亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說明書

第第頁(yè)亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說明書亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：Hephaestin（HP）作為銅藍(lán)蛋白的同系物,是近年來發(fā)現(xiàn)的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參加體內(nèi)鐵代謝。HP的表達(dá)可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調(diào)整。HP催化Fe2+氧化生成Fe3+，在介導(dǎo)鐵的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中有緊要作用。測(cè)定原理：HP催化Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e2+和ferrozine反應(yīng)顯色，在560nm下有特征吸光值。通過測(cè)定Fe2+的減少速率可測(cè)得亞鐵氧化酶的活性。自備用品：酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保管；試劑二：液體1.5mL×1瓶，4℃保管；試劑三：液體11mL×1瓶，4℃避光保管。粗酶液提?。阂勒战M織質(zhì)量（g）：水（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1.酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至560nm。2.在96孔板中加入下列試劑試劑名稱（μL）測(cè)定管對(duì)照管試劑一5050試劑二1010樣本1010蒸餾水3030試劑三混勻，40℃靜置30min100試劑三100混勻，立刻測(cè)定A對(duì)照和A測(cè)定，ΔA=A對(duì)照A測(cè)定。（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）HP活性計(jì)算:標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=8.2135x0.0006，R2=0.9998；（x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL；y為吸光值ΔA）（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmolFe2+定義為一個(gè)酶活力單位。HP（nmol/min/g鮮重）=（△A+0.0006）÷8.2135×V總÷T÷（W×V樣÷V樣總）×1000=40.58×（△A+0.0006）÷W（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmolFe2+定義為一個(gè)酶活力單位。HP（nmol/min/mgprot）=（△A+0.0006）÷8.2135×V總÷T÷（Cpr×V樣）=40.58×（△A+0.0006）÷CprV總：反應(yīng)體系體積，0.1mL；V樣：加入樣本體積0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)