由DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起

據(jù)統(tǒng)計(jì)，DNA鏈每次復(fù)制中，每個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)誤配對(duì)的頻率是10-7～10-11，而一個(gè)基因平均約含1000bp，故自發(fā)突變頻率約為10-6。因此，若對(duì)細(xì)菌做一般液體培養(yǎng)時(shí)，因其細(xì)胞濃度常可達(dá)到108個(gè)/ml，故經(jīng)常會(huì)在其中產(chǎn)生自發(fā)突變株。基因突變的規(guī)律1、不對(duì)應(yīng)性

即突變的性狀與引起突變的原因間無(wú)直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。例如，細(xì)菌在有青霉素的環(huán)境下，出現(xiàn)了抗青霉素的突變體；在紫外線的作用下，出現(xiàn)了抗紫外線的突變體；在較高的培養(yǎng)溫度下，出現(xiàn)了耐高溫的突變體等。從表面上看，會(huì)認(rèn)為正是由于青霉素、紫外線或高溫的“誘變”，才產(chǎn)生了相對(duì)應(yīng)的突變性狀。事實(shí)恰恰相反，這類(lèi)性狀都可通過(guò)自發(fā)的或其他任何誘變因子誘發(fā)得到。這里的青霉素、紫外線或高溫僅是起著淘汰原有非突變型(敏感型)個(gè)體的作用。

2、自發(fā)性

由于自然界環(huán)境因素的影響和微生物內(nèi)在的生理生化特點(diǎn)，在沒(méi)有人為誘發(fā)因素的情況下，各種遺傳性狀的改變可以自發(fā)地產(chǎn)生。3、稀有性

指自發(fā)突變的頻率較低，而且穩(wěn)定，一般在10-6～10-9

間。4、獨(dú)立性

突變的發(fā)生一般是獨(dú)立的，即在某一群體中，既可發(fā)生抗青霉素的突變型，也可發(fā)生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性。某一基因的突變，即不提高也不降低其他任何基因的突變率。突變不僅對(duì)某一細(xì)胞是隨機(jī)的，且對(duì)某一基因也是隨機(jī)的。5、可誘變性

通過(guò)各種物理、化學(xué)誘變劑的作用，可提高突變率，一般可提高10～105倍。6、穩(wěn)定性

由于突變的根源是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)上發(fā)生了穩(wěn)定的變化，所以產(chǎn)生的新性狀也是穩(wěn)定的和可遺傳的。7、可逆性

由原始的野生型基因變異為突變型基因的過(guò)程稱(chēng)為正向突變，相反的過(guò)程則稱(chēng)為回復(fù)突變。實(shí)驗(yàn)證明，任何性狀既有可能正向突變，也有可能發(fā)生回復(fù)突變，兩者發(fā)生的頻率基本相同。謝謝一、菌種的衰退（一）菌種衰退的現(xiàn)象

菌種衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。菌種衰退的具體表現(xiàn)有以下幾個(gè)方面。

1.菌落和細(xì)胞形態(tài)改變每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下都有一定的形態(tài)特征，如果典型的形態(tài)特征逐漸減少，就表現(xiàn)為衰退。例如，涇陽(yáng)鏈霉菌“5406”的菌落原來(lái)為凸形變成了扇形、帽形或小山形；孢子絲由原來(lái)螺旋形變成波曲形或直形，孢子從橢圓形變成圓柱形等。2.生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少

例如，“5406”的菌苔變薄，生長(zhǎng)緩慢（半個(gè)月以上才長(zhǎng)出菌落），不產(chǎn)生豐富的橘紅色的孢子層，有時(shí)甚至只長(zhǎng)些黃綠色的基內(nèi)菌絲。

3.代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力的下降，即出現(xiàn)負(fù)突變

例如，黑曲霉糖化力、放線菌抗生素發(fā)酵單位的下降以及各種發(fā)酵代謝產(chǎn)物量的減少等，在生產(chǎn)上是十分不利的。

4.致病菌對(duì)宿主侵染能力下降

例如白僵菌對(duì)宿主致病能力的降低等。

5.對(duì)外界不良條件（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）抵抗能力的下降等

例如抗噬菌體菌株變?yōu)槊舾芯甑取＃ǘ┚N衰退的原因

菌種衰退不是突然發(fā)生的，而是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），不會(huì)使群體菌株性能發(fā)生改變。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因有以下幾方面。

1.基因突變菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的頻率很低（一般為10-6～10-9），尤其是對(duì)于某一特定基因來(lái)說(shuō)，突變頻率更低。但是由于微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細(xì)胞的數(shù)目就會(huì)不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，最終成為一株衰退了的菌株。表型延遲現(xiàn)象也會(huì)造成菌種衰退。例如在誘變育種過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了。質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)?？刂频?。當(dāng)菌株細(xì)胞由于自發(fā)突變或外界條件影響（如高溫），致使控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一致，即DNA復(fù)制速度超過(guò)質(zhì)粒，經(jīng)多次傳代后，某些細(xì)胞中就不具有對(duì)產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這類(lèi)細(xì)胞數(shù)量不斷提高達(dá)到優(yōu)勢(shì)，則菌種表現(xiàn)為衰退。2.連續(xù)傳代連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變（尤其是負(fù)突變）的概率越高；另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個(gè)別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢(shì)越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。3.不適宜的培養(yǎng)和保藏條件不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH、通氣量等和保藏條件如營(yíng)養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會(huì)誘發(fā)衰退型細(xì)胞的出現(xiàn)，還會(huì)促進(jìn)衰退細(xì)胞迅速繁殖，在數(shù)量上大大超過(guò)正常細(xì)胞，造成菌種衰退。（三）菌種衰退的防止根據(jù)菌種衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要從以下幾方面考慮。1.控制傳代次數(shù)意即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的發(fā)生率。一套良好的菌種保藏方法可大大減少不必要的移種和傳代次數(shù)。2.創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個(gè)適合原種的良好培養(yǎng)條件，可以防止菌種衰退。如培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株時(shí)應(yīng)保證適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成分，尤其是生長(zhǎng)因子；培養(yǎng)一些抗性菌時(shí)應(yīng)添加一定濃度的藥物于培養(yǎng)基中,使回復(fù)的敏感型菌株的生長(zhǎng)受到抑制，而生產(chǎn)菌能正常生長(zhǎng)；控制好碳源、氮源等培養(yǎng)基成分和pH、溫度等培養(yǎng)條件，使之有利于正常菌株生長(zhǎng)，限制退化菌株的數(shù)量，防止衰退。例如，利用菟絲子的種子汁培養(yǎng)“魯保一號(hào)”真菌可防止其退化；在赤霉素生產(chǎn)菌藤倉(cāng)赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等豐富營(yíng)養(yǎng)物時(shí)，也有防止菌種衰退的效果；此外，將培養(yǎng)棲土曲霉（Aspergillusterricola）3.942的溫度從28℃～30℃提高到33℃～34℃，可防止其產(chǎn)孢子能力的衰退。3.利用不易衰退的細(xì)胞移種傳代在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含幾個(gè)細(xì)胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時(shí)，就不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象。在實(shí)踐中，若用滅過(guò)菌的棉團(tuán)輕巧地對(duì)放線菌進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如構(gòu)巢曲霉）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。（三）菌種衰退的防止4.采用有效的菌種保藏方法有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退的極其必要的措施。在實(shí)踐中，應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性的選擇菌種保藏的方法。例如，啤酒釀造中常用的釀酒酵母，保持其優(yōu)良發(fā)酵性能最有效的保藏方法是-70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，若采用對(duì)于絕大多數(shù)微生物保藏效果很好的冷凍干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。一般斜面冰箱保藏法只適用于短期保藏，而需要長(zhǎng)期保藏的菌種，應(yīng)當(dāng)采用砂土管保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法。對(duì)于比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。工業(yè)生產(chǎn)用菌種的主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類(lèi)性狀恰是最易衰退的。即使在較好的保藏條件下，還是存在這種情況。例如鏈霉素產(chǎn)生菌——灰色鏈霉菌的菌種保藏即使是用冷凍干燥保藏法等現(xiàn)今較好的方法，還是會(huì)出現(xiàn)這類(lèi)情況。由此說(shuō)明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌種的衰退。5.講究菌種選育技術(shù)在菌種選育時(shí)，應(yīng)盡量使用單核細(xì)胞或孢子，并采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力，避免表型延遲現(xiàn)象。同時(shí)，在誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌種的純度。6.定期進(jìn)行分離純化定期進(jìn)行分離純化，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。此方法將在菌種復(fù)壯部分介紹。二、菌種的復(fù)壯（一）復(fù)壯概念

從菌種衰退的本質(zhì)可以看出，通常在已衰退的菌種中存在有一定數(shù)量尚未衰退的個(gè)體。狹義的復(fù)壯是指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和測(cè)定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。廣義的復(fù)壯是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測(cè)定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。（二）菌種復(fù)壯的主要方法

1.純種分離法通過(guò)純種分離，可將衰退菌種細(xì)胞群體中一部分仍保持原有典型性狀的單細(xì)胞分離出來(lái)，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，就可恢復(fù)原菌株的典型性狀。常用的分離純化的方法可歸納成兩類(lèi)：一類(lèi)較粗放，只能達(dá)到“菌落純”的水平，即從種的水平來(lái)說(shuō)是純的。例如采用稀釋平板法、涂布平板法、平板劃線法等方法獲得單菌落。另一類(lèi)是較精細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法。它可以達(dá)到“細(xì)胞純”即“菌株純”的水平。

2.宿主體內(nèi)復(fù)壯法對(duì)于寄生性微生物的衰退菌株，可通過(guò)接種到相應(yīng)昆蟲(chóng)或動(dòng)植物宿主體內(nèi)來(lái)提高菌株的毒性。例如，蘇云金芽孢桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期人工培養(yǎng)會(huì)發(fā)生毒力減退、殺蟲(chóng)率降低等現(xiàn)象，可用退化的菌株去感染菜青蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，然后再?gòu)牟∷赖南x(chóng)體內(nèi)重新分離典型菌株。如此反復(fù)多次，可提高菌株的殺蟲(chóng)率。根瘤菌屬經(jīng)人工移接,結(jié)瘤固氮能力減退,將其回接到相應(yīng)豆科宿主植物上,令其侵染結(jié)瘤,再?gòu)母鲋蟹蛛x出根瘤菌,其結(jié)瘤固氮性能就可恢復(fù)甚至提高。3.淘汰法

將衰退菌種進(jìn)行一定的處理（如藥物，低溫、高溫等），往往可以起到淘汰已衰退個(gè)體而達(dá)到復(fù)壯的目的。如有人曾將“5406”的分生孢子在低溫（-10℃～-30℃）下處理5d～7d，使其死亡率達(dá)到80％，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗低溫的存活個(gè)體中留下了未退化的健壯個(gè)體。

4.遺傳育種法

即把退化的菌種，重新進(jìn)行遺傳育種，從中再選出高產(chǎn)而不易退化的穩(wěn)定性較好的生產(chǎn)菌種。謝謝一、斜面低溫保藏法規(guī)程

1.材料和工具(1)待保藏菌種細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌種。(2)無(wú)菌培養(yǎng)基試管斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏細(xì)菌)，麥芽汁培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏酵母),高氏1號(hào)培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏放線菌)。(3)工具接種環(huán)、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等。2.操作(1)貼標(biāo)簽取裝有各種培養(yǎng)基的無(wú)菌試管斜面各3支，將寫(xiě)有菌株名稱(chēng)、接種人和接種日期的標(biāo)簽貼在試管斜面的正上方，距試管口2-3cm處。(2)接種在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取待保藏的斜面菌種，以無(wú)菌操作法移接至相應(yīng)的無(wú)菌培養(yǎng)基試管斜面上(在培養(yǎng)基斜面上劃線移接)。(3)培養(yǎng)將移接好的細(xì)菌斜面置于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)18~24h,酵母菌斜面置于28~30℃培養(yǎng)36~60h,放線菌和絲狀真菌斜面置于28℃培養(yǎng)4~7天。(4)保藏試管斜面長(zhǎng)好后，可直接放人4℃冰箱保藏。為防止棉塞受潮長(zhǎng)雜菌，管口棉花應(yīng)用牛皮紙包扎，或換上無(wú)菌膠塞，亦可用熔化的固體石蠟熔封棉塞或膠塞。3.注意事項(xiàng)(1)細(xì)菌和酵母菌宜采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，而放線菌和絲狀真菌宜采用成熟的孢子。(2)挑菌時(shí)只需用接種環(huán)前端在菌苔上部刮取少量菌體，接種時(shí)用含菌的前端在待接斜面培養(yǎng)基表面輕輕摩擦，線條流暢，切不可亂劃、劃破培養(yǎng)基。(3)接種過(guò)程中，接種工具、試管、試管塞不能放到臺(tái)面上，一直拿在手中。接種環(huán)自菌種管轉(zhuǎn)移至斜面過(guò)程中，切勿通過(guò)火焰或接觸其他物品，以防接種失敗或污染雜菌。隨時(shí)進(jìn)行接種器具的灼燒滅菌。(4)保藏溫度不宜過(guò)低，否則斜面培養(yǎng)基因結(jié)冰、脫水而加速菌種的死亡。

酵母菌、霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌可保存2-6個(gè)月，不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌最好每月移種一次。二、液體石蠟保藏法1.材料和工具(1)待保藏菌種細(xì)菌、酵母菌、放線菌和霉菌斜面菌種。(2)無(wú)菌培養(yǎng)基試管斜面牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏細(xì))、麥芽汁培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏酵母)，高氏1號(hào)培養(yǎng)基試管斜面3支(保藏放線菌)。(3)試劑和器材液體石蠟、250ml三角瓶、接種環(huán)、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌滴管、高壓蒸汽滅菌鍋。2.操作(1)液體石蠟滅菌

在250ml三角燒瓶中裝人100ml液體石蠟，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎，121℃濕熱滅菌30min,連續(xù)滅2次，然后于40℃溫箱中放置14天(或量于105-110℃烘箱中1h),以除去石蠟中的水分，備用。(2)接種培養(yǎng)同斜面保藏法接種操作。(3)加液體石蜻用無(wú)菌滴管吸取液體石蠟以無(wú)菌操作加到已長(zhǎng)好的菌種斜面上，加入量以高出斜面頂端約lcm為宜。

(4)保藏棉塞外包牛皮紙，將試管直立放置于4℃冰箱中保存。(5)恢復(fù)培養(yǎng)用接種環(huán)從液體石蠟下挑取少量菌種，在試管壁上輕靠幾下，盡量使油滴凈，再接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由于菌體表面粘有液體石蠟，生長(zhǎng)較慢且有粘性，故一般須轉(zhuǎn)接2次才能獲得良好菌種。3.注意事項(xiàng)（1）從液體石蠟封藏的菌種管中挑菌后，接種環(huán)上帶有油和菌，故接種環(huán)在火焰上滅菌時(shí)先在火焰邊烤干再直接灼燒，以免菌液四濺，引起污染。（2）利用這種保藏方法，霉菌、放線菌、有芽孢細(xì)菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1-2年，一般無(wú)芽孢的細(xì)菌也可保藏1年左右。

三、沙土管保藏

1.材料和工具(1)菌種產(chǎn)芽孢細(xì)菌、形成孢子的放線菌和霉菌斜面菌種。(2)培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。(3)試劑和器材液體石蠟、P205或CaCl2、10%HCI、無(wú)菌水、甘油、河沙、瘦黃土(有機(jī)物含量少的黃土)。無(wú)菌試管10支、5ml無(wú)菌吸管、1ml無(wú)菌吸管、接種環(huán)、40目及100目篩子、干燥器、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋。2.操作（1）沙土處理①沙處理取河沙經(jīng)40目過(guò)篩，去除大顆粒，加10%HC浸泡(用量以浸沒(méi)砂面為宜)2-4h(或煮沸30min)，以除去有機(jī)雜質(zhì)，然后倒去鹽酸，用清水沖洗至中性，烘干或曬干，備用。②土處理取非耕作層瘦黃土(不含有機(jī)質(zhì))，加自來(lái)水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性，然后烘干粉碎，用100目過(guò)篩，去除粗顆粒后備用。（2）裝沙土管將沙與土按2:1、3:1或4：1

(W/W)比例混合均勻裝人試管中后干燥（3）無(wú)菌試驗(yàn)任取一支試管中少許沙土放入牛肉膏蛋白胨或麥芽計(jì)培養(yǎng)液中，在最適的溫下培養(yǎng)2~4天，確定無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)才可使用。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，經(jīng)從新滅菌后，再做無(wú)菌試驗(yàn)，直到合格。（4）制備菌液用5ml無(wú)菌吸管分別吸取3ml無(wú)菌水至待保藏的菌種斜面上，用接種環(huán)輕輕攪動(dòng)，制成懸液。（5）加樣用1ml吸管吸取上述菌懸液0.1-0.5ml加入沙土管中，用接種環(huán)拌勻。加入菌液量以濕潤(rùn)沙土達(dá)2/3高度為宜。

（6）將含菌的沙土管放入真空干燥器中，干燥器內(nèi)用培養(yǎng)皿盛p2o5作為干燥劑，可再用真空泵連續(xù)抽氣3-4h，加速干燥。將沙土管輕輕一拍，沙土呈分散狀即達(dá)到充分干燥。（7）保藏沙土管可選擇下列方法之一來(lái)保藏。①保存于干燥器中；②用石蠟封住棉花塞后放人冰箱保存；③將沙土管取出，管口用火焰熔封后入冰箱保存；④將沙土管裝入有Cacl2等干燥劑的大試管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蠟封口，放人冰箱中或室溫下保存。（8）恢復(fù)培養(yǎng)使用時(shí)挑少量混有抱子的沙土，接種于斜面培養(yǎng)基上，或液養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)即可，原沙土管仍可繼續(xù)保藏。謝謝

一、菌種保藏的目的和原理

微生物菌種資源是自然資源的重要組成部分，是生物多樣性的重要體現(xiàn)，也是微生物科學(xué)研究、教學(xué)及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)建設(shè)中發(fā)揮重要作用。微生物菌種收集、整理、保藏是一項(xiàng)基礎(chǔ)性、公益性工作，微生物資源的收集和保藏具有重要意義，可以為科技工作者從事科研活動(dòng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為政府決策提供依據(jù)。微生物純培養(yǎng)的收集、分類(lèi)和管理，兼具活標(biāo)本館、基因庫(kù)的作用。1、菌種保藏的目的

廣泛收集在科學(xué)研究與生產(chǎn)中有價(jià)值的菌種；研究它們的生物學(xué)特性；研究和采取妥善的保藏方法，使菌種不死、不污染并盡可能少發(fā)生變異；編制菌種目錄，為掌握和利用微生物資源提供依據(jù)。

2、菌種保藏的原理

選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和菌齡，以便得到健壯的細(xì)胞或孢子；保藏于低溫、隔氧、干燥、避光的環(huán)境中，盡量降低或停止微生物的代謝活動(dòng)，減慢或停止生長(zhǎng)繁殖；不被雜菌污染，在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持著活力。3、菌種保藏的要求

應(yīng)針對(duì)保藏菌株確定適宜的保藏方法；同一菌株應(yīng)選用兩種或兩種以上方法進(jìn)行保藏；只能采用一種保藏方法的菌株或細(xì)胞株必須備份并存放于兩個(gè)以上的保藏設(shè)備中；菌種保藏方法參照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；菌種的入庫(kù)和出庫(kù)應(yīng)記錄入檔，實(shí)行雙人負(fù)責(zé)制管理；重要菌種應(yīng)異地保藏備份；高致病性病原微生物和專(zhuān)利菌種應(yīng)由國(guó)家指定的保藏機(jī)構(gòu)保藏；菌種保藏設(shè)施應(yīng)確保正常運(yùn)行，設(shè)專(zhuān)人負(fù)責(zé)管理，定期檢修維護(hù)；菌種保藏設(shè)施應(yīng)有備用電源，防止斷電事故發(fā)生；保藏機(jī)構(gòu)要定期檢查菌種保藏效果，有污染或退化跡象時(shí)，要及時(shí)分離純化復(fù)壯；每次檢查要有詳細(xì)記錄。二、菌種保藏的方法及特點(diǎn)1、斜面低溫保藏法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長(zhǎng)完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。此法廣泛適用于細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個(gè)月左右，無(wú)芽孢的細(xì)菌可保存1個(gè)月左右，酵母菌可保存3個(gè)月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長(zhǎng)。此法由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時(shí)也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對(duì)經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。其缺點(diǎn)是菌株仍有一定程度的代謝活動(dòng)能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。2、石蠟油封藏法此法是在無(wú)菌條件下，將滅過(guò)菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無(wú)毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會(huì)干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長(zhǎng)。這種方法操作簡(jiǎn)單，它適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對(duì)霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長(zhǎng)達(dá)10年。但對(duì)很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類(lèi)的菌種。有試驗(yàn)指出，此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％；也有報(bào)道顯示，某些蕈菌菌絲用石蠟油保藏法，在3～6℃保藏時(shí)菌絲易于死亡，而在室溫下反而較理想，這是值得注意的。3、砂土管保藏法這是一種常用的長(zhǎng)期保藏菌種的方法，適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌，對(duì)于一些對(duì)干燥敏感的細(xì)菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。其制作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘干、過(guò)篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)﹕1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.