分光光度計(jì)的工作原理及維護(hù)和修理保養(yǎng)

第第頁分光光度計(jì)的工作原理及維護(hù)和修理保養(yǎng)分光光度計(jì)的工作原理

事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在確定范圍內(nèi)變化，即儀器有確定的精準(zhǔn)度和精準(zhǔn)明確度。如EppendorfBiophotometer的精準(zhǔn)度≤1.0%（1A）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值確定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避開存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度削減顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值可以在0.1—1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至顯現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移猛烈；必需使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能接受窗口磨損的比色杯；樣品的體積必需達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)特別緊要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，由于蛋白的吸取峰是280nm。純潔的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純潔的核酸A260/A230的比值大于2.0、A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0、

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程特別簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要除去320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測(cè)試核酸仿佛，要求A280的吸光值至少大于0.1A，較佳的線性范圍在1.0—1.5之間。試驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)覺讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要察看A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果特別穩(wěn)定。漂移的原因是由于Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以確定的系數(shù)，只要吸光值有少許更改，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純潔、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是簡(jiǎn)單受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（