真核基因表達(dá)系統(tǒng)

1、第八章第八章 真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)Chapter 8 Eukaryotic expression system 概述概述( introduction ) 真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)真核基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)( Features of eukaryotic gene structure and regulation) 真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)(eukaryotic gene expression system) 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)(yeast expression system) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(mammalian cell expression) 昆蟲細(xì)胞表

2、達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(insect cell expression ) 內(nèi)內(nèi) 容容第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、真核基因組的復(fù)雜性一、真核基因組的復(fù)雜性二、原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性二、原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢一、真核基因組的復(fù)雜性一、真核基因組的復(fù)雜性 1. . 真核基因組巨大真核基因組巨大 大腸桿菌基因組約4106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級(jí) 大腸桿菌約有4000個(gè)基因，人則約有10萬個(gè)基因2. 真核生物遺傳信息復(fù)雜真核生物遺傳信息復(fù)雜 原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體 真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，

3、被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的層次和復(fù)雜性。 細(xì)菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱子，共同開啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA； 真核生物則是一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱子的結(jié)構(gòu)。 真核細(xì)胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個(gè)基因協(xié)調(diào)表達(dá)的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)要比原核生物復(fù)雜得多。 3. 真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)4. 真核生物基因編碼復(fù)雜真核生物基因編碼復(fù)雜 原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核

4、酸雜交等實(shí)驗(yàn)表明：哺原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實(shí)驗(yàn)表明：哺乳類基因組中僅約乳類基因組中僅約10%10%的序列為蛋白質(zhì)、的序列為蛋白質(zhì)、rRNArRNA、tRNAtRNA等編碼，其余約等編碼，其余約90%90%的序列功能至今還不清楚。的序列功能至今還不清楚。 原核生物的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物原核生物的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)(exon)和內(nèi)含和內(nèi)含子子(intron)(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接

5、(splicing)(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。 原核基因組中除原核基因組中除rRNArRNA、tRNAtRNA基因有多個(gè)拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳基因有多個(gè)拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動(dòng)物基因組中則存在大量重復(fù)序列動(dòng)物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitive sequences)(repetitive sequences)。 真核生物真核生物mRNA 5mRNA 5有帽狀結(jié)構(gòu)，有帽狀結(jié)構(gòu)，33末端有末端有PolyAPolyA尾巴尾巴 1、沒有轉(zhuǎn)錄后的剪接和加工

6、系統(tǒng)、沒有轉(zhuǎn)錄后的剪接和加工系統(tǒng) 2、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)：、缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)：不能進(jìn)行糖基不能進(jìn)行糖基化、磷酸化、甲基化的修飾，影響某些蛋化、磷酸化、甲基化的修飾，影響某些蛋白的活性。白的活性。二、二、 原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性原核表達(dá)系統(tǒng)的局限性3、在原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定、在原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定 易被細(xì)菌蛋白酶降解易被細(xì)菌蛋白酶降解; 難實(shí)現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低難實(shí)現(xiàn)真正的分泌出胞，其產(chǎn)量很低; 而且容易而且容易出現(xiàn)信號(hào)肽不被切割，或不在特異位置上切割。出現(xiàn)信號(hào)肽不被切割，或不在特異位置上切割。 表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體的形式存在，后期變性、復(fù)性的效率低表達(dá)產(chǎn)物常以

7、包涵體的形式存在，后期變性、復(fù)性的效率低4、內(nèi)毒素的污染、內(nèi)毒素的污染 (contamination of endotoxin)1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng):2. 具翻譯后修飾系統(tǒng)具翻譯后修飾系統(tǒng)3. 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá)三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢三、真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢 ( advantages of eukaryotic expression system ) （一）真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)（一）真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn) -多層次、多方面多層次、多方面（二）真核基因表達(dá)的調(diào)控模式（二）真核基因表達(dá)的調(diào)控模式第二節(jié)第二節(jié) 真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)真核基因表達(dá)調(diào)控特

8、點(diǎn)Features of Eukaryotic gene structure and expression真核基因表達(dá)的調(diào)控模式真核基因表達(dá)的調(diào)控模式 ( The regulating model of eukaryotic gene expression) 1、轉(zhuǎn)錄前水平轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平基因組水平) ：gene level 2、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控: transcription level3、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控: post-transcription level4、翻譯水平的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控: translation level5、翻譯后修飾、翻譯后修飾: post-tra

9、nslation modification 1、轉(zhuǎn)錄前水平轉(zhuǎn)錄前水平(基因組水平基因組水平)： gene level 基因結(jié)構(gòu)的改變、穩(wěn)定持久、不可逆基因結(jié)構(gòu)的改變、穩(wěn)定持久、不可逆，組蛋組蛋白修飾，白修飾，DNA甲基化等甲基化等2. 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 順式調(diào)控元件順式調(diào)控元件(cis-acting element) 反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor) （1 ）順式調(diào)控元件順式調(diào)控元件(cis-acting element) 結(jié)構(gòu)基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而啟動(dòng)結(jié)構(gòu)基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而啟動(dòng) 轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄的DNA序列，主要包括序列，主要包括： 起

10、正性調(diào)節(jié)作用：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子起正性調(diào)節(jié)作用：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子 起負(fù)性調(diào)節(jié)作用：沉寂子，終止子，加尾信號(hào)起負(fù)性調(diào)節(jié)作用：沉寂子，終止子，加尾信號(hào) 啟動(dòng)子啟動(dòng)子 位于基因位于基因55末端與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。作用特點(diǎn)是近距末端與轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的核苷酸序列。作用特點(diǎn)是近距離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括離作用、具有方向性、空間位置較恒定。一般包括 核心啟動(dòng)子元件（核心啟動(dòng)子元件（core promoter elements)core promoter elements) ： 指指RNARNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNADNA序列，決定基因轉(zhuǎn)錄的序列，決

11、定基因轉(zhuǎn)錄的精確起始位點(diǎn)產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄精確起始位點(diǎn)產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，包括：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及，包括：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及-30-30區(qū)的區(qū)的TATA-boxTATA-box 上游啟動(dòng)子元件（上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter elementsupstream promoter elements) ) 包括包括 -70-70到到-80bp-80bp區(qū)域的區(qū)域的CAATCAAT盒及其兩側(cè)的盒及其兩側(cè)的GCGC盒，協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄的盒，協(xié)同決定轉(zhuǎn)錄的基礎(chǔ)效率基礎(chǔ)效率 組織特異性元件組織特異性元件 誘導(dǎo)性啟動(dòng)子元件誘導(dǎo)性啟動(dòng)子元件真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)模式圖真核啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)模式圖核心啟動(dòng)子元件核心啟動(dòng)子元件

12、上游啟動(dòng)子元件上游啟動(dòng)子元件 哺乳類哺乳類RNA聚合酶聚合酶啟動(dòng)子中常見的元件啟動(dòng)子中常見的元件元件名稱元件名稱共同序列共同序列結(jié)合的蛋白因子結(jié)合的蛋白因子名稱名稱 分子量分子量 結(jié)合結(jié)合DNA長度長度TATA boxTATAAAATBP 30,000 10bpGC box GGGCGGSP-1 105,000 20bpCAAT boxGGCCAATCTCTF/NF1 60,000 22bpOctamerATTTGCATOct-1 76,000 20bpOct-2 53,000 23bpk BGGGACTTTCCNFkB 44,000 10bpATFGTGACGTAFT ? 20bp 增強(qiáng)子增

13、強(qiáng)子(enhancer) 是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件 增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒有嚴(yán)格的專一性子沒有嚴(yán)格的專一性 無方向性（無方向性（序列序列、位置、位置） 遠(yuǎn)距離作用（遠(yuǎn)距離作用（1-4kB） 無基因特異性無基因特異性 具組織特異性具組織特異性構(gòu)建載體構(gòu)建載體沉寂子（沉寂子（silencer)silencer)或衰減子（或衰減子（dehancer)dehancer) 是一類抑制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控因子，作用方式 與增強(qiáng)子相同轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)：轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)： 控制基因轉(zhuǎn)錄的終止，由polyA上

14、游的10-20bp處的加尾信號(hào)（AATAA）和poly A下游的G/T簇構(gòu)成 （2）反式作用因子反式作用因子(trans-acting factor) 由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)的由位于不同或相同染色體上相距較遠(yuǎn)的基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控基因所編碼的蛋白質(zhì)因子，通過與順式調(diào)控元件和元件和RNA聚合酶的聚合酶的相互作用相互作用而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。錄活性。轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)錄信號(hào)1PTrans-acting factorTrans-acting factor (DNA結(jié)合蛋白）結(jié)合蛋白）Cis-acting factorA genemRNA of AProtein AB g

15、enemRNA of BProtein BDNA3 3、轉(zhuǎn)錄后的修飾、轉(zhuǎn)錄后的修飾 內(nèi)含子的剪接內(nèi)含子的剪接 外顯子的拼接外顯子的拼接 mRNAmRNA的加尾和加帽的加尾和加帽 mRNAmRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 4 4、翻譯水平的調(diào)控、翻譯水平的調(diào)控 主要是主要是microRNAmicroRNA對(duì)對(duì)mRNAmRNA、tRNA tRNA 和和rRNArRNA的的調(diào)控調(diào)控5 5、翻譯后的調(diào)控、翻譯后的調(diào)控 切除信號(hào)肽切除信號(hào)肽 糖基化糖基化 乙?；阴；?磷酸化磷酸化 甲基化甲基化 蛋白質(zhì)的降解蛋白質(zhì)的降解第三節(jié)第三節(jié) 真核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)組成：組成： 真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 受體細(xì)胞受體細(xì)

16、胞真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體 適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。適用于在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種：真核載體根據(jù)受體不同，又可分為幾種： 酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體受體細(xì)胞受體細(xì)胞據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為據(jù)受體細(xì)胞及表達(dá)載體的不同分為3 3種：種： 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng) 發(fā)酵簡單、快速、便宜發(fā)酵簡單、快速、便宜 真核生物，有翻譯后修飾功能真核生物，有翻譯后修飾功能 可分泌表達(dá)，簡化了純化工

17、藝可分泌表達(dá)，簡化了純化工藝 受體細(xì)胞安全受體細(xì)胞安全一、酵母表達(dá)系統(tǒng)一、酵母表達(dá)系統(tǒng)（一）酵母載體（一）酵母載體: : 1 1、概念：、概念： 攜帶外源基因在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增攜帶外源基因在酵母細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增 和表達(dá)的載體，包括克隆載體和表達(dá)載體。和表達(dá)的載體，包括克隆載體和表達(dá)載體。 2 2、組成元件、組成元件：遺傳標(biāo)記：遺傳標(biāo)記 調(diào)控序列調(diào)控序列1 1）遺傳標(biāo)記：用于重組子的篩選和鑒定遺傳標(biāo)記：用于重組子的篩選和鑒定 營養(yǎng)標(biāo)記基因：亮氨酸（營養(yǎng)標(biāo)記基因：亮氨酸（LeuLeu） 抗生素選擇標(biāo)記基因：抗生素選擇標(biāo)記基因：ZeocinZeocin 2）調(diào)控序列調(diào)控序列 ARS：酵母復(fù)制起始

18、區(qū)：酵母復(fù)制起始區(qū)(點(diǎn)點(diǎn)) 酵母啟動(dòng)子：常用的有酵母啟動(dòng)子：常用的有: PGK(磷酸甘油激酶磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脫氫酶）磷酸甘油醛脫氫酶） ADH1(醇脫氫酶醇脫氫酶) SUC(蔗糖酶蔗糖酶) Apase(堿性磷酸酶堿性磷酸酶) 酵母著絲粒區(qū)段酵母著絲粒區(qū)段(CEN)：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性：增加轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定性 3 3、類型、類型( types) ( types) 酵母克隆載體酵母克隆載體(yeast clone vector) ：不含酵母啟動(dòng)子，不能在酵母中不含酵母啟動(dòng)子，不能在酵母中表達(dá)外源基因，如表達(dá)外源基因，如YIPYIP、YRPYRP、YEPYEP 酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體

19、(yeast expression vector) )：酵母克隆載體酵母克隆載體+ +酵母啟動(dòng)子酵母啟動(dòng)子, ,若引入信號(hào)肽序列，則成為分泌型載體若引入信號(hào)肽序列，則成為分泌型載體 酵母人工染色體（酵母人工染色體（yeast artificial chromosome, YAC) ) 克隆大片段克隆大片段DNADNA， 2M質(zhì)粒質(zhì)粒：酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀酵母核質(zhì)中的小的環(huán)狀DNA，可以獨(dú)立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。可以獨(dú)立復(fù)制并轉(zhuǎn)錄。（1）酵母克隆載體的構(gòu)建）酵母克隆載體的構(gòu)建 酵母整合型質(zhì)粒酵母整合型質(zhì)粒( yeast integrated plasmid. Yip)( yeast integrated

20、plasmid. Yip) 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNA+DNA+酵母遺傳標(biāo)記，通過同源重組整合入酵母染色酵母遺傳標(biāo)記，通過同源重組整合入酵母染色體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低體，轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)化率極低。 酵母復(fù)制型質(zhì)粒酵母復(fù)制型質(zhì)粒(Yeast replicable plasmid, YRp)(Yeast replicable plasmid, YRp) 細(xì)菌質(zhì)粒細(xì)菌質(zhì)粒DNA+DNA+酵母遺傳標(biāo)記酵母遺傳標(biāo)記(YIp)+(YIp)+酵母復(fù)制序列酵母復(fù)制序列(ARS(ARS),),可可自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差自主復(fù)制，但穩(wěn)定性差 酵母附加子型質(zhì)粒酵母附加子型質(zhì)粒, YEp, YEp ：細(xì)菌質(zhì)粒：細(xì)菌質(zhì)

21、粒DNA+DNA+酵母標(biāo)記基因酵母標(biāo)記基因(YIp)+(YIp)+酵母酵母2 2MM質(zhì)粒質(zhì)粒，游離于核外存在并自主復(fù)制，游離于核外存在并自主復(fù)制酵母酵母復(fù)制復(fù)制序列序列酵母酵母2M質(zhì)粒質(zhì)粒（2）酵母表達(dá)載體）酵母表達(dá)載體 特點(diǎn)特點(diǎn)：含酵母啟動(dòng)子：含酵母啟動(dòng)子 穿梭載體穿梭載體(shuttle vector)： 既可以攜帶外既可以攜帶外源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制，又可以使其在真核細(xì)源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制，又可以使其在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體。胞中表達(dá)的載體。 種類種類：啤酒酵母表達(dá)載體：啤酒酵母表達(dá)載體 畢赤酵母表達(dá)載體：畢赤酵母表達(dá)載體： 分泌型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體 非分泌型表達(dá)非分泌型表達(dá)啤酒酵母

22、表達(dá)載體啤酒酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體畢赤酵母表達(dá)載體-整合型整合型(3) (3) 酵母人工染色體（酵母人工染色體（yeast artificial yeast artificial chromosome,YAC)- chromosome,YAC)-克隆大片段克隆大片段DNADNA 由下列元件組成由下列元件組成 酵母染色體酵母染色體 2umDNA2umDNA的復(fù)制起始區(qū)的復(fù)制起始區(qū) 著絲粒序列（著絲粒序列（CEN)CEN) 四膜蟲端粒四膜蟲端粒DNA(TEL)DNA(TEL) YAC: 利用酵母的著絲粒區(qū)段（利用酵母的著絲粒區(qū)段（CEN ）、自動(dòng)復(fù)制序列）、自動(dòng)復(fù)制序列（ARS）及）及四膜蟲

23、端粒四膜蟲端粒DNA(TEL)DNA(TEL)構(gòu)建的人工染色體構(gòu)建的人工染色體 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： 左臂：左臂：TEL、選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記、ARS 、CEN 右臂：右臂：TEL、選擇標(biāo)記、選擇標(biāo)記 特點(diǎn)：容量大（特點(diǎn)：容量大（50-1000kb），穩(wěn)定性差），穩(wěn)定性差 作用：構(gòu)建基因組文庫作用：構(gòu)建基因組文庫 二）受體細(xì)胞二）受體細(xì)胞 1 1. .啤酒酵母：啤酒酵母： 較早使用，了解清楚較早使用，了解清楚 安全性高，被安全性高，被FDAFDA確認(rèn)為安全生物確認(rèn)為安全生物 表達(dá)量較低表達(dá)量較低 過量糖基化過量糖基化 轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，易發(fā)生質(zhì)粒丟失2. 畢赤酵母：畢赤酵母：新發(fā)

24、展的酵母受體細(xì)胞新發(fā)展的酵母受體細(xì)胞 高表達(dá)（高表達(dá)（12g/L） 高穩(wěn)定高穩(wěn)定-載體為整合型載體為整合型 高分泌（高分泌（10g/L）三）三）轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 1. 原生質(zhì)體法：去除厚壁原生質(zhì)體法：去除厚壁 2.電穿孔法：效率較高，整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切電穿孔法：效率較高，整合型載體轉(zhuǎn)化前要酶切線性化線性化3. LiCl法：做成感受態(tài)細(xì)胞法：做成感受態(tài)細(xì)胞四）外源基因在酵母菌中的表達(dá)四）外源基因在酵母菌中的表達(dá)1 1、胞內(nèi)表達(dá)：、胞內(nèi)表達(dá)：直接表達(dá)外源基因，直接表達(dá)外源基因， 如：如：HBsAgHBsAg的酵母重組疫苗的酵母重組疫苗2 2、分泌表達(dá)：、分泌表達(dá)：在在MCS前加入信號(hào)肽序列，前加入信號(hào)

25、肽序列， pGAPZ ,利用利用 因子分泌表達(dá)因子分泌表達(dá) 五）高表達(dá)的策略五）高表達(dá)的策略（1 1）利用誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子：）利用誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子：畢赤酵母表達(dá)載體中常用啟動(dòng)能畢赤酵母表達(dá)載體中常用啟動(dòng)能力強(qiáng)的力強(qiáng)的GAPGAP啟動(dòng)子啟動(dòng)子（2 2）提高整合拷貝數(shù)：）提高整合拷貝數(shù)：可利用載體中提供的抗生素遺傳標(biāo)記，利用載體中提供的抗生素遺傳標(biāo)記，以抗生素加壓篩選含有多拷貝的轉(zhuǎn)化子以抗生素加壓篩選含有多拷貝的轉(zhuǎn)化子。（3 3）控制蛋白酶降解活性）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改變采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改變發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)基的PHPH值，或在培養(yǎng)基中補(bǔ)加氨基酸或多肽，均可值，或在

26、培養(yǎng)基中補(bǔ)加氨基酸或多肽，均可避免產(chǎn)物被降解避免產(chǎn)物被降解。（4 4）分泌表達(dá)：）分泌表達(dá)：也是一種避免產(chǎn)物被降解的良好策略也是一種避免產(chǎn)物被降解的良好策略。酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)Yeast Two-Hybrid System 酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母酵母中進(jìn)行的，研究中進(jìn)行的，研究活活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能通過也能通過報(bào)告基因報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到。的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測得到。 1989年美國紐約州立大學(xué)的年美國紐約州立大學(xué)的Fields和和Song首先

27、描述了酵母首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母雙雜交實(shí)。蛋白的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相驗(yàn)是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對(duì)真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實(shí)驗(yàn)。互作用對(duì)真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實(shí)驗(yàn)。 很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和很早就已知道，轉(zhuǎn)錄活化蛋白可以和DNA 上特異的序上特異的序列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種列結(jié)合而啟動(dòng)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這種DNA 結(jié)合與轉(zhuǎn)結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄活化蛋白上兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域

28、即即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域域 (Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個(gè)結(jié)分別來完成的，并且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄活化都是必須的 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, 單獨(dú)存單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者

29、通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。 基本原理基本原理 在利用在利用GAL4 系統(tǒng)篩選系統(tǒng)篩選cDNA 文庫或研究蛋白間的相文庫或研究蛋白間的相互作用時(shí)，互作用時(shí)，DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即“誘餌誘餌”相結(jié)合，相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗(yàn)證的蛋白相結(jié)合。一般轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗(yàn)證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨(dú)的情況下，單獨(dú)的BD 可以與可以與GAL4 上游活化序列（上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，

30、單獨(dú)的）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的AD 則不能與則不能與GAL UAS 結(jié)合，只有當(dāng)結(jié)合，只有當(dāng)BD 與與AD 分別表達(dá)的融合蛋白由于相分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時(shí)，互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時(shí)，BD 與與AD 才能才能與與GAL UAS 結(jié)合并且引起報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)合并且引起報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。ADYADYXDNA-BDGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ(or HIS) reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ(or

31、HIS) reporter geneXDNA-BDtranscriptiontranscription已知蛋白已知蛋白X與與BD-fusion -誘餌（誘餌（bait）未知蛋白未知蛋白Y與與AD-fusion -獵物或靶蛋白（獵物或靶蛋白（prey or target protein）報(bào)告基因（報(bào)告基因（reporter gene） -Lac Z（編碼（編碼-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）LacZ reporter - Blue/White ScreeningHIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increa

32、se selectivity)LEU2 reporter - Screen on Leu+ mediaADE2 reporter - Screen on Ade+ mediaURA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA)報(bào)告基因報(bào)告基因已知蛋白的已知蛋白的cDNAcDNA序列為誘餌序列為誘餌(bait)(bait)，將其與，將其與DNADNA結(jié)合域（結(jié)合域（BDBD）融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒將待篩選蛋白的將待篩選蛋白的cDNAcDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域序列與轉(zhuǎn)錄激活域(A

33、D)(AD)融合，構(gòu)建成融合，構(gòu)建成文庫質(zhì)粒文庫質(zhì)粒將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中將這兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞中酵母細(xì)胞中，已分離的酵母細(xì)胞中，已分離的DNADNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域不會(huì)相互作用，但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激但誘餌蛋白若能與待篩選的未知蛋白特異性地相互作用，則可激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)1. 高敏感性。高敏感性。2. 真實(shí)性。真實(shí)性。檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力檢測在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。無需模擬，在一定程度上代

34、表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。3. 簡潔性。簡潔性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。4. 廣泛性。廣泛性。采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的采用不同組織器官細(xì)胞類型和分化時(shí)期的材料構(gòu)建材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功文庫，能分析不同亞細(xì)胞部位和功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合能的蛋白質(zhì)，適用于部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白。蛋白。 分析已知蛋白之間的相互作用分析已知蛋白之間的相互作用 對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)功能域的分析，如可將待測蛋白質(zhì)進(jìn)行點(diǎn)突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行

35、雙雜交。突變或缺失突變?cè)龠M(jìn)行雙雜交。 用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交用已知功能蛋白質(zhì)篩選雙雜交cDNA文庫，研究蛋文庫，研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑，發(fā)現(xiàn)新基因。 分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。去篩選文庫，再根據(jù)篩的已知基因推測新基因功能。 繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜繪制蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)圖譜 在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用在藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用現(xiàn)狀 進(jìn)行完全的翻譯后修飾進(jìn)行完全的翻譯后修飾 可表達(dá)產(chǎn)生有功能的膜蛋白可表達(dá)產(chǎn)

36、生有功能的膜蛋白 用途：表達(dá)大量的外源蛋白用途：表達(dá)大量的外源蛋白 研究基因的功能研究基因的功能 基因治療基因治療兩部分：兩部分： 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 受體：哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體：哺乳動(dòng)物細(xì)胞二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)二、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1 1、主要元件主要元件2 2、載體的類型載體的類型 非病毒性載體非病毒性載體 病毒性載體病毒性載體 一）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體一）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體(一）主要元件一）主要元件1）啟動(dòng)子啟動(dòng)子 病毒來源的病毒來源的： SV40 : 綠猴空泡病毒（綠猴空泡病毒（Simian vacuolating virus-40） CMV: 巨細(xì)胞病毒（巨細(xì)胞病毒

37、（Cytomegalovirus ） RSV: 肉瘤病毒（肉瘤病毒（Rous sarcoma virus） ADV: adenovirus （腺病毒）（腺病毒） LTR: 逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列（逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat from retrovirus） 細(xì)胞來源的細(xì)胞來源的： HSP：heat shock protein（熱休克蛋白）（熱休克蛋白）(Promoter + ori) (PolyA)ori2）增強(qiáng)子增強(qiáng)子 許多來源于病毒的許多來源于病毒的增強(qiáng)子增強(qiáng)子在不同種屬細(xì)胞中都有極強(qiáng)在不同種屬細(xì)胞中都有極強(qiáng)的促進(jìn)轉(zhuǎn)錄能力的促進(jìn)轉(zhuǎn)錄能力 SV40

38、enhancer RSV enhancer CMV enhancer LTR enhancer3 3）篩選標(biāo)記篩選標(biāo)記 胸苷激酶胸苷激酶(tk)基因基因 Thymidine kinase gene 二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶(dhfr)基因基因 Dihydrofolate reductase ,dhfr 新霉素抗性基因新霉素抗性基因 neomycin resistance gene胸苷激酶胸苷激酶(tk)(tk)基因基因tk+細(xì)胞細(xì)胞中：胸苷中：胸苷(T) 胸苷胸苷一一磷酸磷酸二氫葉酸二氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 四氫葉酸四氫葉酸 dCTPdATP dTTP氨基喋呤氨基喋呤(Amin

39、opterin) tk阻斷阻斷補(bǔ)加次黃嘌呤（補(bǔ)加次黃嘌呤（Hypoxanthine）死亡死亡存活存活DihydrofolateThymidine（1）（2）（3）HAT二氫葉酸還原二氫葉酸還原酶基因篩選法原理酶基因篩選法原理 攜帶外源基因的載體連接有攜帶外源基因的載體連接有dhfr基因基因，可以表達(dá)，可以表達(dá)二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶 以以dhfr-細(xì)胞為受體細(xì)胞為受體 :CHO細(xì)胞細(xì)胞 dhfr-細(xì)胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入細(xì)胞無法在普通培養(yǎng)基中存活，而轉(zhuǎn)化入dhfr基因后可以存活，并表達(dá)外源基因?；蚝罂梢源婊?，并表達(dá)外源基因。 若在培養(yǎng)基內(nèi)加入若在培養(yǎng)基內(nèi)加入甲氨蝶呤甲氨蝶呤，

40、進(jìn)行加壓篩選，可，進(jìn)行加壓篩選，可以提高外源基因表達(dá)量以提高外源基因表達(dá)量 新霉素的類似物新霉素的類似物G418對(duì)原核、真核均有毒對(duì)原核、真核均有毒 neo編碼的酶可使編碼的酶可使G418滅活滅活 此種篩選方法對(duì)受體細(xì)胞無要求，應(yīng)用更簡便此種篩選方法對(duì)受體細(xì)胞無要求，應(yīng)用更簡便新霉素抗性基因新霉素抗性基因(neo)(neo)4）轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸信號(hào)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多聚腺苷酸信號(hào) 使轉(zhuǎn)錄后的使轉(zhuǎn)錄后的mRNA 能有效進(jìn)行切割和多聚腺能有效進(jìn)行切割和多聚腺苷酸化苷酸化多聚腺苷多聚腺苷酸信號(hào)酸信號(hào)5 5）復(fù)制元件：）復(fù)制元件： 使載體在受體細(xì)胞中復(fù)制，使載體在受體細(xì)胞中復(fù)制， 提高外源基因的表

41、達(dá)水平提高外源基因的表達(dá)水平6 6）原核細(xì)胞的部分序列）原核細(xì)胞的部分序列 在原核細(xì)胞復(fù)制的復(fù)制起始為點(diǎn)（在原核細(xì)胞復(fù)制的復(fù)制起始為點(diǎn)（ori)ori) 在原核細(xì)胞復(fù)制篩選的抗生素抗性基因在原核細(xì)胞復(fù)制篩選的抗生素抗性基因（AMPrAMPr） 復(fù)制元件復(fù)制元件復(fù)制元件復(fù)制元件 1 1）非病毒性載體非病毒性載體 2 2）病毒性載體病毒性載體：腺病毒，慢病毒等：腺病毒，慢病毒等2、 載體的類型載體的類型1）非病毒型非病毒型 (復(fù)制子型復(fù)制子型, 質(zhì)粒型）質(zhì)粒型） 由真核復(fù)制信號(hào)、啟動(dòng)子由真核復(fù)制信號(hào)、啟動(dòng)子,轉(zhuǎn)錄單位及轉(zhuǎn)錄單位及質(zhì)粒片段組成質(zhì)粒片段組成,不需要包裝細(xì)胞。不需要包裝細(xì)胞。 如：如：

42、pSV系列、系列、pCDNA3等等( (二）載體的類型二）載體的類型2）病毒型載體病毒型載體 外源外源DNA插入病毒插入病毒DNA或或取代病毒基因某一片段，取代病毒基因某一片段，重組重組DNA隨病毒顆粒而復(fù)隨病毒顆粒而復(fù)制制 (多需輔助病毒或包裝細(xì)多需輔助病毒或包裝細(xì)胞的存在胞的存在)。如：。如：逆轉(zhuǎn)錄病逆轉(zhuǎn)錄病毒載體毒載體、腺病毒載體腺病毒載體等等病毒型載體的類型病毒型載體的類型 整合型整合型 整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制整合入宿主染色體，隨染色體復(fù)制而復(fù)制 可持續(xù)表達(dá)外援基因可持續(xù)表達(dá)外援基因 安全性低：插入誘變安全性低：插入誘變 SV40SV40載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體載

43、體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體 游離型游離型 不整合不整合 生物安全性高生物安全性高 瞬時(shí)表達(dá)瞬時(shí)表達(dá) 腺病毒載體、痘苗病毒載體腺病毒載體、痘苗病毒載體1、CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞）細(xì)胞（中國倉鼠卵巢癌細(xì)胞） -可大規(guī)模培養(yǎng)可大規(guī)模培養(yǎng)2、COS細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系）：可合成細(xì)胞（猴腎細(xì)胞系）：可合成SV40復(fù)制的大復(fù)制的大T抗抗原，可使每個(gè)細(xì)胞中的原，可使每個(gè)細(xì)胞中的SV40載體拷貝數(shù)多達(dá)載體拷貝數(shù)多達(dá)10萬個(gè)，萬個(gè)，適合于大量表達(dá)適合于大量表達(dá)SV40載體上的基因載體上的基因3、其他動(dòng)物的細(xì)胞：、其他動(dòng)物的細(xì)胞： 如如Hela細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）、HEK293細(xì)胞細(xì)胞二）受體細(xì)胞二）受體細(xì)胞-哺乳動(dòng)物細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞三）基因轉(zhuǎn)移技術(shù)三）基因轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蛞再|(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞導(dǎo)入細(xì)胞的方法。的方法。 1. 磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法 2. DEAE-Dextran 3. 脂