（高清版）WST 230-2024 實時熒光聚合酶鏈反應臨床實驗室應用指南

ICS11.020CCSC50WSWS/T230—2024代替WS/T230—2002Guidelinesforimplementationofreal-timefluorescentpolymerasechainreactioninIWS/T230—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術語和定義 4縮略語 5樣本采集和處理 6方法 7污染預防和控制 8質量管理 9結果判讀和報告 10實驗室生物安全 11臨床適用范圍 附錄A（資料性附錄）常用實時熒光PCR技術方法 17附錄B（資料性附錄）實時熒光PCR技術臨床適用范圍 18參考文獻 WS/T230—2024本標準為推薦性標準。本標準代替WS/T230—2002《臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用》，與WS/T230—2002相比，除結構調整和編輯性改動外，主要技術變化如下：——更改了“范圍”部分（見第1章，2002年版的第1章較WS/T230—2002將所述技術范疇由“PCR”縮小為“實時熒光PCR”；——增加了“規(guī)范性引用文件”部分（見第2章）；——更改了“術語和定義”部分（見第3章，2002年版的第2章——增加了“縮略語”部分（見第4章）；——將“標本的收集、運輸、處理和存放”部分更改為“樣本采集和處理”，對2002年版相關內容進行細化補充后納入（見第5章，2002年版的第5章）；——在“方法”中增加了針對實時熒光PCR技術的擴增體系、擴增反應內容，刪除了該技術以外的其他PCR產(chǎn)物分析方法（見第6章，2002年版的第4章）；——在“污染預防和控制”中增加了污染的處理與控制要求內容（見第7章，2002年版的第6章）；——將“質量控制”部分更改為“質量管理”，增加了人員及實驗室、設備管理要求、方法性能驗證、室內質控、實驗室間比對要求內容（見第8章，2002年版的第7章）；——將“結果的判讀、報告和解釋”部分更改為“結果判讀和報告”，增加檢測方法局限性、結果報告要素、檢測結果解釋內容（見第9章，2002年版的第8章——增加了“實驗室生物安全”部分（見第10章）；——將“用途”部分更改為“臨床適用范圍”，刪除了過篩實驗、診斷實驗、驗證實驗內容（見第11章，2002年版的第3章）；——刪除了2002年版“附錄”內容（見2002年版的附錄A“定量PCR技術”、附錄B“對生產(chǎn)廠商的要求和建議”——增加了資料性附錄A“常用實時熒光PCR技術方法”（見附錄A）；——增加了資料性附錄B“實時熒光PCR技術臨床適用范圍”（見附錄B）。本標準由國家衛(wèi)生健康標準委員會臨床檢驗標準專業(yè)委員會負責技術審查和技術咨詢,由國家衛(wèi)生健康委醫(yī)療管理服務指導中心負責協(xié)調性和格式審查,由國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)政司負責業(yè)務管理、法規(guī)司負責統(tǒng)籌管理。本標準主要起草單位：復旦大學附屬中山醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院、中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院、復旦大學附屬華山醫(yī)院、北京大學人民醫(yī)院、浙江省人民醫(yī)院、中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心。本標準主要起草人：潘柏申、郭瑋、段勇、沈佐君、關明、趙曉濤、童向民、邱茂鋒、王蓓麗。本標準于2002年首次發(fā)布，本次為第一次修訂。1WS/T230—2024實時熒光聚合酶鏈反應臨床實驗室應用指南本標準規(guī)定了實時熒光聚合酶鏈反應在臨床實驗室應用中的樣本采集和處理、方法、污染預防和控制、質量管理、結果判讀和報告、實驗室生物安全、臨床適用范圍等要求。本標準適用于全國各級各類醫(yī)療衛(wèi)生機構及醫(yī)學檢驗實驗室開展核酸擴增基因定性及定量檢測。本標準不適用于基于核酸雜交、核酸恒溫擴增、基因測序等技術所開展的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本標準必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本標準；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。GB/T37874核酸提取純化方法評價通則GB/T40974核酸樣本質量評價方法JJF1874（自動）核酸提取儀校準規(guī)范JJF1527聚合酶鏈反應分析儀校準規(guī)范WS233病原微生物實驗室生物安全通用準則WS/T348尿液標本的采集與處理WS/T414室間質量評價不合格原因分析WS/T640臨床微生物學檢驗標本的采集和轉運WS/T661靜脈血液標本采集指南3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1聚合酶鏈反應polymerasechainreaction;PCR一種利用人工合成的寡核苷酸作為引物介導的DNA目標序列特異性酶促擴增技術。當存在模板、底物、引物和耐熱DNA聚合酶時，通過調節(jié)反應溫度引導多次“變性-退火-延伸”反應循環(huán)，可令痕量DNA模板擴增數(shù)百萬倍。3.2實時熒光聚合酶鏈反應real-timefluorescencepolymerasechainreaction;real-timePCR在PCR反應體系中引入熒光基團，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過連續(xù)監(jiān)測繪制反應動力曲線，從而對樣本中被擴增模板DNA的初始含量進行計算。該技術包含定性和定量檢測，常以qPCR（quantitativepolymerasechainreaction）代表定量檢測。3.3反轉錄reversetranscription;RT以RNA單鏈為模板，在反轉錄酶催化下合成互補DNA（即cDNA）的過程。3.4模板template復制或轉錄、反轉錄過程中用來產(chǎn)生互補鏈的DNA或RNA核苷酸序列。3.52WS/T230—2024目標序列targetsequence擬通過PCR技術進行定性或定量檢測的特定核酸序列區(qū)域。3.6引物primer具有特定序列的人工合成寡核苷酸片段，可與目標序列區(qū)域上下游互補，從而形成穩(wěn)定的氫鍵連接，促進DNA聚合酶的結合和DNA鏈的延伸。3.7熒光探針fluorescentprobe根據(jù)特定基因序列設計的標記有熒光基團和淬滅基團的人工合成寡核苷酸片段，與互補序列退火雜交后，通過PCR擴增酶促反應釋放熒光信號，用于檢測樣本中是否含有特定基因序列。3.8變性denaturationPCR反應體系中，利用高溫條件破壞核酸二級結構中的氫鍵，使DNA與RNA均從復雜高級結構轉變?yōu)榫€性單鏈核苷酸的過程。3.9退火annealingPCR反應體系中，需通過降低反應體系溫度，使兩條線性單鏈核苷酸通過互補堿基間的氫鍵形成局部雙鏈的過程。3.10延伸extensionPCR反應體系中，引物與模板發(fā)生退火后，在耐熱DNA聚合酶作用下，根據(jù)模板DNA的堿基順序，以單個核苷酸為原料，自引物5’端向3’端逐個添加核苷酸合成兩條互補鏈的過程。3.11DNA聚合酶DNApolymerase以DNA單鏈為模板、dNTP為原料，催化脫氧核苷酸加到引物或DNA鏈的3′-OH端，合成互補DNA新鏈所需的酶。3.12反轉錄酶reversetranscriptase以RNA為模板指導dNTPs合成互補DNA的聚合酶。3.13插入insertionDNA或RNA的一種突變形式，在原有核苷酸序列中插入了一個或多個額外核苷酸。3.14缺失deletionDNA或RNA的一種突變形式，在原有核苷酸序列中丟失了一個或多個原有核苷酸。3.15抑制物inhibitor/干擾物interferentPCR檢測反應體系中抑制或干擾PCR反應進行的物質，可導致PCR產(chǎn)物產(chǎn)量減少或非特異性產(chǎn)物增多。3.16污染contamination3WS/T230—2024由于樣本交叉污染或試劑、標準品、質控品、擴增產(chǎn)物污染等原因，導致PCR擴增體系中混入來自待檢樣本以外的模板，使PCR檢測出現(xiàn)假陽性結果的情況。3.17循環(huán)閾值cyclethreshold（Ct）value實時熒光PCR擴增過程中，熒光信號強度由本底水平達到所設定熒光閾值限時所對應的循環(huán)次數(shù)，即循環(huán)閾值，其數(shù)值大小與模板核酸片段的起始拷貝數(shù)成反比。3.18轉運transport樣本由采樣地點運送到檢測地點的過程，分為內部轉運（例如檢測機構內部使用人工或氣動傳輸裝置等進行送樣）和外部轉運（例如檢測機構間使用汽車、火車、飛機等交通工具進行送樣）。4縮略語下列縮略語適用于本標準。cDNA互補DNA（complementaryDNA）cfDNA游離DNA（cellfreeDNA）Ct循環(huán)閾值（cyclethresholdvalue）ctDNA循環(huán)腫瘤DNA（circulatingtumorDNA）DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DNase脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease）dNTP脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dsDNA雙鏈DNA（double-strandedDNA）EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）FFPE福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixedparaffin-embedded）miRNA微小RNA（microRNA）mRNA信使RNA（messagerRNA）PCR聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction）RNA核糖核酸（ribonucleicacid）RNase核糖核酸酶（ribonuclease）RT-PCR反轉錄聚合酶鏈反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）SOP標準操作程序（standardoperatingprocedure）ssDNA單鏈DNA（single-strandedDNA）real-timePCR實時熒光聚合酶鏈反應（real-timefluorescencepolymerasechainreaction）rRNA核糖體RNA（ribosomalRNA）Tm熔解溫度（meltingtemperature）UDG尿嘧啶-DNA糖基水解酶(uracil-DNAglycosylas）5樣本采集和處理5.1總體要求應正確進行樣本采集、轉運、處理和保存，發(fā)生在分析前階段的操作不當可能會破壞樣本完整性、導致核酸降解，引入污染或干擾物，最終影響目標序列定性或定量檢測結果的準確性。實驗室應就各環(huán)節(jié)制定詳細的技術要求，并向樣本采集、轉運、接收、檢測人員分別提供相應培訓。5.2樣本采集5.2.1總體要求4WS/T230—2024實驗室在開展實時熒光PCR技術服務時，除常規(guī)遵循體外診斷樣本采集要求外，還可參照WS/T661、WS/T348、WS/T640進行。應結合不同檢測項目對樣本的要求，并參考所使用試劑及耗材的說明，制定詳細的樣本采集程序，包括采樣時效、采樣部位、樣本類型、采樣裝置與采集容器、采集方法、采樣量、質量評價注意事項，并對采樣人員提供相應培訓與指導。采樣人員在采集樣本前應核對受檢者身份、采樣部位、樣本類型、采樣裝置與采集容器。采集完成的樣本應予唯一性標識。如需受檢者自行留取樣本（例如痰液、尿液），應指導其如何正確留取并送檢，避免因操作不當造成樣本質量不合格、檢測結果不準確。5.2.2樣本類型采樣時應參考檢測項目要求、疾病特性、病原微生物感染部位或感染細胞類型等因素，選擇采樣部位與樣本類型，以確保所采集樣本中含有檢測目標序列。實時熒光PCR技術可檢測的臨床樣本類型包括組織（新鮮組織、石蠟切片組織）、細胞及其培養(yǎng)產(chǎn)物、EDTA或枸櫞酸抗凝全血、干血斑、血清、血漿、外周血單個核細胞、骨髓、其他體液（例如腦脊液、漿膜腔積液、尿液、房水等）、產(chǎn)前診斷樣本（絨毛膜、絨毛膜培養(yǎng)細胞、羊水、羊水培養(yǎng)細胞等）、拭子（采集分泌物、脫落細胞、微生物等）、分泌物（痰液、膿液、唾液等）、體腔與體表沖洗液（含脫落細胞、cfDNA）、糞便、含微生物的臨床樣本或微生物培養(yǎng)樣本，等。5.2.3采樣時效應結合不同檢測目的與疾病特點，明確樣本采集的時效性，避免因在疾病發(fā)生發(fā)展過程中樣本采集過早或過遲而導致假陰性結果。感染性疾病可考慮在病程不同階段連續(xù)采樣送檢。手術、輸血、藥物治療等醫(yī)療行為可影響實時熒光PCR檢測結果，采樣前應明確患者有無接受上述診療行為，如有宜建議推遲采樣或在報告中備注相關情況。采樣完成后應標明或記錄具體采樣時間以供回溯。5.2.4防污染操作采樣過程中應注意避免外源性核酸污染。病原微生物檢測采樣時遵守無菌操作，避免樣本被環(huán)境微生物和定植微生物污染。5.2.5采樣裝置和采集容器應為無菌、無DNase/RNase、一次性。所用材質與所含添加物不可抑制或干擾PCR檢測過程。全血和骨髓樣本抗凝首選EDTA與枸櫞酸鹽，不可使用肝素。如同時采集多管樣本，應根據(jù)采集容器添加物類型及對PCR反應有無影響制定填裝順序。其中，真空采血管采集順序可參照WS/T661執(zhí)行。5.3樣本轉運5.3.1應結合不同樣本類型與檢測目標核酸特性，參考試劑盒說明書要求，制定樣本轉運與保存過程中的時間、溫濕度條件及生物安全要求。5.3.2樣本經(jīng)采集后，應盡可能減少運送環(huán)節(jié)、縮短轉運時間，在規(guī)定時間內運達實驗室。5.4樣本接收5.4.1應結合不同檢測項目制定各自詳盡的樣本接收/拒收標準及不合格樣本退收流程。5.4.2對經(jīng)評估質量合格的樣本應收盡收。樣本質量評估應充分考慮樣本運送時間和條件，不同類型樣本的質量評價標準包含以下方面：a)全血樣本：EDTA或枸櫞酸抗凝、樣本量適宜、專用容器、無凝血或溶血；b)血漿（清）樣本：樣本量適宜、專用容器；5WS/T230—2024c)其他體液：樣本量適宜、專用容器、無污染物；d)拭子：專用拭子、保存液和容器；e)組織：樣本量適宜、專用容器、保存液。5.4.3已接收樣本應在規(guī)定時間內錄入實驗室信息系統(tǒng)，做好接收登記，便于臨床實時查詢和追蹤樣本狀態(tài)。5.4.4樣本拒收當樣本經(jīng)評估不符合接收質量評價標準，例如：標記信息錯誤或不足、樣本類型和申請檢測項目不符、抗凝方式不當、采集容器不符合專業(yè)規(guī)范、破損或嚴重污染、樣本處理或轉運不當、樣本量不滿足檢測最低要求，等。實驗室可拒收樣本并做好相應記錄，同時盡快通知樣本采集部門，向其解釋拒收原因并建議重新采集合格樣本。5.4.5讓步檢測標準特殊情況下如必須進行檢測，實驗室就樣本可搶救程度及檢測可行性進行評估后，應就樣本可能存在的檢測影響因素充分告知臨床醫(yī)師，經(jīng)溝通許可后行讓步檢驗并將具體情況詳細記錄在案，同時在檢測報告中備注樣本特殊情況。明確存在以下情況的樣本不宜進一步行PCR檢測：肝素抗凝血樣、無標識/標記錯誤的樣本。溶血及經(jīng)凍融的全血樣本不宜用于cfDNA檢測。5.5樣本處理5.5.1總體要求實施實時熒光PCR檢測前，可采用經(jīng)有效驗證的技術方法從各類型樣本中提取和純化核酸，制備成擴增模板。提取與純化操作可令核酸物質釋放、提高目標核酸濃度、去除PCR抑制物、提高PCR擴增成功率和可重復性，有利于檢測標準化。5.5.2樣本前處理總體要求應根據(jù)樣本類型、目標核酸來源、疾病特點、檢測目的，選取適宜的樣本前處理方式。離心對樣本中特殊來源或穩(wěn)定性差、含量低、易降解的核酸片段（例如RNA、cfDNA），應及時離心分離相應檢測成分。全血樣本可經(jīng)離心后分離血清、血漿、外周血單核細胞，其他體液樣本可經(jīng)離心后分離上清、沉渣。混勻拭子、導管等樣本可經(jīng)振蕩，使粘附于其表面的細胞、菌體、病毒洗脫入樣本保存液。均質化當細胞、菌體、病毒被裹挾或黏附在其它物質內時，可通過均質化使其釋放。例如：痰液樣本宜先消化釋放菌體；糞便樣本宜機械混勻；組織樣本宜剪碎研磨。濃縮和富集對檢測目標序列含量較低的樣本，應通過適宜技術手段進行分離以實現(xiàn)濃縮和富集，提高檢測靈敏度。例如：糞便、尿液、腦脊液和其他體液樣本中的細胞可經(jīng)離心分離；血液及其他體液樣本中的特定細胞亞群可經(jīng)流式細胞熒光分選、磁珠捕獲等方法分離；組織樣本中的特定類型細胞可經(jīng)激光捕獲顯微切割獲取。5.5.3組織樣本處理6WS/T230—2024新鮮組織樣本可采用均質器打勻、鋼珠打磨、液氮研磨等方法對樣本進行均質化，再以蛋白酶K消化處理。（formalin-fixedparaffin-embedded，F(xiàn)FPE）樣本。FFPE組織切片用于核酸提取前，應經(jīng)過脫蠟、乙醇漂洗、風干、蛋白酶K消化處理。5.5.4核酸提取與純化總體要求應根據(jù)樣本類型、目標核酸類型（DNA/RNA）選擇核酸提取與純化方法。首要原則為確保核酸結構完整度，其次為去除其他干擾物，采取相應處理方法保證核酸的提取質量和產(chǎn)量，以確保滿足下游檢測要求。實驗室應針對實時熒光PCR檢測項目要求制定并遵照核酸提取與純化SOP。采用商品化核酸提取試劑盒前，應對其核酸提取效率進行評估，包括核酸純度、提取產(chǎn)率、完整性。DNA提取應根據(jù)組織、血液、拭子、尿液、糞便等不同樣本類型及檢測目的選擇適宜提取方法。目前臨床常用磁珠分離純化法，該法高效且易實現(xiàn)自動化，適宜在樣本量大的情況下使用。RNA提取應根據(jù)目標RNA類型（總RNA、mRNA、miRNA）、下游檢測所需模板純度、處理樣本耗時和成本、以及RNA完整度要求進行選擇。RNA提取過程中應做好環(huán)境消毒、操作者自身防護、器材預處理，注意避免RNase污染，以免RNA降解。主要方法包括：柱提法和磁珠分離法。5.5.5核酸模板的轉化甲基化位點轉化甲基化檢測需以亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不變，再利用針對甲基化和非甲基化序列的引物進行實時熒光PCR檢測。影響轉化的主要因素包括亞硫酸氫鹽濃度、反應溫度、pH值及反應時間，應嚴格控制反應條件，以保證轉化效率。RNA反轉錄RNA需以Oligo（dT）或隨機引物經(jīng)反轉錄成為cDNA，再進行后續(xù)實時熒光PCR檢測。5.5.6核酸模板質量評價經(jīng)上述樣本處理后獲得的擴增核酸模板提取產(chǎn)量、純度和完整度應符合后續(xù)檢測要求，以滿足擴增有效性和結果準確性。具體評價指標及判斷標準、方法及操作步驟可參考GB/T37874、GB/T40974。如不符合相應要求，應分析原因后重新采集樣本，或對樣本重新進行抽提。5.6樣本保存5.6.1原始樣本的保存除核酸提取純化所需樣本量外，實驗室應盡力保留和妥善保存殘余樣本，以便追溯和復檢。實驗室應結合不同樣本類型與目標核酸特性明確原始樣本保存條件與期限，就不同保存條件進行驗證，并避免樣本反復凍融以備需要時復檢。為避免RNA表達水平變化與降解，用于RNA檢測的血液樣本應直接抽取到含有RNA穩(wěn)定添加劑的采血管中保存，組織樣本立即放入含有RNA穩(wěn)定劑的保存管中或直接放入液氮中快速冷凍保存。5.6.2核酸模板的保存經(jīng)提取純化后的核酸模板應以適當條件保存，以盡可能減少核酸降解。7WS/T230—2024保存容器材質應避免吸附核酸，或誘導核酸結構變化。保存痕量核酸樣本時，宜選擇低吸附性材料以防核酸損失。保存體系以及溫度條件應根據(jù)核酸模板類型以及保存期限進行選擇。擬長期保存可參考：a)DNA：置于Tris-EDTA緩沖液，保存于0℃以下；b)RNA：置于乙醇緩沖液，保存于-70℃以下或液氮；c)cfDNA：置于TE緩沖液，保存于-20℃及以下。用于保存核酸樣本的制冷設備不應啟用自動化霜功能，以免溫度反復波動致核酸降解、樣本變質。5.6.3保存樣本的取用檢測后殘余樣本的保存周期應參照國家或地方相關法律法規(guī)，當無文件可參照時，應與臨床協(xié)商制定。對檢測結果有疑問、爭議或投訴時，可取用保存樣本進行復檢并記錄。6方法6.1擴增體系6.1.1總體原則實時熒光PCR擴增體系包括引物、熒光化學物質（染料或探針）、DNA聚合酶、dNTP、模板、Mg2+及反應緩沖液等成分。引物和探針的設計是影響該技術的關鍵因素，其決定了檢測準確性和特異性；合適的DNA聚合酶對擴增反應的成功至關重要；dNTP的質量與濃度影響擴增效率；Mg2+是DNA聚合酶發(fā)揮活性必需的輔助因子。6.1.2引物引物宜針對模板序列保守區(qū)域進行設計，應同時考慮長度、結構、GC含量、Tm值等因素，使正向引物與探針距離近且不重疊、擴增產(chǎn)物片段大小適中，以獲得高特異性與高擴增效率。引物本身及引物之間不應存在互補序列。6.1.3熒光化學物質實時熒光PCR技術使用的熒光物質主要分為熒光探針和熒光染料，前者特異性較高，后者則會導致非特異性結果。目前臨床中以熒光探針最為常用，其具有高特異性、高信噪比等優(yōu)勢，可用于多重PCR反應。熒光探針設計應考慮長度、GC含量、Tm值等因素?，F(xiàn)有探針類型包括：水解探針、分子信標、雙雜交探針等。6.1.4熱穩(wěn)定DNA聚合酶實時熒光PCR技術常采用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，宜根據(jù)熱穩(wěn)定性、延伸速率、保真性等性能參數(shù)要求進行選擇。其中Taq酶最為常用，具有良好的持續(xù)合成能力和高效的延伸速率；Tth酶耐熱性高，兼具反轉錄活性，可實現(xiàn)在同管中進行逆轉錄和擴增。對具特殊要求的該技術檢測項目，還可選擇其他類型聚合酶，例如：反轉錄酶、熱啟動聚合酶、高保真聚合酶等。6.1.5dNTP實時熒光PCR體系中包含dATP、dCTP、dGTP和dTTP四種擴增原料，其濃度應為50μmol/L～200μmol/L。濃度過低會降低PCR產(chǎn)物的量，濃度過高則易與Mg2+結合，影響酶活性。四種dNTP應等量。6.1.6模板實時熒光PCR僅需微量模板，樣本來源的其他物質可能會抑制PCR反應。為減少對PCR反應的影響，應考慮模板的最適加入量。8WS/T230—20246.1.7Mg2+及其濃度在實時熒光PCR體系中，Mg2+濃度以1.5mmol/L～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高時，酶活性過強，易出現(xiàn)非特異性擴增，降低反應特異性；Mg2+濃度過低則會降低酶活性，使反應產(chǎn)物減少。商品化試劑盒的預混液中多含有固定預設濃度的MgCl2，必要時實驗室可對Mg2+濃度進行優(yōu)化，優(yōu)化后應進行相應的性能確認。6.1.8擴增體系配置擴增反應體系配制完成后應在試劑盒推薦時間內使用，以防止體系變質（酶失活和探針淬滅）。開展臨床基因定性及定量檢測項目宜采用商品化試劑盒，試劑盒就擴增體系各組分常采用預混液形式，應根據(jù)說明書要求進行配置，必要時可進行優(yōu)化。6.2擴增反應6.2.1初始變性反應溫度升高至95℃,孵育2分鐘～5分鐘，確保雙鏈DNA（dsDNA）被分離成單鏈DNA（ssDNA）以進行后續(xù)擴增。6.2.2變性反應溫度升高至95℃,破壞dsDNA互補堿基間的氫鍵，形成ssDNA。變性溫度不宜過高、時間不宜過長，以免影響TaqDNA聚合酶活性、損害反應體系中dNTP。6.2.3退火反應溫度降低至較引物Tm低5℃~10℃,以促進引物與模板的結合。引物Tm的常用計算公式如下：式中：NA——引物序列中腺嘌呤（A）的個數(shù)；NT——引物序列中胸腺嘧啶（T）的個數(shù)；NG——引物序列中鳥嘌呤（G）的個數(shù)；NC——引物序列中胞嘧啶（C）的個數(shù)。反應中引物的長度、堿基組成及其濃度是影響退火溫度選擇的主要原因。適宜的退火溫度是保證PCR擴增特異性的重要前提。為提升擴增特異性，可在推薦的Tm值范圍內，選擇較高溫度進行退火反應，以減少引物和模板間的非特異性結合。6.2.4延伸延伸反應階段的溫度應根據(jù)DNA聚合酶的最佳活性溫度設置，溫度過高不利于引物和模板結合。延伸反應時間應根據(jù)擴增片段的長度選擇，延伸時間過長易出現(xiàn)非特異性擴增。對于低濃度模板的擴增反應，宜適當延長延伸反應時間。6.2.5循環(huán)次數(shù)本標準第6.2.2至第6.2.4條的變性、退火和延伸過程需重復循環(huán)，循環(huán)次數(shù)由起始模板量決定。循環(huán)次數(shù)設定在30～40次為宜，應注意非特異性產(chǎn)物的量亦隨循環(huán)反應次數(shù)而相應增多。7污染預防和控制7.1污染來源7.1.1實時熒光PCR技術檢測靈敏度高，樣本和目標序列產(chǎn)物對檢測環(huán)境與反應體系的污染可造成假陽性結果。實驗室應注重污染對結果的影響，規(guī)范試驗操作行為預防污染。7.1.2發(fā)生在該技術應用過程中的污染根據(jù)不同情況，可分為以下幾類：9WS/T230—2024a)根據(jù)污染核酸片段來源可分為：基因組核酸、擴增產(chǎn)物、試劑質控及標準品來源的合成性核酸序列污染。b)根據(jù)污染播散形式可分為：攜帶污染、氣溶膠污染。c)根據(jù)被污染對象可分為：樣本間交叉污染、試劑污染、擴增體系配制污染。7.1.3樣本間交叉污染多表現(xiàn)為個別樣本假陽性，試劑與擴增體系配制污染多表現(xiàn)為批次假陽性。7.2污染的預防7.2.1實驗室分區(qū)開展實時熒光PCR檢測時宜就實驗室設置分區(qū)，試劑耗材儲存及檢測流程中的試劑配制、樣本制備、擴增反應及產(chǎn)物分析宜分別在相對獨立的區(qū)域內進行。分子病理實驗室宜設置獨立的樣本前處理區(qū)，包括切片區(qū)和脫蠟區(qū)，用于組織切片、脫蠟、水化、染色等。脫蠟、水化及染色操作應在通風設施中進行。如使用一體式自動分析儀進行樣本檢測，可根據(jù)設備實際功能，對分區(qū)進行合并。分區(qū)設計可因地制宜，根據(jù)所使用的技術平臺及檢測項目適當調整區(qū)域設置，滿足生物安全與分子實驗室污染控制要求即可。應就各區(qū)域設計單向工作流程，以減少污染發(fā)生。各區(qū)域內配備專用實驗服、手套、移液器、一次性用品等。出入各區(qū)時對具潛在污染可能的防護裝備予以更換，以降低污染風險。應注意實驗室分區(qū)間氣流流向，保證潛在可能污染物控制在特定區(qū)域內。7.2.2分裝試劑為預防污染，可對試劑進行分裝。配制或分裝試劑所用的物品、去離子水和緩沖液均應做去核酸酶處理。試劑配制或分裝應在試劑貯存和準備區(qū)進行。實驗室可根據(jù)各類試劑的穩(wěn)定性制定分裝方案，確保試劑質量。7.2.3檢測注意事項實驗室在工作前、工作后均應進行去核酸處理，包括：a)紫外線照射；b)使用0.5％～1％次氯酸鈉或75％乙醇擦拭或其他方式處理；c)運用商品化核酸去除劑；d)保持實驗室良好通風。e)因次氯酸鈉具有較強腐蝕性，不可用次氯酸鈉直接處理儀器設備。實驗室應根據(jù)檢測規(guī)模決定使用頻率，使用次氯酸鈉進行去核酸處理后應保持通風，降低實驗室空氣中的余氯含量。檢測操作過程中應重視以下要點：a)開蓋處理根據(jù)樣本風險，可在生物安全柜內進行；b)實驗應使用帶濾芯的一次性加樣吸頭；c)移液器應定期進行去核酸處理；d)樣本開蓋前應離心、靜置，有條件時可采取冰浴方式降低氣溶膠污染風險；e)操作過程中應防止樣本間交叉污染。不宜選用濃度過高的質控品。質控品和標準品經(jīng)啟用后不能繼續(xù)存放于試劑貯存和準備區(qū)，丟棄時應閉管以防止泄露。使用過的離心管、吸頭宜用0.5％～1％次氯酸鈉溶液浸泡后按醫(yī)療廢棄物處理。擴增產(chǎn)物應采用醫(yī)療廢棄物包裝袋包裝，按醫(yī)療廢棄物管理要求統(tǒng)一處理。WS/T230—20247.2.4預防擴增產(chǎn)物污染宜就擴增反應管的密閉性進行驗證。去除擴增產(chǎn)物殘留污染可采用尿嘧啶-DNA糖基水解酶(uracil-DNAglycosylas，UDG）法。7.3污染監(jiān)測7.3.1試劑監(jiān)測利用未添加任何核酸模板的擴增反應液直接進行擴增，如結果陽性則表明試劑污染。實驗室應對各批次試劑及試劑分裝過程進行監(jiān)測，防止使用已被污染的試劑。7.3.2操作過程監(jiān)測開展日常臨床檢測時，應合理設置陰性對照（可采用陰性質控品，或以無菌水替代）監(jiān)測核酸檢測全程。陰性對照不應出現(xiàn)目標片段擴增，若檢測結果為陽性則表明實驗過程中存在交叉污染或氣溶膠污染。7.3.3環(huán)境監(jiān)測環(huán)境監(jiān)測可通過以下方法進行：取容器盛裝無菌水，開蓋置于實驗室工作臺面、生物安全柜臺面及核酸提取儀艙內過夜，再與臨床樣本一起進行檢測，如結果陽性則提示實驗室存在氣溶膠污染；亦可取拭子擦拭實驗室不同物品表面采集環(huán)境監(jiān)測樣本，置于含無菌水或樣本保存液的試管中，混勻后按臨床樣本進行檢測。依據(jù)實驗室的檢測規(guī)模及陰性室內質控結果制定環(huán)境監(jiān)測頻率。7.4污染的處理與控制7.4.1待測樣本處理如根據(jù)污染監(jiān)測結果發(fā)現(xiàn)存在污染或污染可能時，應先停止檢測工作與報告發(fā)布，分析并明確污染原因和嚴重程度后決定檢測結果是否可報告。當確認污染系個別樣本交叉污染或環(huán)境中輕微氣溶膠污染時：對于報告陰性或陽性的檢測項目，結果為陰性的樣本可正常報告，結果為陽性的樣本應排除污染再次復檢后方可報告；對于報告基因多態(tài)性的檢測項目，需排除污染原因后復檢。7.4.2查找原因實驗室應制定失控處理流程與措施，分析陰性質控或環(huán)境監(jiān)測樣本失控的原因。應通過試劑監(jiān)測、操作過程監(jiān)測及不同區(qū)域環(huán)境監(jiān)測明確污染來源。如疑似擴增產(chǎn)物污染，可選用另一種與原擴增試劑無交叉反應的擴增試劑進行驗證。7.4.3清除污染如因樣本產(chǎn)生氣溶膠污染，應停止使用實驗室。無論何原因引起的實驗室污染，均應按一定程序進行去核酸處理。宜先用75％乙醇、純凈水或核酸清除劑（不含腐蝕性成分）沉降氣溶膠，再經(jīng)紫外燈消毒30分鐘～60分鐘，然后用核酸清除劑或0.5％～1％次氯酸鈉溶液處理實驗操作臺、加樣器和地面，部分檢測器具可采用浸泡沖洗，最后予持續(xù)通風處理。每次按上述程序處理直至污染消除后再恢復實驗室的使用。8質量管理WS/T230—20248.1人員管理8.1.1應具備相應分子生物學知識背景，接受過專門技術培訓，取得PCR上崗證書。8.1.2實驗室應制定相關程序對人員進行管理，保存所有人員記錄，以證明各類資格、資質和培訓考核等滿足要求。8.2實驗室管理應滿足《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》要求，并取得所在省/市指定部門的技術審核合格證書方可開展相應的臨床基因檢驗工作。8.3設備管理8.3.1實驗室應制定設備選擇、購買和管理的文件化程序。8.3.2實驗室應配備其開展實時熒光PCR檢測所需的全部設備，包括樣本采集、處理、檢測和保存環(huán)節(jié)等。每臺設備應有唯一標識。8.3.3PCR實驗室各物理分區(qū)中的設備為專用，應設置有明確標示，以避免設備未經(jīng)妥善處置即從原所在分區(qū)移動至另一分區(qū)，造成不同工作區(qū)域間的交叉污染。8.3.4設備應始終由經(jīng)培訓的授權人員操作。實驗室應有設備安全操作、轉運、保存和使用的程序，以防止設備污染或損壞。8.3.5實驗室應保存每臺設備檢測性能的記錄，包括證明設備納入實驗室時最初可接受使用的記錄、校準記錄、維護維修記錄等。8.3.6設備檢定和校準屬于國家規(guī)定應接受強制檢定的計量器具的設備，應按相關文件要求進行檢定。實驗室應評估每臺設備對結果有效性和計量溯源性的影響，合理地確定是否需要校準。對不需要檢定和校準的設備，實驗室應核查其狀態(tài)是否滿足使用要求。對需要校準的設備，實驗室應建立校準方案，方案中應包括該設備校準的參數(shù)、范圍、不確定度和校準周期等，以便送校時提出明確的、針對性的要求。設備校準參數(shù)應能滿足實驗室所用實時熒光PCR檢測項目的需求。實驗室應根據(jù)校準證書的信息，判斷設備是否滿足方法要求。如果校準數(shù)據(jù)中包含修正因子，實驗室應確保該修正因子得到適當?shù)母潞蛻?，以滿足規(guī)定要求。以下實時熒光PCR檢測相關設備應定期進行校準：全自動核酸檢測系統(tǒng)、核酸提取儀、核酸擴增儀、移液器、天平、溫度計、水浴箱、恒溫金屬浴、離心機、生物安全柜、分杯儀和自動液體工作站。其中核酸提取儀具體校準參數(shù)及要求見JJF1874，核酸擴增儀校準參數(shù)及要求見JJF1527。8.3.7設備維護與維修實驗室應制定文件化的預防性維護程序，該程序至少應遵循制造商說明書的要求。當發(fā)現(xiàn)設備故障時，應停止使用并清晰標示。實驗室應確保故障設備已經(jīng)修復并驗證，當其滿足規(guī)定的可接受標準后方可使用。實驗室應檢查設備故障對之前檢測的影響，并采取應急措施或糾正措施。在設備投入使用前、維修前后或報廢前，實驗室應采取適當措施對設備去污染。8.4方法性能驗證8.4.1驗證計劃制定檢測方法用于臨床前，實驗室應獨立進行方法性能驗證。驗證時，實驗室可通過獲取客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實檢驗程序的性能與試劑盒的聲明相符，同時應滿足臨床對檢測結果預期用途的要求。WS/T230—20248.4.2樣本選擇宜選擇受檢者真實樣本，盡量與試劑盒建立性能指標時所用材料一致。當目標樣本不易獲得時，可考慮使用穩(wěn)定的質控品、標準品或參考物質。當一份樣本需進行多次試驗時，宜對其進行分裝并低溫保存，避免反復凍融。8.4.3定性方法的驗證總體要求定性檢測項目驗證指標宜包括方法符合率、檢出限、抗干擾能力等。符合率通過與參比方法進行比較。參比方法包括但不限于：金標準方法、行業(yè)公認方法、經(jīng)驗證性能符合要求滿足臨床預期用途的方法（例如：通過ISO15189認可實驗室使用的相同檢測方法）。通常按照受檢者樣本檢驗程序，采用參比方法和候選方法平行檢測。將所有檢測結果按四格表匯總填表，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率。檢出限如試劑使用說明書有檢出限的聲明，在有標準物質或以定量形式表達定性結果時，所用檢測方法應進行檢出限的驗證。驗證時，將定值參考物質（例如：國際參考品、國家參考品、試劑盒參考品）樣本梯度稀釋至試劑盒聲明的檢出限濃度，重復測定，按照90％或95％置信區(qū)間統(tǒng)計。稀釋液可根據(jù)情況選用試劑盒提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗證的目標物應陰性外，所含干擾物質濃度應在試劑盒聲明的范圍之內?？垢蓴_能力PCR檢測常見的干擾物質主要包括血紅蛋白、肝素、苯酚、乙醇、異丙醇、乙酸鈉等。實驗室可根據(jù)臨床需求、試劑盒聲明和樣本特點（實際可能存在的干擾物質及達到的濃度）選擇需要驗證的干擾物質及濃度。實驗室可就抗凝劑和樣本保存液等試劑對實時熒光PCR檢測結果的影響單獨進行評估。8.4.4定量方法的驗證總體要求定量檢測項目分析性能驗證指標宜包括測量正確度、測量精密度（含重復性和中間精密度）、抗干擾能力、定量限、線性區(qū)間、可報告區(qū)間、核酸提取效率、擴增效率等。正確度對測量正確度的評價，首選方法是分析定值參考物質，其次選擇使用實驗室能力驗證的正確度驗證數(shù)據(jù)。推薦的參考物質為具有互換性的有證參考物質及具有溯源性及互換性的正確度驗證物質。參考物質至少選擇2個濃度水平，至少其中一個水平為醫(yī)學決定水平。使用受檢者樣本進行正確度驗證時首選參考方法，參考方法不易獲得時，可選擇已得到臨床驗證的常規(guī)方法。如果是更新試劑盒，應與現(xiàn)在使用的試劑盒進行比較。測量精密度應同時驗證重復性和中間精密度。用于精密度驗證的樣本應具有很好的穩(wěn)定性和均一性。至少含兩個濃度水平，應盡可能與試劑盒精密度評價時所用樣本濃度一致，宜確定醫(yī)學決定水平處的精密度?？垢蓴_能力見本標準第條，驗證在特定種類和濃度水平干擾物質存在的條件下，檢測結果仍然符合檢測方法規(guī)定的要求。定量限WS/T230—2024定量限是指在一定實驗條件下，檢測系統(tǒng)能夠得到可靠結果的被測物最低濃度，其總誤差符合實驗室預期要求（臨床可接受是定量分析方法實際能可靠測定的某組分的下限。建立定量限宜根據(jù)臨床需求和試劑盒選定的性能規(guī)范的允許誤差來設定準確度目標，最常見的是設定總誤差目標值。并預先確定預期的定量限的目標濃度，在該濃度下制備多個低濃度水平樣本。線性區(qū)間所用樣本應盡可能與受檢者樣本相似，不含有說明書上指出的干擾物，受檢者樣本是線性驗證的理想樣本?？衫酶摺⒌蜐舛鹊臉颖九渲撇煌瑵舛葮颖?，高、低濃度值應在試劑盒聲明的線性區(qū)間上下限附近。若不易獲得高濃度樣本，可通過向受檢者樣本中添加測定物（加入量小于總體積10％）獲得；若不易獲得低濃度樣本，可通過已驗證不含被測物的受檢者樣本稀釋陽性受檢者樣本獲得?？蓤蟾娣秶旘炞C的線性范圍上限不能滿足臨床需求時，應進行可報告范圍驗證。定量分析方法的可報告范圍是臨床實驗室發(fā)布檢測報告的依據(jù)之一，可報告范圍的驗證包括可報告低限（定量下限）與可報告高限（定量上限×樣本最大稀釋倍數(shù)）。選擇在線性范圍內高值樣本，用試劑盒配套或指定的稀釋液分別做10、100和1000倍等倍比稀釋，稀釋后的理論值不應低于定量下限，每份樣本至少測定2次取平均值，計算各稀釋度的理論值與實測值對數(shù)值的差值，差值（例如偏差）應滿足實驗室和行業(yè)的質量要求。核酸提取效率當懷疑核酸提取效率存在問題，應就核酸模板提取質量進行驗證，見本標準第5.5.6條。核酸擴增效率當懷疑PCR擴增系統(tǒng)存在問題，應進行擴增效率驗證。擴增效率包括樣本和標準品的擴增效率兩部分，僅在兩者擴增效率良好且一致時，定量結果才準確。8.4.5臨床驗證臨床檢測方法在啟用前后，實驗室均宜選取臨床明確診斷的受檢者樣本，進行方法學性能評價，以驗證檢測方法達到臨床應用的規(guī)定標準要求。評價指標可包括：臨床靈敏度和特異性、陽性和陰性預測值、陽性和陰性似然比等。8.5室內質量控制8.5.1總體要求實驗室應建立內部質量控制程序以驗證達到預期的結果質量。實驗室應使用與受檢者樣本組分和基質相似的質控品，定期檢測質控品，檢測頻率應基于檢驗程序的穩(wěn)定性和錯誤結果對受檢者危害的風險而確定。實驗室宜選擇醫(yī)學決定水平或與其值接近的質控品濃度，以保證決定值的有效性。根據(jù)質控品性質決定是否參加抽提，室內質控宜覆蓋從抽提至實時熒光PCR檢測的全過程。8.5.2核酸提取的質量控制總體要求在實時熒光PCR檢測過程中，可通過設立內對照進行核酸提取的質量控制。如果本批實驗無內對照擴增，則提示樣本內存在抑制物/干擾物，可通過重新抽提核酸清除或減少抑制物/干擾物。內源性內對照常采用人體細胞中的管家基因。內源性內對照既可以監(jiān)測采樣質量，又可以監(jiān)測核酸提取到產(chǎn)物分析全過程的有效性。外源性內對照常用人工合成的假病毒或質粒，在核酸提取前摻入樣本中，與目標序列同時提取和擴增，可監(jiān)測從核酸提取到產(chǎn)物分析全過程的有效性，但不能反映采樣質量。8.5.3擴增反應的質量控制WS/T230—2024定性檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和/或陽性質控品。定量檢測項目，每次實驗應設置陰性、弱陽性和陽性質控品。如為基因突變、基因多態(tài)性或基因型檢測，則應包括最能反映檢測情況的突變或基因型樣本，每批檢測的質控至少應有一種基因突變或基因型。宜設置某一時間周期，令周期內各批次檢測所設置質控品監(jiān)測位點合計可覆蓋該檢測項目所包含的所有位點。擴增反應的質量控制至少涵蓋提取的核酸模板質量、反應體系（酶濃度與活性、離子活度、升降溫控制等）、陰性和陽性（特別是臨界弱陽性）對照設置等方面。對于定量測定，除陰、陽性質控符合要求外，還應考慮每次實驗的擴增效率（斜率、截距、相關系數(shù)）符合規(guī)定。8.5.4質控結果的判讀實驗室應建立質量控制程序以保證檢測結果的穩(wěn)定性和可靠性。當違反質控規(guī)則，且檢測結果可能存在明顯錯誤時，應拒絕接受結果，在糾正并驗證性能合格后重新檢測受檢者樣本。發(fā)現(xiàn)失控后，應對操作、試劑、儀器、人員、污染等環(huán)節(jié)進行全過程分析，查找失控原因。失控實驗室還應評估最后一次成功質控活動之后受檢者樣本的檢測結果。8.5.5質控數(shù)據(jù)處理實驗室應定期評審質控數(shù)據(jù)，以發(fā)現(xiàn)可能提示檢測系統(tǒng)問題的檢測性能變化趨勢。發(fā)現(xiàn)此類趨勢時應采取預防措施并記錄。宜盡量采用統(tǒng)計學和非統(tǒng)計學過程控制技術連續(xù)監(jiān)測檢測系統(tǒng)的性能，通常繪制室內質控圖，每月或間隔特定周期對室內質控進行總結和記錄。8.6實驗室間比對8.6.1總體要求實驗室應參加實驗室間比對計劃（例如：外部質量評價計劃或能力驗證計劃），監(jiān)控實驗室間比對計劃的結果，以保證實驗室間檢測結果的可比性。當不符合預定的評價標準時，實驗室應實施糾正措施。室間質量結果評價可參考WS/T414執(zhí)行。當無實驗室間比對計劃可利用時，實驗室應采取其他方案并提供客觀證據(jù)確定檢測結果的可接受性。實驗室應建立參加實驗室間比對的程序，該程序包括職責規(guī)定、參加說明，以及任何不同于實驗室間比對計劃的評價標準。實驗室選擇的實驗室間比對計劃應盡量提供貼近臨床實際的、模擬受檢者樣本的比對試驗，盡可能覆蓋包括分析前和分析后程序的全部檢測過程。8.6.2替代方案當無實驗室間比對計劃可利用時，實驗室可尋找其他有相關檢測資質的實驗室，按照上述方法定期進行實驗室間比對，每年不宜少于2次；或采取其他方案并提供客觀證據(jù)確定檢測結果的可接受性，這些方案應盡可能使用適宜的物質。適宜物質包括：有證標準物質/標準樣本；以前檢測過的樣本；細胞庫或組織庫中的物質；與其他實驗室的交換樣本；實驗室間比對計劃中日常測試的質控品。8.6.3檢測結果的可比性WS/T230—2024當實驗室所開展檢測項目就檢驗程序、設備、地點、人員中任一情況存在不同時，應規(guī)定比較程序和所用設備及方法，并建立臨床適宜區(qū)間內受檢者樣本結果可比性的方法。實驗室應對比較的結果進行整理、記錄，適當時，迅速采取糾正措施。應對發(fā)現(xiàn)的問題或不足采取糾正措施并保存所實施措施的記錄。9結果判讀和報告9.1結果判讀9.1.1判讀結果前應先查看下列情況的樣本擴增曲線形態(tài)，并根據(jù)項目SOP設定各熒光信號通道判讀a)查看標準品擴增曲線是否正常，曲線參數(shù)是否在試劑說明推薦范圍內。b)查看陽性質控品擴增曲線是否正常，Ct值是否在試劑說明推薦范圍內。c)如設置有內對照，查看其擴增曲線是否正常，Ct值是否在試劑說明推薦范圍內，以確保核酸提取的有效性。d)查看陰性質控品擴增曲線是否正常，僅在其未見明顯擴增且陰陽性質控檢測結果均滿足實驗室要求時，才可判讀并發(fā)布該批次檢測結果報告。9.1.2定性項目依據(jù)試劑盒聲明的判斷標準進行結果判讀；定量檢測項目根據(jù)分析測量范圍下限和上限報告定量檢測結果，當結果超出分析測量范圍時宜直接報告超出上限。鑒于PCR對稀釋誤差的指數(shù)級放大效應，不宜進行樣本稀釋檢測。9.2可疑結果的判讀與處理9.2.1出現(xiàn)可疑結果時應進行復核。9.2.2結果復核應充分考慮分析前和分析中各因素的影響。必要時可通過多次、多部位采樣降低樣本采集對結果的影響，也可換用其他檢測試劑進行復核。9.2.3如檢測結果懷疑樣本中存在有抑制物，應考慮進行稀釋驗證。當樣本稀釋后，檢測到的信號持續(xù)變強，提示有抑制物存在。需注意樣本稀釋后核酸模板同時被稀釋，應確保稀釋過程中核酸模板濃度仍保持在具有臨床檢測意義的范圍之內。9.3檢測方法局限性9.3.1檢測報告中宜對檢測方法的局限進行充分說明。9.3.2基于已知序列信息的分型方法可能檢測不到新的等位基因，或者無法與已知等位基因相區(qū)別，為避免漏檢新的等位基因，可采用多種引物組合，以提高檢測到新等位基因的可能性。9.4結果報告基本要素9.4.1內容應科學、規(guī)范和準確。實驗室宜與檢測申請者共同商定檢測報告的格式與內容。9.4.2至少包括受檢者姓名和唯一標識、檢測方法、報告項目中文和/或英文名稱、計量單位（應盡可能使用SI單位）、樣本采集日期和時間、實驗室接收樣本的時間、報告發(fā)布日期和時間、檢測者和報告者姓名和實驗室信息。9.5結果報告的程序9.5.1實驗室應制定結果報告程序以確保檢測結果準確及時地發(fā)送至檢測申請者或授權可接受檢測報告的人員。9.5.2當檢測結果采用多種方式發(fā)送（例如：電話、郵件等），應對每種報告方式設置明確規(guī)定，避免受檢者隱私受到侵犯。9.5.3結果報告程序應符合相應法律法規(guī)和衛(wèi)生行政主管部門的要求。WS/T230—20249.6檢測結果解釋9.6.1檢測報告單宜提供結果解釋，幫助報告接收者正確解讀檢測報告。9.6.2宜包括對檢測報告單中所呈現(xiàn)內容的解讀，如報告中出現(xiàn)的專業(yè)性術語、定義或計量單位。9.6.3可對檢測方法學性能、臨床性能、干擾因素以及方法學局限性進行說明。9.6.4可就后續(xù)檢驗提供參考性建議。10實驗室生物安全10.1實驗室應在衛(wèi)生行政主管部門進行生物安全備案。10.2實驗室所屬機構應成立生物安全委員會，建立生物安全管理體系。實驗室應落實實時熒光PCR檢測工作開展過程中的生物安全風險評估、負責工作人員健康監(jiān)測、組織生物安全培訓與考核、監(jiān)督定期報告等工作制度。10.3實驗室應對實時熒光PCR檢測活動中涉及的致病性生物因子、涉及致病性生物因子的檢測活動、感染性廢棄物處置過程中的風險、從事檢驗工作人員的健康狀況和安全知識水平、實驗室設備和應急處理措施進行風險評估，并依據(jù)風險評估結論采取相應的風險控制措施。10.4實驗室生物安全管理可參考WS233以及相應法律法規(guī)。11臨床適用范圍11.1在疾病的臨床診療工作中，實時熒光PCR技術可針對人體組織、血液、其他體液等樣本中所含有的人源性及病原微生物核酸序列，就特定核酸片段、單核苷酸多態(tài)性、小片段缺失/插入、基因融合、甲基化修飾等基因片段信息進行定性及定量檢測，從核酸序列、復制、轉錄等水平對其進行分析。11.2當臨床診療決策所涉及分子片段變異信息明確時，宜采用實時熒光PCR技術檢測；當分子片段信息尚不明確或變異度較大時，宜采用測序技術檢測，對經(jīng)測序獲得的分子片段信息，可采用實時熒光PCR技術進行驗證。11.3經(jīng)實時熒光PCR檢測獲得的基因片段信息，可用于感染性疾病、腫瘤性疾病、先天性及遺傳性疾病及個體化用藥、移植配型等，指導疾病的篩查、診斷、分期、分型、用藥、療效評價、耐藥監(jiān)測及預后評估等，詳見本標準附錄B。WS/T230—2024（資料性附錄）常用實時熒光PCR技術方法A.1實時熒光定量PCR技術A.1.1實時熒光定量PCR技術（熒光探針法）基于熒光探針的實時熒光定量PCR技術目前在臨床廣泛被使用。該技術在反應體系中加入了一段熒光標記的特異性寡核苷酸探針，探針的5’和3’端分別標記有報告熒光基團（Reporter，R）和淬滅熒光基團（Quencher，Q）。探針完整時R基團所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收，不發(fā)出熒光。探針與模板特異性結合后，在延伸階段，TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性會將探針5’端連接的報告熒光基團水解，報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而發(fā)出熒光。檢測到的熒光強度與PCR產(chǎn)物量成正比，從而可推算出目的片段的起始量。實時熒光定量PCR技術擴增后無需開管操作，可降低污染風險。此外，實時熒光定量PCR技術還具有特異性高、定量準確、實驗耗時短、兼容性好等優(yōu)勢，已被廣泛應用于臨床工作中。A.1.2實時熒光定量PCR技術（熒光染料法）該技術在反應體系中加入熒光染料，熒光染料不與ssDNA鏈結合，且在游離狀態(tài)下不發(fā)出熒光。染料隨擴增反應的延伸循環(huán)摻入dsDNA，與小溝結合后發(fā)出熒光，熒光信號強度與產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關。熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，目前應用最廣泛的染料是SYBRGreenI。盡管熒光染料法的特異性低于探針法，但由于其成本更低，易于普及應用。A.1.3多重熒光PCR技術多重熒光PCR技術指在同一個PCR反應體系中，使用多對引物/探針，對多種目標序列同時進行擴增的方法。多重PCR技術既兼有單一反應PCR的高特異性和靈敏度，同時具有高效和經(jīng)濟的特點，可同時檢測多種目標序列，例如多種耐藥基因、多種病原體基因，尤其適用于珍貴樣本。然而多重熒光PCR技術對反應體系的平衡有更高要求，例如熒光標記間、多對引物及探針間的相互干擾，宜不斷進行優(yōu)化，以減少存在多種靶標時可能出現(xiàn)的擴增偏好性。A.1.4擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR技術（amplificationrefractorymutationsystemPCR，ARMS-PCR）擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR技術亦稱等位基因特異性PCR，用于對已知突變基因進行檢測。該技術設計有兩個5’端引物，一個與野生型互補，一個與突變型互補。對于純合性突變，分別加入兩種5’端引物及3’端引物進行平行PCR，只有與突變完全互補的引物才可延伸并得到擴增產(chǎn)物。如錯配位于引物的3`端則導致延伸反應無法進行。ARMS-PCR法檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細胞中突變比例為1％甚至更低的突變基因。A.1.5高分辨率熔解曲線技術（highresolutionmelting，HRM）高分辨率熔解曲線技術是一種基于實時熒光PCR的新方法，可用于檢測基因突變、基因分型、單核苷酸多態(tài)性以及甲基化修飾等。該方法在反應體系中加入了新型飽和染料，通過實時監(jiān)測升溫過程中熒光染料與擴增產(chǎn)物的結合情況，根據(jù)不同熔解曲線形狀和位置來判斷是否存在基因突變或SNP。A.2其他基于實時熒光PCR技術的原理，目前還衍生有多種其他類型技術。對于RNA樣本，可采用反轉錄實時熒光PCR，通過反轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA，再進行后續(xù)擴增。臨床上，反轉錄聚合酶鏈反應（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR）技術通常用于RNA病毒檢測（例如丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒等）以及疾病相關mRNA轉錄產(chǎn)物的分析（例如非霍奇金淋巴瘤、白血病和肉瘤等伴隨的基因易位等）。此外，甲基化特異性PCR技術（methylationspecificPCR，MSP）也在臨床疾病診治中有相關應用。同時，隨著技術的不斷發(fā)展，新一代實時熒光PCR技術例如數(shù)字PCR技術（digitalPCR，dPCR）、微流控PCR技術、PCR技術陣列芯片等發(fā)展迅速，但在臨床應用上仍處于探索階段。WS/T230—2024（資料性附錄）實時熒光PCR技術臨床適用范圍B.1感染性疾病中的應用B.1.1總體原則B.1.1.1實時熒光PCR技術可直接檢測病原微生物特異性核酸序列，以此判斷樣本中是否含有可疑病原微生物，具靈敏、特異、簡便、快捷的優(yōu)勢，有利于疾病的早期快速診斷。B.1.1.2該技術除用于提供病原學感染的實驗室證據(jù)外，還可用于病原微生物定量、分型、耐藥基因、基因突變等檢測，為臨床診療決策、流行病學監(jiān)測、院感防控等提供指導。B.1.1.3在感染性疾病應用過程中應做好鑒別現(xiàn)癥感染、既往感染；污染、定植、條件致病菌等情況，并結合其他檢測結果及臨床實際，為病原學確診提供分子依據(jù)。B.1.2病毒感染性疾病B.1.2.1病毒定性檢測實時熒光PCR技術可檢測病毒特異性核酸序列，以明確樣本中是否含有相關病毒。多重實時熒光PCR技術可同步檢測多種病毒，提高呼吸道、消化道等感染癥候群的診斷效率。B.1.2.2病毒定量檢測結合特定定值標準品參考體系，實時熒光PCR檢測結果可用于評價樣本中的病毒含量。在臨床診療中可用于臨床病情評估、治療決策、療效評價、耐藥監(jiān)測與鑒定等。B.1.2.3病毒基因型鑒定實時熒光PCR技術可針對病毒特異性基因的高度可變區(qū)，根據(jù)不同基因型核酸序列的特異性目的片段特點設計引物和探針，在特定反應體系和反應條件下，通過檢測特異性目的片段進行病毒基因型鑒定。該技術較中和試驗、血凝抑制試驗等傳統(tǒng)免疫學方法血清型鑒定更為準確、便捷。病毒基因型信息可指導疾病治療決策、風險評估、分子流行病學監(jiān)測。B.1.2.4病毒耐藥監(jiān)測實時熒光PCR技術可檢測病毒耐藥基因相關核苷酸位點，識別或監(jiān)測治療過程中的獲得性耐藥。宜用于感染初始評價，以及慢性、反復、遷延性病毒感染的治療