酶聯(lián)免疫反應

酶聯(lián)免疫反應概述免疫分析：是以抗原抗體相互結合的免疫反應為基礎，研究免疫學技術及其在醫(yī)學領域中的應用。

免疫分析的分類根據(jù)分析過程中是否需要標記物可分為兩類一、標記免疫分析：根據(jù)標記物的種類可分為1、酶免疫分析2、放射免疫分析3、發(fā)光免疫分析4、熒光免疫分析5、金（銀）免疫標記分析二、非標記免疫分析：免疫沉淀實驗、免疫濁度分析技術一、酶免疫分析：是利用酶的高效催化和放大作用與特異性免疫反應結合而建立的一種標記免疫技術。原理：用酶標記的抗原（或抗體）用于免疫反應，并以相應的底物被酶分解的顯色反應對樣品中的抗體（或抗原）進行定位的分析和鑒定。

根據(jù)是否需要分離結合與游離的酶標記物可分為可分為非均相(或異相)酶免疫測定和均相酶免疫測定兩種方法。均相酶免疫分析法（homogeneousenzymeimmunoassay，HEI）是在檢測過程中抗原抗體反應后，無需分離結合和游離酶標記物，直接根據(jù)反應前后酶活性的改變進行待測物質的測定的分析方法。

均相酶免疫分析主要有酶擴大免疫測定技術和克隆酶供體免疫測定兩種方法。均相酶免測定的對象為小分子抗原或半抗原，主要用于藥物測定?？梢灾苯佑糜谌詣由治鰞x測定。非均相酶免疫分析法（heterogeneousenzymeimmunoassay）常用的酶免疫分析法多為非均相法，又可分為液相酶免疫法和固相酶免疫法兩種，以后者最常用，稱為酶聯(lián)免疫吸附測定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）。ELISA是臨床上最常用的免疫分析方法。需經過結合的標記物和游離的標記物的分離才能測定.分離的方法主要通過固相載體吸附后清洗未結合的游離標記物。

ELISA既可以測定抗原，也可以測定抗體。根據(jù)測定對象不同，可采用不同的模式，主要有雙抗夾心法、間接法和競爭法等。一、ELISA簡介二、ELISA原理三、ELISA分類四、ELISA相關試劑五、ELISA影響因素六、ELISA應用一、ELISA簡介1971年瑞典學者Engvall和Perlmann，荷蘭學者VanWeeman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay，ELISA）。自上世紀70年代初問世以來，ELISA發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。二、ELISA原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。YY

①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）

②酶標記的抗原或抗體（標記物）③酶作用的底物（顯色劑）加樣本微量反應孔包被好的抗體振蕩、洗板待測項目（抗原）加入酶標記得抗原VV酶標記物輕鏈螯合劑辣根過氧化物酶重鏈振蕩、洗板V加入底物顯色液HHHHHHHHHHHHHH免疫標記技術放射物標記技術酶標技術免疫熒光技術其他標記技術酶聯(lián)免疫吸附技術酶免疫組化技術雙抗體夾心法競爭法雙抗原夾心法間接法三、ELISA分類雙抗體夾心法競爭法間接法ELISA基本實驗過程包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色實驗中對照的設置陽性對照陰性對照空白對照臨界標準品ELISA試劑（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液。固相抗原或抗體1、固相載體的性狀固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應。ELISA載體的形狀主要有：膜（NC膜、PVDF膜、尼龍膜）、微量滴定板（96孔板）、小珠和小試管，以微量滴定板（96孔板）最為常用。良好的ELISA用96孔板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。2、包被用抗原用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。3、包被條件酶標記的抗原或抗體（結合物）1、酶用于ELISA的酶應符合以下要求：（1）純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴；（2）制備成酶結合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力；（3）在受檢標本中不存在相同的酶；（4）相應底物易于制備和保存，價格低廉；（5）有色產物易于測定，光吸收高。常用的酶為辣根過氧化物（horseradishperoxidase，HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosohatase，AP）。酶的底物1、HRP的底物HRP催化過氧化物的氧化反應，常用的供氫體有鄰苯二胺（OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和ABTS。TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，無致癌性等優(yōu)點。酶反應用HCl或H2SO4

終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，2、AP的底物AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯（p‐NPP）作為底物。產物為黃色的對硝基酚，用NaOH終止酶反應后，黃色可穩(wěn)定一時間。NBT/BCIP，紫色反應，水沖洗終止反應。

試劑因素標本因素實驗原理或操作方法環(huán)境因素五、ELISA影響因素●抗原抗體的純度●標準品定值的準確性●抗體的親和力、滴度和特異性●標記物的比活性或免疫活性

試劑因素

內源性物質常見的有:類風濕因子（RF）、嗜異性抗體（Id）、補體、人抗動物抗體（HAAA）、藥物及其導致的代謝產物和交叉反應物質等。外源性物質主要為：標本溶血、標本細菌污染、標本儲存時間過長、標本凝集不全和采血管中含有添加劑等。自身免疫產品：膽紅素濃度小于0.05mg/mL的黃疸，血紅蛋白濃度小于5.0mg/mL的溶血和甘油三酯濃度小于25.0mg/mL的脂血對檢測結果沒有影響。

標本因素鉤狀效應（HOOK效應）及交叉反應現(xiàn)象顏色終止條件

ELISA實驗終止劑選用引起的持續(xù)發(fā)展的顏色加深影響了陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結果,特別在大批樣品需較長時間進行讀數(shù)時,這種潛在的顏色逐漸加深現(xiàn)象成為結果影響的重要因素。ELISA的洗板過程

洗液沖力過大會造成酶結合物丟失,本底偏淺,吸光度值偏低,且洗板后殘留液規(guī)定一般不超過2ul。實驗原理或操作方法通風、采光與防塵?？刂茰囟燃皾穸?環(huán)境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異應使用系統(tǒng)空調進行控溫,并要求控制空氣濕度為40%～70%之間消除噪音與電磁干擾。穩(wěn)定水電,實驗過程中應采用蒸餾水(純水)或經軟化處理的自來水。環(huán)境因素六、ELISA應用

飼料中鹽酸克倫特羅的測定飼料中毒素的測定（主要包括黃曲霉毒素，簡曲霉毒素）飼料中有害微生物的快速篩檢（如沙門氏菌）

甲胺磷殘留分析甲基對硫磷殘留分析呋喃丹殘留分析ELISA在飼料安全檢測中的應用ELISA用于農藥殘留的檢測河豚毒素

植物毒素如罌粟鹼、嗎啡、藻類毒素苯并芘

主要有除草劑與殺蟲劑兩大類例如殺暝松（FN）、甲氟磷酸異已酶（SOMAN）、草不綠（Alachor

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