注射劑中熱原的特征、檢測方法、污染途徑及去除方法研究

摘

要：介紹了注射劑中熱原的特征、檢測方法、污染途徑及去除方法，為制藥企業(yè)在實際生產(chǎn)過程中如何防止熱原污染和靈活選擇去除熱原的方法提供了參考。關(guān)鍵詞：熱原；特征；檢測方法；污染途徑；去除方法

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引言熱原系指由微生物產(chǎn)生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)，它包括細(xì)菌性熱原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。這里所指的“熱原”是指細(xì)菌性熱原（細(xì)菌內(nèi)毒素），它是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及其內(nèi)毒素，即細(xì)菌性熱原是由細(xì)菌在生長、繁殖過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物以及細(xì)菌死亡后從細(xì)菌尸體中釋放出的內(nèi)毒素等混合而成，主要成分是由磷脂多醇與蛋白質(zhì)結(jié)合而成的復(fù)合物，其中的磷脂多醇是復(fù)合物的活性中心，致熱作用最強，其化學(xué)組成因菌種不同而有所差異，分子量為5×104～5×105，分子量越大，致熱作用越強。當(dāng)細(xì)菌存在于藥液中，并具備細(xì)菌生長繁殖的條件時，如有水分、溫度與酸堿度適宜細(xì)菌生長、有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，細(xì)菌就會快速生長繁殖，就有可能產(chǎn)生熱原。大多數(shù)細(xì)菌和霉菌都能產(chǎn)生熱原，致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產(chǎn)物，其次是革蘭氏陽性桿菌類，革蘭氏陽性球菌則較弱，此外，霉菌、酵母菌甚至病毒也能產(chǎn)生熱原。當(dāng)注入人體的注射劑中含有的熱原量達1μg/kg時，就可引起不良反應(yīng)，發(fā)熱反應(yīng)通常在注入1h后出現(xiàn)，可使人體產(chǎn)生發(fā)冷、寒顫、發(fā)熱、出汗、惡心、嘔吐等癥狀，有時體溫可升至40℃以上，嚴(yán)重者甚至昏迷、虛脫，如不及時搶救，可危及生命。鑒于注射劑中的熱原對人體的危害極大，本文將對熱原的特征、檢測方法、污染途徑和去除方法進行研究總結(jié)。

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注射劑中熱原的特征1.1

水溶性熱原能溶于水，其濃縮液往往有乳光。1.2

耐熱性熱原在60℃干熱1h條件下不受影響，100℃時也不會分解，在120℃干熱4h條件下能被破壞98%左右，在180～200℃干熱180min、250℃干熱30min、350℃干熱5min、650℃干熱1min條件下則可被徹底破壞。而通常采用的注射劑濕熱滅菌條件，不能破壞熱原。1.3

濾過性熱原體積?。ㄩL度1～5nm），能通過一般的除菌過濾器，不能被截留除去，但用小于1nm孔徑的微孔濾膜或超過濾器濾過，則可濾去絕大部分甚至全部熱原。1.4

不揮發(fā)性熱原本身不揮發(fā)，溶于水，但可隨水蒸氣的霧滴夾帶入蒸餾水中，故蒸餾水器均設(shè)隔膜裝置。1.5

可吸附性熱原能被活性炭、白陶土、硅藻土等吸附，但屬非特異性吸附，藥物也會被吸附造成損失。此外，熱原還可被離子交換樹脂，尤其是陰離子交換樹脂所交換而除去。1.6

可破壞性熱原可被強堿、強酸、氧化劑等破壞，故可用強堿或強酸、清潔液來處理帶熱原的容器具。

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注射劑中熱原的檢測方法2.1

家兔法由于家兔對熱原的反應(yīng)與人基本相似，因此，家兔法是各國藥典規(guī)定的檢查熱原的法定方法。2015版《中國藥典》規(guī)定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定。家兔法檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性取決于試驗動物的狀況、試驗室條件和操作的規(guī)范性。家兔法檢測內(nèi)毒素的靈敏度為0.001μg/mL，試驗結(jié)果接近人體真實情況，但操作繁瑣、費時，不能用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控，且不適用于放射性藥物、腫瘤抑制劑等細(xì)胞毒性藥物制劑的熱原檢測。2.2

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法（鱟試劑法）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法包括凝膠法和光度測定法兩種，前者利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，系分別利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化及產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來測定內(nèi)毒素。鱟試劑法檢查內(nèi)毒素的靈敏度為0.0001μg/mL，比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試驗費用低，結(jié)果迅速可靠，適用于注射劑生產(chǎn)過程中的熱原控制以及家兔法不能檢測的某些細(xì)胞毒性藥物制劑的檢測，但其對革蘭氏陰性菌以外的內(nèi)毒素檢測不靈敏，鱟試劑法尚不能完全代替家兔法。鱟試劑法中使用的鱟試劑是由海洋生物鱟的血液變形細(xì)胞溶解物制成的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原、凝固蛋白原，是從棲生于海洋的節(jié)肢動物“鱟”的藍色血液中提取變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥而成的生物試劑，能夠準(zhǔn)確、快速地定性或定量檢測樣品中是否含有細(xì)菌內(nèi)毒素和（1，3）-β-葡聚糖。鱟試劑法是國際上至今為止檢測內(nèi)毒素最好的方法，它簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確，因而被歐美藥典及我國藥典定為法定的內(nèi)毒素檢查法，并已被世界各國所采用。3

注射劑中熱原的污染途徑3.1

生產(chǎn)過程中操作人員帶入在注射劑的生產(chǎn)過程中，操作人員如果不按要求進行著裝和操作，就有可能污染經(jīng)過處理的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)和藥液，進而把熱原帶入注射劑中。3.2

生產(chǎn)過程中生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)帶入在生產(chǎn)注射劑時，生產(chǎn)注射劑的設(shè)備、管道、過濾器、容器、用具等，使用前未徹底清洗、滅菌和除盡熱原，均有可能污染注射劑。3.3

原輔料帶入某些原輔料，如中藥提取物、蔗糖、含蛋白為主的生物制品等，由于細(xì)菌容易繁殖而引起熱原污染。原輔料被熱原污染的原因有很多，如包裝不符合要求、包裝出現(xiàn)破損或貯存時間長久，以及許多藥品本身適于微生物生長，所以在選用原輔料時應(yīng)多加注意。3.4

由溶劑帶入注射用水含熱原是注射劑中熱原的主要污染途徑。由于蒸餾器結(jié)構(gòu)不合理、操作不當(dāng)、容器不潔凈、放置時間過久等都會引起熱原污染。在注射劑的配制過程中，溶劑最好是新鮮制備的，如注射用水貯藏時間過久，被細(xì)菌污染后，細(xì)菌很快繁殖，短時間內(nèi)可產(chǎn)生大量熱原，雖然隨后還會進行滅菌操作，但是已有熱原存在，不易除去，因而易產(chǎn)生熱原反應(yīng)。因此，配制注射劑時應(yīng)使用新鮮注射用水，最好隨制隨用，2010版GMP規(guī)定注射用水可采用70℃以上保溫循環(huán)的方式存放。3.5

由生產(chǎn)工藝帶入如果生產(chǎn)工藝中制定的去除熱原的參數(shù)，如溫度、時間、酸堿濃度、膜孔徑等制定不正確，將無法徹底除去生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)、接觸藥液的內(nèi)包裝材料和藥液半成品中的熱原，進而造成注射劑受熱原污染。3.6

生產(chǎn)過程中的環(huán)境帶入注射劑的整個生產(chǎn)過程要求在規(guī)定的潔凈環(huán)境中進行，盡可能減少微生物污染的風(fēng)險。注射劑的潔凈生產(chǎn)環(huán)境按2010版GMP的規(guī)定，一般分為A級、B級、C級、D級，如果生產(chǎn)環(huán)境不符合GMP要求，就會增加微生物污染的風(fēng)險。3.7

臨床應(yīng)用前帶入注射劑成品在保存及運輸過程中，由于操作不當(dāng)，造成注射劑的內(nèi)包裝損壞，污染注射劑進而產(chǎn)生熱原。3.8

從輸液器中帶入有時注射劑本身雖不含熱原，但注射后卻有熱原反應(yīng)，這很可能是由于輸液用具受污染產(chǎn)生熱原，輸液用具包括一次性輸液器、一次性輸液管等。3.9

在注射過程中帶入（1）在輸液過程中加入其他藥物時，所加藥物本身已被污染，產(chǎn)生熱原；（2）加藥時操作室的潔凈度差，環(huán)境不符合要求，消毒及注射操作方法違規(guī)；（3）加藥后放置時間長，增加了污染的風(fēng)險。

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注射劑中熱原的去除方法4.1

利用熱原的水溶性去除熱原4.1.1

密閉的生產(chǎn)設(shè)備系統(tǒng)采用在線清洗/滅菌的方法，用新鮮注射用水在線清洗15min、121℃在線滅菌15min的方法建立無熱原、無菌的密閉的生產(chǎn)設(shè)備系統(tǒng)。4.1.2

生產(chǎn)用容器具不能在線清洗/滅菌的生產(chǎn)用容器具，可用新鮮注射用水清洗15min、濕熱滅菌柜121℃滅菌15min或者115℃滅菌30min的方法，確保容器具無熱原、無菌。利用在線沖洗和在線滅菌相結(jié)合的方式去除熱原，雖然操作方便，但是會浪費大量的注射用水。4.2

利用熱原不耐干熱的特性去除熱原對耐受高溫處理的制藥用生產(chǎn)用容器具，可采用180～200℃干熱180min、250℃干熱30min、350℃干熱5min的方法清除生產(chǎn)用容器具的熱原。4.3

利用熱原體積小的特性去除熱原采用小于1nm孔徑的微孔濾膜或超過濾器過濾藥液，可除去液體內(nèi)的熱原。4.4

利用熱原的可吸附性[3]去除熱原通常藥液里的熱原可選用優(yōu)質(zhì)活性炭（針劑用）、白陶土、硅藻土進行吸附。但是，使用活性炭吸附熱原時需要注意以下事項：（1）活性炭的臨界吸附溫度為45～50℃，當(dāng)溫度低于臨界吸附溫度時，活性炭的吸附效力較差，除需冷藏和不便加熱的藥液外，使用時一般藥液經(jīng)加熱煮沸后吸附15～30min，再冷卻至45～5O℃過濾脫炭，脫炭最好在短時間內(nèi)完成，以免溫度下降或在放置過程中發(fā)生脫吸附作用，使制劑雜質(zhì)增多。（2）活性炭的用量應(yīng)視原料質(zhì)量、品種而定，常用量為0.1%～0.5%（W/V）。若用量不足，對雜質(zhì)、熱原等不能完全吸附；若用量過大，其所含的水溶性雜質(zhì)可對藥液造成污染，影響制劑質(zhì)量?；钚蕴康挠昧颗c活性炭的吸附力、活性炭對藥物的吸附力、溶媒的性質(zhì)、藥物的結(jié)構(gòu)等因素都有關(guān)系?；钚蕴吭谒斜仍谟袡C溶媒中的吸附力強；對極性基團多的化合物的吸附力大于對極性基團少的化合物；對芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；對分子量大的化合物吸附力大于分子量小的化合物。因此，對主藥含量低或主藥易被活性炭吸附的制劑，活性炭的用量最好控制在0.05%（W/V），并通過計算適當(dāng)增加主藥投料量。4.5

利用熱原大分子上含磷酸根與羧酸根的特性去除熱原熱原這類大分子上含磷酸根與羧酸根，往往帶有負(fù)電荷，故易被強堿性陰離子交換樹脂所交換，可采用離子交換法除去藥液中的熱原。4.6

利用熱原可被強堿、強酸、氧化劑等破壞的特性去除熱原可使用強堿或強酸來處理帶熱原的制藥用生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)、容器具，具體方法是使用低濃度的強堿（如1%的氫氧化鈉溶液）或強酸對配液罐及其管道、容器具浸泡8h，用高濃度的強堿（如10%的氫氧化鈉溶液）或強酸對配液罐及其管道、容器具進行擦拭，存放8h，就可以除去生產(chǎn)設(shè)備及附屬系統(tǒng)、容器具上的熱原。這種去除方法的缺點是浪費時間，優(yōu)點是能夠節(jié)省大量的注射用水。4.7

利用凝膠過濾法去除熱原凝膠可作為分子篩，利用熱原與藥物分子量的差異，將兩者分開。但當(dāng)兩者分子量相差不大時，不宜使用該方法。4