Ni填料純化His標(biāo)簽蛋白的應(yīng)用案例及關(guān)鍵點(diǎn)

第第頁(yè)Ni填料純化His標(biāo)簽蛋白的應(yīng)用案例及關(guān)鍵點(diǎn)His標(biāo)簽由于其分子量小、與金屬離子結(jié)合本領(lǐng)強(qiáng)以及在變性條件下也可保持與介質(zhì)結(jié)合的特性，已成為常用的親和標(biāo)簽。固定化金屬離子親和層析（IMAC）原理為：暴露在蛋白質(zhì)表面的某些氨基酸側(cè)鏈（重要是His，及少量的Cys和Trp），可與過(guò)渡金屬離子之間發(fā)生特定的可逆性相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的分別純化。金屬離子通常為Zn2+、Ni2+、Cu2+或Co2+，如今用Ni2+固定化金屬離子親和層析已成為純化組氨酸標(biāo)簽蛋白的標(biāo)準(zhǔn)方法。蛋白質(zhì)/肽與固定化金屬離子相互作用的強(qiáng)度取決于氨基酸側(cè)鏈的類(lèi)型、數(shù)量和空間分布，以及所使用的金屬離子的性質(zhì)。常見(jiàn)的Ni螯合方式：Ni填料在獸用亞單位疫苗的應(yīng)用基因工程亞單位疫苗，在表達(dá)載體序列中加入His—tag標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)快速層析純化獲得目標(biāo)蛋白，發(fā)酵培養(yǎng)后通過(guò)金屬螯合親和層析填料NiChromstarFF或NiChromstarExcel一步層析純化即可獲得較高純度的目標(biāo)蛋白，經(jīng)PuredexG—25M或UF/DF進(jìn)行緩沖液置換即可進(jìn)行制劑配苗。典型案例：百林科Ni填料在重組亞單位疫苗的應(yīng)用：某獸用亞單位疫苗案例由圖可知，發(fā)酵后菌體碎裂澄清后經(jīng)一步Ni填料親和層析純化后，目標(biāo)蛋白純度高，后續(xù)經(jīng)濃縮與換液后即可進(jìn)行后續(xù)制劑配苗。典型案例：百林科Ni填料在重組膠原蛋白的應(yīng)用：大腸表達(dá)的重組膠原蛋白應(yīng)用案例由圖可知，重組膠原蛋白經(jīng)一步NiChromstarFF純化后可得較高純度蛋白洗脫液，后續(xù)經(jīng)PuredexG—25M脫鹽換液后再進(jìn)行離子交換層析精純可得高純度重組膠原蛋白。不同Ni螯合方式純化效果對(duì)比（另一重組膠原蛋白）1、NiChromstarFF與NiChromstarExcel均可用于純化重組膠原蛋白；2、NiChromstarExcel洗脫純度明顯較NiChromstarFF高，對(duì)于雜質(zhì)的去除有顯著的改善效應(yīng)。鑒于以上情況，Ni親和填料在各種重組蛋白項(xiàng)目上應(yīng)用較多，而試驗(yàn)中也會(huì)常常遇到各種問(wèn)題，該如何解決吶？以下匯總了常見(jiàn)問(wèn)題以及對(duì)應(yīng)解決方法：01His標(biāo)簽蛋白與親和介質(zhì)不結(jié)合①His標(biāo)簽未翻譯表達(dá)解決思路：使用Westernblot方法檢測(cè)His標(biāo)簽是否表達(dá)重新構(gòu)建目的蛋白分子，轉(zhuǎn)變插入His標(biāo)簽的位置（C端或N端）②His標(biāo)簽暴露不充分解決思路：向樣品中加入肯定量變性劑（如：3～8M尿素，3～6M鹽酸胍等），再上樣純化重新構(gòu)建目的蛋白分子，適當(dāng)加添組氨酸基團(tuán)個(gè)數(shù)，或在His標(biāo)簽與目的蛋白之間加入一段Linker02His標(biāo)簽蛋白純化后純度低①介質(zhì)的離子交換作用，導(dǎo)致了非特異結(jié)合解決思路：在平衡液、樣品、洗脫液中，加入0.5MNaCl，屏蔽介質(zhì)的離子交換作用②雜蛋白也能與金屬離子結(jié)合解決思路：調(diào)整樣品與介質(zhì)的結(jié)合條件，譬如預(yù)先在樣品及平衡液中加入10～50mM咪唑，屏蔽與介質(zhì)弱結(jié)合的蛋白洗脫過(guò)程采用梯度洗脫方法，摸索最佳純度條件試驗(yàn)其他金屬離子螯合親和層析介質(zhì)在目的蛋白分子上額外構(gòu)建一個(gè)蛋白標(biāo)簽，如：GST標(biāo)簽，兩步純化目的蛋白，或銜接其他純化方法進(jìn)一步純化③His標(biāo)簽蛋白被降解解決思路：細(xì)胞碎裂過(guò)程中釋放的蛋白酶可能會(huì)降解目的蛋白，導(dǎo)致帶有His標(biāo)簽的小片段產(chǎn)生，形成產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，可以在處理樣品過(guò)程中加入肯定量蛋白酶抑制劑假如目的蛋白自身不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解，則需要摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包含溫度、緩沖液成分和操作時(shí)間等03His標(biāo)簽蛋白無(wú)法洗脫①目的蛋白與介質(zhì)結(jié)合本領(lǐng)過(guò)強(qiáng)解決思路：進(jìn)一步加添洗脫咪唑濃度，或同時(shí)適當(dāng)降低pH值通過(guò)脫落金屬離子，進(jìn)行洗脫，可用pH值3.5條件或EDTA進(jìn)行洗脫②目的蛋白沉淀在層析柱內(nèi)解決思路：摸索維持目的蛋白穩(wěn)定的最佳條件，包含溫度、緩沖液成分和操作時(shí)間等適當(dāng)降低上樣量用變性劑洗脫，如8M尿素或6M鹽酸胍04層析介質(zhì)變色①介質(zhì)長(zhǎng)期使用，顯現(xiàn)白色解決思路：假如介質(zhì)長(zhǎng)期使用，或單次使用上樣量較大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致介質(zhì)金屬離子脫落，從而導(dǎo)致介質(zhì)變白，可通過(guò)介質(zhì)再生解決假如介質(zhì)表面結(jié)合了大量目的蛋白，在純化過(guò)程中，會(huì)略顯白色，洗脫后顏色會(huì)恢復(fù)，屬于正常現(xiàn)象②介質(zhì)在純化過(guò)程中，顯現(xiàn)棕色解決思路：介質(zhì)在純化過(guò)程中變成棕色，重要是受緩沖液或樣品中還原劑的影響，可以選擇去掉還原劑成分，或者使用NiChromstarExcel介質(zhì)③介質(zhì)長(zhǎng)期使用過(guò)程中，顯現(xiàn)黃色介質(zhì)在使用過(guò)程中，會(huì)積累非特異性吸附的雜質(zhì)，包含蛋白、色素等。同時(shí)在層析柱頂端也會(huì)積累沉淀蛋白，長(zhǎng)期使用后，就會(huì)顯現(xiàn)介質(zhì)頂端發(fā)黃的現(xiàn)象。