高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)

關(guān)于高效液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)12

目的:規(guī)范島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。范圍:適用于島津LC-10AT型高效液相色譜儀的使用。職責(zé):質(zhì)檢員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。

第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月3一、系統(tǒng)組成

本系統(tǒng)由2個(gè)LC-10ATvp溶劑輸送泵（分主/A泵和副/B泵）、Rheodyne7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、SPD-10Avp紫外-可見檢測器、N2000色譜數(shù)據(jù)工作站和電腦等組成，另外還包括打印機(jī)、不間斷電源等輔助設(shè)備。

第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月4

二、準(zhǔn)備

1、準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相，用合適的0.45μm濾膜過濾，超聲脫氣20min。2、根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱（注意方向）和定量環(huán)。3、配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制），用合適的0.45μm濾膜過濾。（注意腐蝕性與有機(jī)系的的溶劑）4、檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。

第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月5

接通電源，依次開啟不間斷電源、B泵、A泵、檢測器，待泵和檢測器自檢結(jié)束后，打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī)，最后打開色譜工作站。

三、開機(jī)第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月6四、參數(shù)設(shè)定

1、波長設(shè)定：在檢測器顯示初始屏幕時(shí)，按[func]鍵，用數(shù)字鍵輸入所需波長值，按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出到初始屏幕。2、流速設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[func]鍵，用數(shù)字鍵輸入所需的流速（柱在線時(shí)流速一般不超過1ml/min），按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出。3、流動(dòng)相比例設(shè)定：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[conc]鍵，用數(shù)字鍵輸入流動(dòng)相B的濃度百分?jǐn)?shù)，按[Enter]鍵確認(rèn)。按[CE]鍵退出。

第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月7四、參數(shù)設(shè)定4、梯度設(shè)定：

4.1：在A泵顯示初始屏幕時(shí)，按[edit]鍵，[Enter]鍵；

4.2：用數(shù)字鍵輸入時(shí)間，按[Enter]鍵，重復(fù)按[func]鍵選擇所需功能（FLOW設(shè)定流速，BCNC設(shè)定流動(dòng)相B的濃度），按[Enter]鍵，用數(shù)字鍵輸入設(shè)定值，按[Enter]鍵；

4.3：重復(fù)上一步設(shè)定其它時(shí)間步驟；

4.4：用數(shù)字鍵輸入停止時(shí)間，重復(fù)按[func]鍵直至屏幕顯示STOP，按[Enter]鍵。按[CE]鍵退出。

第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月8五、更換流動(dòng)相并排氣泡

1：將A/B管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液瓶中；2：逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)A/B泵的排液閥180°，打開排液閥；3：按A/B泵的[purge]鍵，pump指示燈亮，泵大約以9.9ml/min的流速?zèng)_洗，3min（可設(shè)定）后自動(dòng)停止；4：將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底，關(guān)閉排液閥。5：如管路中仍有氣泡，則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。6：如按以上方法不能排盡氣泡，從柱入口處拆下連接管，放入廢液瓶中，設(shè)流速為5ml/min，按[pump]鍵，沖洗3min后再按[pump]鍵停泵，重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。

第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月9六、平衡系統(tǒng)

1、查看基線：1.1：按《N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程》打開“在線色譜工作站”軟件，1.2：輸入實(shí)驗(yàn)信息并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后，1.3：按下“數(shù)據(jù)收集”頁的[]按鈕。

第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月10六、平衡系統(tǒng)

2、等度洗脫方式

2.1：按A泵的[pump]鍵，A、B泵將同時(shí)啟動(dòng)，pump指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。

2.2：檢查各管路連接處是否漏液，如漏液應(yīng)予以排除。

2.3：觀察泵控制屏幕上的壓力值，壓力波動(dòng)應(yīng)不超過1MPa。如超過則可初步判斷為柱前管路仍有氣泡，按檢查管路后再操作。

2.4：觀察基線變化。如果沖洗至基線漂移<0.01mV/min，噪聲為<0.001mV時(shí)，可認(rèn)為系統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài)，可以進(jìn)樣。第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月11六、平衡系統(tǒng)

3、梯度洗脫方式

3.1：以檢驗(yàn)方法規(guī)定的梯度初始條件，按2項(xiàng)下方法平衡系統(tǒng)。

3.2：在進(jìn)樣前運(yùn)行1~2次空白梯度。方法：按A泵的[run]鍵，prog.run指示燈亮，梯度程序運(yùn)行；程序停止時(shí)，prog.run指示燈滅。第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月12七、進(jìn)樣1、進(jìn)樣前按檢測器[zero]鍵調(diào)零，按軟件中[零點(diǎn)校正]按鈕校正基線零點(diǎn)，再按一下[查看基線]按鈕使其彈起。2、用試樣溶液清洗注射器，并排除氣泡后抽取適量即可以進(jìn)樣了。3、含量測定的對(duì)照溶液和樣品供試溶液每份至少注樣2次。第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月13八、譜圖的判斷及結(jié)果計(jì)算系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：三個(gè)重要指標(biāo)①分離度（加強(qiáng)）：一般應(yīng)≥1.5。②重復(fù)性：兩次譜圖的峰面積應(yīng)相差不的過1%。③理論塔板數(shù)：應(yīng)≥規(guī)定的理論塔板數(shù)目。

④拖尾因子：0.95＜T＜1.05⑤保留時(shí)間：對(duì)照與樣品的主成分保留時(shí)間應(yīng)大致一致。⑥RSD：＜3%第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月14八、譜圖的判斷及結(jié)果計(jì)算1、內(nèi)標(biāo)法用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式算出校正因子（f）：其中As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和對(duì)照品的量。第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月15八、譜圖的判斷及結(jié)果計(jì)算2、外標(biāo)法：①用含對(duì)照品的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算比值（r）：r=mr/Ar（其中mr和Ar分別為對(duì)照品的量和相應(yīng)的峰面積或峰高。）②再根據(jù)供試品溶液的色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算供試品中被測成分的含量（mi）：mi=r×Ai（其中Ai為供試品溶液中被測成分的峰面積或峰高）。③必要時(shí)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量折算成百分含量。第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月16

九、清洗管路及進(jìn)樣口1、分析完畢后，先關(guān)檢測器和數(shù)據(jù)處理機(jī)，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，正相柱一般用正已烷，反相柱如使用過含鹽流動(dòng)相，則先用水，然后用甲醇-水沖洗，沖洗前先按（4.1.1~4.1.2）操作，再用分析流速?zèng)_洗，各種沖洗劑一般沖洗15~30分鐘，特殊情況應(yīng)延長沖洗時(shí)間。第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月17

九、清洗管路及進(jìn)樣口2、沖洗完畢后，逐步降低流速至0，關(guān)泵，進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可使用進(jìn)樣閥所附專用沖洗接頭。3、關(guān)斷電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、柱壓，使用小時(shí)數(shù)，儀器完好狀態(tài)等。第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月18【特殊情況】：譜流路系統(tǒng)，從泵、進(jìn)樣器、色譜柱、到檢測器通池，在分析完畢后，均應(yīng)按（5.1）充分沖洗，特別是用過含鹽流動(dòng)相的，更應(yīng)注意先用水，再用甲醇-水，充分沖洗。

九、清洗管路及進(jìn)樣口第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月19謝謝大家！第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月20第二節(jié)島津LC-10AT型HPLC注意事項(xiàng)第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月21一、流動(dòng)相1、流動(dòng)相應(yīng)選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用，過濾時(shí)注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍；2、水相流動(dòng)相需經(jīng)常更換（一般不超過2天），防止長菌變質(zhì)；3、使用雙泵時(shí)，A、B、C、D四相中，若所用流動(dòng)相中有含鹽流動(dòng)相，則A、D（進(jìn)液口位于混合器下方）放置含鹽流動(dòng)相，B、C（進(jìn)液口位于混合器上方）放置不含鹽流動(dòng)相；

A、B、C、D四個(gè)儲(chǔ)液器中其中一個(gè)為棕色瓶，用于存放水相流動(dòng)相。第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月22

二、樣品1、采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；2、用流動(dòng)相或比流動(dòng)相弱（若為反相柱，則極性比流動(dòng)相大；若為正相柱，則極性比流動(dòng)相?。┑娜軇┲苽錁悠啡芤?，盡量用流動(dòng)相制備樣品液；3、手動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣量盡量小，使用定量管定量時(shí)，進(jìn)樣體積應(yīng)為定量管的3～5倍；第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月23三、色譜柱1、使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動(dòng)相類型等；2、使用符合要求的流動(dòng)相；3、使用保護(hù)柱；4、如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。

第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月24三、色譜柱5、色譜柱在不使用時(shí)，應(yīng)用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；6、不要高壓沖洗柱子；7、不要在高溫下長時(shí)間使用硅膠鍵合相色譜柱；使用過程中注意輕拿輕放。第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月25四、操作過程1、開機(jī)操作：（1）、打開電源，用Harb相連接時(shí)，注意Harb電源，打開計(jì)算機(jī)，打開BootpServer（一般啟動(dòng)時(shí)已打開）；（2）、自上而下打開個(gè)組件電源，BootpServer里顯示有信號(hào)時(shí)（有六行字符），打開工作站（先打開Online）；（3）、打開沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開關(guān)（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準(zhǔn)；第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月26四、操作過程（4）、注意各流動(dòng)相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會(huì)自動(dòng)停泵，注意洗泵溶液的體積，及時(shí)加液；（5）、使用過程中要經(jīng)常觀察儀器工作狀態(tài)，及時(shí)正確處理各種突發(fā)事件。第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月27四、操作過程2、先以所用流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)一定時(shí)間（如所用流動(dòng)相為含鹽流動(dòng)相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動(dòng)相），正式進(jìn)樣分析前30min左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；3、建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月28四、操作過程4、使用手動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣時(shí)，在進(jìn)樣前和進(jìn)樣后都需用洗針液洗凈進(jìn)樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進(jìn)樣前必須用樣品液清洗進(jìn)樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；5、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動(dòng)相時(shí)注意保護(hù)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時(shí)，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月29四、操作過程6、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個(gè)管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關(guān)閉D燈、W燈；7、關(guān)機(jī)時(shí)，先關(guān)閉泵、檢測器等，再關(guān)閉工作站，然后關(guān)機(jī)，最后自下而上關(guān)閉色譜儀各組件，關(guān)閉洗泵溶液的開關(guān)；第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月30四、操作過程8、使用者須認(rèn)真履行儀器使用登記制度，出現(xiàn)問題及時(shí)向老師報(bào)告，不要擅自拆卸儀器。未經(jīng)操作培訓(xùn)，不得擅自使用儀器。第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月31自己總結(jié)的12條

注意事項(xiàng)

以下12條注意事項(xiàng)是自己在安裝和使用液相色譜儀中的經(jīng)驗(yàn)得出的，可能存在某些片面性，如有不當(dāng)之處請多提寶貴建議。第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月321、流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)(使用0.45um或更細(xì)的膜過濾)。2、流動(dòng)相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用。第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月333、不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液。4、使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然后用甲醇(或甲醇水溶液)沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對(duì)于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上。第33頁,共49頁，星期六，2024年，5月345.長時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相(如甲醇等)，因?yàn)榧兯组L霉。6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑(如甲醇)等清洗進(jìn)樣器。第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月357.C18柱絕對(duì)不能進(jìn)蛋白樣品，血樣、生物樣品。8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查

并清洗。清洗方法：①以異丙醇作溶劑沖洗；②放在異丙醇中間用超聲波清洗；③用10％稀硝酸清洗。

。第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月369.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡。10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相的清洗。第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月3711.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品。

12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊清洗，然后插入新的流動(dòng)相中。更換無互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過渡一下。第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月38謝謝大家！第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月39第三節(jié)高效液相色譜中常遇見的問題及處理方法第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月40一、保留時(shí)間變化1.柱溫變化2.等度與梯度間未能充分平衡3.緩沖液容量不夠4.柱污染5.柱內(nèi)條件變化6.柱快達(dá)到壽命1.柱恒溫2.至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱3.用>25mmol/L的緩沖液4.每天沖洗柱5.穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相6.采用保護(hù)柱第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月41二、保留時(shí)間縮短

1.流速增加2.樣品超載3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度增加1.檢查泵,重新設(shè)定流速2.降低樣品量3.流動(dòng)相PH值保持在3~7.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫第41頁,共49頁，星期六，2024年，5月42三、保留時(shí)間延長

1.流速下降2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化3.鍵合相流失4.流動(dòng)相組成變化5.溫度降低1.管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡2.用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱3.流動(dòng)相PH值保持在3~7.5檢查柱的方向4.防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀5.柱恒溫第42頁,共49頁，星期六，2024年，5月43四

、出現(xiàn)肩峰或分叉

1.樣品體積過大2.樣品溶劑過強(qiáng)3.柱塌陷或形成短路通道4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效5.進(jìn)樣器損壞1.用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.采用較弱的樣品溶劑3.更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子第43頁,共49頁，星期六，2024年，5月44五、鬼峰

1.進(jìn)樣閥殘余峰2.樣品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)5.水污染(反相)1.每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2.處理樣品3.重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑

(尤其是離子對(duì)色譜)4.每天新配,用抗氧化劑5.通過變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水第44頁,共49頁，星期六，2024年，5月45

六、基線噪聲

1.氣泡(尖銳峰)2.污染(隨機(jī)噪聲)3.檢測器燈連續(xù)噪聲4.電干擾(偶然噪聲)