谷物中功能性成分的提取分離方法

關(guān)于谷物中功能性成分的提取分離方法細胞破碎的作用和方法第一節(jié)細胞破碎作用方法機械液體剪切超聲波機械攪拌壓力固體剪切研磨桿和臼球磨機壓力Hughes壓榨機‘X’壓榨機非機械脫水空氣干燥真空干燥冷凍干燥溶劑干燥溶胞作用物理作用滲透沖擊壓力釋放凍結(jié)和融化化學(xué)作用陽陰離子洗滌劑抗生素甘氨酸酶作用溶菌酶和有關(guān)的酶噬菌體溶胞抗菌素第2頁,共33頁，星期六，2024年，5月機械破碎高速組織搗碎高速勻漿球磨化學(xué)方法，酶學(xué)破碎物理破碎利用溫度差利用壓力差超聲波第3頁,共33頁，星期六，2024年，5月利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一個相是固定的，稱固定相，另一個相是流動的，稱為流動相，當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達到分離的目的。第二節(jié)色譜分離技術(shù)第4頁,共33頁，星期六，2024年，5月分類：按照流動相的狀態(tài)分，如GC，LC等。按照固定相的形式分，如column-chromatography,paper-chromatography,thin-layer等。按照分離過程依據(jù)的物理化學(xué)性質(zhì)分：如adsorption-chromatography、ion-exchange、molecularsieve，affinity-chromatography等。色譜分離技術(shù)第5頁,共33頁，星期六，2024年，5月利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同、而使混合物中的各組分分離的方法。吸附色譜分離技術(shù)是各種色譜技術(shù)中應(yīng)用得最早的一類。由于吸附劑來源豐富，價格低廉，易再生，裝置簡單，又具有一定的分辨率等優(yōu)點，故至今仍廣泛應(yīng)用。吸附劑與被吸附物分子之間的相互作用是由范德華力所引起的，其特點是可逆的，即在一定的條件下，被吸附物可以離開吸附劑表面，這稱為解吸作用。一、吸附色譜吸附色譜柱示意圖第6頁,共33頁，星期六，2024年，5月溶劑洗脫法：加入樣品溶液后，連續(xù)不斷地加入洗脫劑進行沖洗，最初的流出液為純?nèi)軇?，然后是吸附力最弱的組分，以后逐次出現(xiàn)的物質(zhì)是按吸附力由弱到強的順序分別洗出，吸附力量強的物質(zhì)最后洗脫出來。置換法前緣洗脫法洗脫溶劑洗脫液曲線

第7頁,共33頁，星期六，2024年，5月吸附劑與洗脫劑的選擇

吸附劑應(yīng)具有的性質(zhì)：(1)吸附劑應(yīng)有適當(dāng)?shù)奈搅?，表面積大；(2)吸附劑對被分離物有足夠的分辨力，即對不同物質(zhì)的吸附力有所不同；(3)吸附劑對被吸附物的吸附應(yīng)是可逆的，即在一定的條件下可以解吸，以便洗脫；(4)吸附劑不會溶解在所采用的溶劑中，也不會引起被吸附物的化學(xué)改變；(5)吸附劑顆粒均勻，在操作時穩(wěn)定，不會破裂。洗脫劑應(yīng)具有的性質(zhì)：(1)洗脫劑不與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，不會使吸附劑溶解；(2)洗脫劑對樣品中各組分的溶解度大，粘度小，流動性好，容易與被洗脫組分分開；(3)洗脫劑的純度要高，免受雜質(zhì)影響。常用的洗脫劑有飽和烴、醇、酚、酮、醚、鹵代烷以及水等。極性較大的洗脫能力較強。第8頁,共33頁，星期六，2024年，5月二、分配色譜

分配色譜是利用各組分的分配系數(shù)不同而予以分離的方法。分配色譜中，通常采用一種多孔性固體支持物吸著一種溶劑作為固定相，另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可以沿固定相流動，稱為流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動下流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配，由于各物質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速率也就不相同，從而達到分離的目的。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度比值。在色譜條件確定后分配系數(shù)是一常數(shù)，以K表示。第9頁,共33頁，星期六，2024年，5月三、離子交換色譜

離子交換色譜是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團），對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種色譜分離技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)的分離純化。第10頁,共33頁，星期六，2024年，5月離子交換劑

含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)，即在不溶性母體上引入若干可解離基團（活性基團）而成。不溶性母體的高分子物質(zhì)：苯乙烯樹脂、酚醛樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或其它聚合物?；钚曰鶊F可以是酸性基團：磺酸基(-SO3H)，磷酸基(-PO3H2)，亞磷酸基(-PO2H)，羧基(-COOH)，酚羥基(-OH)等。引入酸性基團的交換劑可離解出H+，與其它陽離子交換，這類離子交換劑屬于陽離子交換劑?；钚曰鶊F是堿性基團：季胺[-N+(CH3)3]，叔胺[-N(CH3)2]，仲胺[-NHCH3]，伯胺[-NH2]等含氨基的基團。引入含氨基堿性基團的交換劑，可與OH-結(jié)合后，與其它陰離子交換，這類離子交換劑屬于陰離子交換劑。第11頁,共33頁，星期六，2024年，5月

強酸型陽離子交換劑（含有磺酸基-SO3H等）對各種正離子的親和力次序為：

Fe3+>Al3+>Zn2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Fe2+>Ba2+>Cr2+>Ca2+>Mg2+>Cs+>Rb+>K+>Na+>H+>Li+

弱酸型陽離子交換劑（含有羧基-COOH，酚羥基-OH等）對氫離子(H+)的親和力特別高。因此轉(zhuǎn)為氫型時很容易，僅需很少量的酸即可。強堿性陰離子交換劑（含季胺-N+(CH3)3等）對各種負離子的親和力次序為：檸檬酸根>SO42->Cr2O4->I->NO3->CrO4->Br->SCN->Cl->HCOO->OH->F->CH3COO-弱堿性陰離子交換劑對氫氧根離子(OH-)有較高的親和力，易于轉(zhuǎn)變?yōu)榱u型。陽離子只能被陽離子交換劑吸附，陰離子只能被陰離子交換劑吸附；親和力大的易于吸附，難于洗脫，親和力小的難于吸附，容易洗脫；第12頁,共33頁，星期六，2024年，5月離子交換劑的選擇

選擇離子交換劑時應(yīng)考慮下列因素：(1)樣品離子帶何種電荷；(2)離子的濃度；(3)被分離物質(zhì)相對分子量的大??；(4)離子與交換劑的親和力大小；(5)離子交換劑及欲分離物質(zhì)的物理化學(xué)特性等。第13頁,共33頁，星期六，2024年，5月離子交換色譜的操作

離子交換劑預(yù)處理裝柱離子交換劑轉(zhuǎn)型（用適當(dāng)?shù)脑噭┨幚恚汶x子交換劑所帶的可交換離子轉(zhuǎn)變?yōu)槲覀兯枰碾x子，如陽離子交換劑用NaOH處理，可轉(zhuǎn)為Na+型，用HCl處理，則轉(zhuǎn)為H+型；陰離子交換劑用NaOH處理轉(zhuǎn)為OH-型，用HCl處理轉(zhuǎn)為Cl-型等）溶劑或緩沖液平衡上柱（加樣）洗脫和收集（洗脫液中應(yīng)含有與交換劑的親和力較大的離子，以便把吸附在交換劑上的樣品離子交換下來，樣品中含有多種離子時，與交換劑親和力小的首先被洗脫出來）再生（再次轉(zhuǎn)型）第14頁,共33頁，星期六，2024年，5月四、凝膠色譜

凝膠色譜，又稱為凝膠過濾、分子排阻色譜或分子篩色譜。它是指以各種凝膠為固定相，利用流動相中所含各物質(zhì)的相對分子量不同而達到物質(zhì)分離的一種色譜技術(shù)。第15頁,共33頁，星期六，2024年，5月凝膠色譜的基本原理

當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠色譜柱時，各組分在柱內(nèi)同時進行著兩種不同的運動，即垂直向下的移動和無定向的分子擴散運動（布朗運動）。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，所以以較快的速度流過凝膠柱；而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這樣就使小分子物質(zhì)向下移動的速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中各組分按相對分子量從大到小的順序先后流出色譜柱，達到分離的目的。第16頁,共33頁，星期六，2024年，5月Ve：洗脫體積，表示某一組分物質(zhì)從加進色譜柱到最高峰出現(xiàn)時，所需的洗脫液體積；

Vo：外體積，即為色譜柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積；

Vi：內(nèi)體積，即為色譜柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。

當(dāng)某組分的Ka=0時（即Ve=Vo），說明該組分分子完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出；若某組分的Ka=1（即Ve=Vo+Vi）時，說明該組分分子可自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時，最后流出；若某組分的Ka在0~1之間，說明該組分分子介乎大分子和小分子之間，洗脫時Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。分配系數(shù)Ka第17頁,共33頁，星期六，2024年，5月五、親和色譜

親和色譜是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的一種色譜技術(shù)。具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對互配的，主要的有酶與底物、酶與競爭性抑制劑、酶與輔酶、抗原與抗體、DNA與RNA、激素與其受體等。在成對互配的生物分子中，可把任何一方作為固定相，而對樣品溶液（流動相）中的另一方分子進行親和色譜，達到分離純化的目的。酶與其輔酶是成對互配的，既可把輔酶作為固定相，使樣品中的酶分離純化，也可把酶作為固定相，使樣品中的輔酶分離純化第18頁,共33頁，星期六，2024年，5月離心分離技術(shù)

常速離心機（低速離心機），其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力在l0000g以下高速離心機，轉(zhuǎn)速：l0000~25000r/min，相對離心力達l0000~l00000g

超速離心機，轉(zhuǎn)速：25000~80000r/min，最大相對離心力達500000g。按照分離要求，還可以進行差速離心、密度梯度離心和等密度離心。第19頁,共33頁，星期六，2024年，5月離心條件的確定

離心力離心時間（與顆粒的沉降時間有關(guān)）溫度和pH值（防止欲分離物質(zhì)的凝集、變性和失活）n：轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min

第20頁,共33頁，星期六，2024年，5月第三節(jié)其他提取分離技術(shù)

超臨界流體萃取技術(shù)(supercriticalfluidextraction,SCFE)

第21頁,共33頁，星期六，2024年，5月超臨界流體萃取技術(shù)利用超臨界流體(supercriticalfluid,SCF)，即其溫度和壓力略超過或靠近臨界溫度(Tc)和臨界壓力(pc)，介于氣體和液體之間的流體作為萃取劑，從固體或液體中萃取出某種高沸點或熱敏性的成分，以達到分離和提純的目的。第22頁,共33頁，星期六，2024年，5月純物質(zhì)的壓溫圖

第23頁,共33頁，星期六，2024年，5月超臨界流體萃取與液體溶劑萃取的比較

超臨界流體萃取法液體溶劑萃取法1可選擇萃取揮發(fā)性小的物質(zhì)，生成超臨界相在要分離的原料中加入溶劑形成二相2萃取能力由T、p控制。夾帶劑研究不多萃取能力由溫度及混合溶劑濃度控制，壓力無影響3在常溫、高壓(5~30MPa)下操作，可處理對熱不穩(wěn)定的物質(zhì)在常溫、常壓下進行4溶質(zhì)、溶劑易于分離，改變壓力溫度即可溶質(zhì)與溶劑分離常用蒸餾法，存在對熱穩(wěn)定性問題5粘度小，擴散系數(shù)大，易達到相平衡擴散系數(shù)小，有時粘度相當(dāng)高6超臨界相溶質(zhì)濃度小萃取相為液體，溶質(zhì)濃度一般較高第24頁,共33頁，星期六，2024年，5月夾帶劑單一組分的超臨界溶劑有較大的局限性，其缺點是：(1)某些物質(zhì)在純超臨界氣體中溶解度很低，如超臨界CO2只能有效地萃取親脂性物質(zhì)，對糖、氨基酸等極性物質(zhì)，在合理的溫度與壓力下幾乎不能萃取；(2)選擇性不高，導(dǎo)致分離效果不好；(3)溶質(zhì)的溶解度對溫度、壓力的變化不夠敏感，使溶質(zhì)從超臨界氣體中分離出來時耗費的能量增加。針對上述問題，在純氣體溶劑中加人與被萃取物親和力強的組分，以提高其對被萃取組分的選擇性和溶解度，這類物質(zhì)稱為夾帶劑(entrainer)。例如由CO2和乙醇（夾帶劑）組成的混合溶劑萃取脂肪酸，可以增加溶解度。第25頁,共33頁，星期六，2024年，5月膜分離技術(shù)是以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在某種推動力（如壓力差、濃度差、電位差等）時，膜兩側(cè)組份選擇性地透過膜，從而達到分離、提純的目的。膜分離技術(shù)的出現(xiàn)是分離技術(shù)的一個飛躍，豐富了分離手段，大大提高了過濾效率及過濾效果。通過引入膜分離技術(shù)可以替代離心、沉降、蒸發(fā)、吸附等傳統(tǒng)的分離手段，提高生產(chǎn)效率、降低運行成本、簡化操作。

膜分離技術(shù)第26頁,共33頁，星期六，2024年，5月動植物體內(nèi)可能存在的主要成分及其大小組分分子量尺寸大小(

m)組分分子量尺寸大小

m酵母和真菌

1~10酶104~1062×10-3~10-2細菌

3×10-1~10抗體300~1036×10-4~1.2×10-3膠體

10-1~1單糖200~4008×10-4~1×10-3病毒

3×10-2~3×10-1有機酸100~5004×10-4~8×10-4蛋白質(zhì)104~1062×10-3~10-2無機離子10~1002×10-4~4×10-4多糖104~1062×10-3~10-2

第27頁,共33頁，星期六，2024年，5月目前，以壓力作為推動力的膜分離過程共有四種，以過濾孔徑由小到大的順序排列依次是：反滲透、納濾、超濾、微濾。

第28頁,共33頁，星期六，2024年，5月第29頁,共33頁，星期六，2024年，5月微濾（MF）微濾可有效去除物料中的懸浮固體、細菌、膠體及固體蛋白。一般有0.1um至2u