新冠病毒-核酸檢測技術(shù)進(jìn)展壓縮

新冠病毒的檢測方法2020.05SARS-CoV-2檢測方法核酸檢測實(shí)時熒光PCR環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)基于Cas酶的檢測技術(shù)免疫檢測膠體金技術(shù)檢測方法￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于RNA的RNA聚合酶RNA-dependentRNApolymerase包膜蛋白基因Envelopegene核衣殼蛋白Nuclearcapsid主要檢測的基因￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測熒光RT-PCR當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5'外切酶活性將探針進(jìn)行酶切，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離，因而熒光基團(tuán)發(fā)射出熒光信號。隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團(tuán)不斷積累。因此熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系缺點(diǎn)：如需快速精準(zhǔn)升降溫的PCR儀器，溫度范圍一般要求0~100℃，且反應(yīng)時間長，操作要求高等。針對目的基因6個區(qū)域設(shè)計(jì)出4種特異引物F3、B3、FIP、BIP，在嗜熱脂肪芽孢桿菌鏈置換DNA聚合酶（BstDNApolymerase）的作用下，可在60~65℃實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增，15~60min即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增。具有操作簡單、終點(diǎn)可視檢測等提點(diǎn)。SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）￥1

70SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase?Polymerase?Amplification，RPA）RPA技術(shù)主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。最佳溫度為37℃~42℃，擴(kuò)增反應(yīng)所需時間少于30min。重組酶首先與引物結(jié)合形成的蛋白質(zhì)-引物復(fù)合體，能在雙鏈DNA中定位同源序列，發(fā)生鏈交換反應(yīng)并啟動DNA合成，達(dá)到目標(biāo)區(qū)域指數(shù)式擴(kuò)增，被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，以防止進(jìn)一步替換。整個過程一般可在10min之內(nèi)獲得可檢出水平擴(kuò)增的產(chǎn)物SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測

LAMP

RPASARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術(shù)之SHERLOCK技術(shù)

CＲISPＲ/Cas系統(tǒng)是原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護(hù)古生菌和細(xì)菌免受外來遺傳因素(如噬菌體和質(zhì)粒)的干擾。CＲISPＲ/Cas存在于幾乎所有的古細(xì)菌和約40%的細(xì)菌中，但不存在于真核生物或病毒中。目前CＲISPＲ/Cas系統(tǒng)分為2類，6型和30多種亞型。在Cas蛋白和CＲISPＲＲNA(crＲNA)形成效應(yīng)復(fù)合物時，1類系統(tǒng)(包括Ⅰ型，Ⅲ型和Ⅳ型)需要多個Cas蛋白，而2類系統(tǒng)(包括Ⅱ型，Ⅴ型和Ⅵ型)只需單個多結(jié)構(gòu)域的Cas蛋白。Cas13屬于2類CＲISPＲ系統(tǒng)的Ⅵ型，只切割單鏈而不切割雙鏈ＲNA，當(dāng)Cas13蛋白與crＲNA結(jié)合后，形成的ＲNA靶向效應(yīng)復(fù)合物具有ＲNA核糖核酸酶(ＲNase)活性，已成為可編程識別RNA的強(qiáng)大工具。基于Cas13非特異的ＲNA切割能力，Cas13已被開發(fā)為體外核酸檢測的高靈敏度診斷工具。該系統(tǒng)依賴于ＲNA熒光報(bào)告探針，其在ＲNA被切割之前不發(fā)射任何熒光，當(dāng)Cas13a被靶ＲNA激活后切割ＲNA熒光報(bào)告探針從而發(fā)出熒光，由于Cas13a強(qiáng)大的ＲNase活性，一個靶ＲNA激活的Cas13a可切割數(shù)以千計(jì)的ＲNA探針，對反應(yīng)體系里的靶ＲNA進(jìn)行信號放大檢測。SHERLOCK（specifichigh-sensitivityenzymaticreporterunlocking）是2017年基于RPA技術(shù)開發(fā)的一種靶向RNA的新核酸診斷平臺，將CRISPR相關(guān)酶Cas13a改造成快速、廉價(jià)、高靈敏度的診斷工具。SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術(shù)之SHERLOCK技術(shù)

Cas13a在crRNA引導(dǎo)下，偵檢到靶RNA序列并結(jié)合目標(biāo)序列時，會轉(zhuǎn)入一種酶促“激活”狀態(tài)，其無區(qū)分的RNA酶活性，會切割RNA報(bào)告分子當(dāng)該報(bào)告分子被切割時，會釋放可檢測到的熒光信號.通常，為提高分析靈敏度，樣品中雙鏈DNA（dsDNA）或RNA首先要經(jīng)RPA或RT-RPA擴(kuò)增來提高樣品中目標(biāo)含量水平，并與T7轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，將擴(kuò)增DNA轉(zhuǎn)化為RNA.經(jīng)上述處理，SHERLOCK的靈敏度達(dá)到渺摩爾級（10-18mol/L），特異性達(dá)到單堿基錯配.SARS-CoV-2的檢測——核酸檢測基于Cas酶檢測技術(shù)之DETECTR技術(shù)

Cas12酶家族在crRNA的引導(dǎo)下，與目標(biāo)序列結(jié)合后，便切換為激活狀態(tài)，瘋狂切割體系內(nèi)其他的單鏈DNA（ssDNA）。Cas12a這一特點(diǎn)可被用于分子診斷領(lǐng)域，Doudna教授借鑒SHERLOCK技術(shù)，也引入RPA擴(kuò)增步驟，創(chuàng)造RPA+Cas12a新的核酸分子檢驗(yàn)技術(shù)，命名為DETECTR.與SHERLOCK相比，DETECTR無需將擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄到RNA.SARS-CoV-2的檢測——免疫檢測膠體金免疫檢測原理圖膠體金標(biāo)記的能與IgM/IgG抗體特異結(jié)合的抗原固定在結(jié)合墊上，NC膜上檢測線處固定抗人IgM/IgG抗體，質(zhì)控線處固定特異識別重組抗原His/Fc等標(biāo)簽抗體.當(dāng)待測樣品滴加至樣品墊加樣處，樣品向試紙吸水墊處移動，如含有IgM/IgG抗體，抗體與結(jié)合墊上的金標(biāo)抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，隨后被檢測線上的抗人IgM/IgG抗體捕獲，并顯色.若待測樣品中不含IgM/IgG抗