組培苗生產技術-組培苗的培養(yǎng)與觀察統(tǒng)計（植物組織培養(yǎng)課件）

外植體的離體培養(yǎng)技術

八、試管苗的增殖培養(yǎng)（一）繼代培養(yǎng)中擴繁的方法1.切割莖段2.分離芽叢3.分離胚狀體4.分離根狀莖（二）繼代培養(yǎng)中材料的接種方式1243（三）培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件對繼代培養(yǎng)的影響1.苗分化數量少、速度慢、分枝少、個別苗生長細高

改進措施：增加細胞分裂素用量，適當降低溫度，改善光照，改單芽繼代為團塊（叢芽）繼代。

可能原因：細胞分裂素用量不足，溫度偏高，光照不足。

可能原因：細胞分裂素用量過多，溫度不適宜。3.分化率低,畸形,培養(yǎng)時間長時苗再次愈傷組織化

改進措施：減少或停用細胞分裂素一段時間，調節(jié)溫度。

可能原因:生長素用量偏高,溫度偏高。

改進措施：減少生長素用量，適當降溫。

2.苗分化過多，生長慢，有畸形苗，節(jié)間極短，苗叢密集，微型化4.葉粗厚變脆5.再生苗的葉緣、葉面等處偶有不定芽分化出來

可能原因：生長素用量偏高，或兼有細胞分裂素用量偏高。

改進措施：適當減少激素用量，避免葉片接觸培養(yǎng)基。

可能原因：細胞分裂素用量偏高，或表明該種植物適于該種再生方式。

改進措施：適當減少細胞分裂素用量，或分階段地利用這一再生方式。

6.叢生苗過于細弱，不適于生根或移栽

改進措施：減少細胞分裂素用量，免用赤霉素，延長光照時間，增強光照，及時轉接，降低接種密度。可能原因：細胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當，溫度過高，光照短，光強不足，久不轉移，生長空間窄。7.幼苗淡綠，部分失綠可能原因：無機鹽含量不足，pH值不適宜，鐵、錳、鎂等缺少或比例失調，光照、溫度不適。改進措施：針對營養(yǎng)元素虧缺情況調整培養(yǎng)基，調好pH值，調控溫度、光照。

改進措施：及時轉接、降低接種密度，調整激素配比和營養(yǎng)元素濃度，改善瓶內氣體狀況，控制溫度。8.幼苗生長無力、發(fā)黃落葉、有黃葉、死苗夾于叢生苗中可能原因：瓶內氣體狀況惡化，pH值變化過大，久不轉接導致糖已耗盡，營養(yǎng)元素虧缺失調，溫度不適，激素配比不當。外植體的離體培養(yǎng)技術

試管苗的生根培養(yǎng)

這一階段的目的是使第二階段通過腋芽生長和不定芽形成途徑得到的嫩枝生根產生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困難些，其中從成年樹得到的材料就更困難。由于生長的嫩枝本身含有豐富的生長素，所以一部分植物可在無激素的培養(yǎng)基上生根。

（一）生根培養(yǎng)基的要求：MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導生根，但是其含鹽濃度要適當加以稀釋；除White外，都富含N，P，K鹽，它們都抑制根的發(fā)生。因此，應將它們降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平；生根培養(yǎng)基適當加大生長素的濃度，不用或少用細胞分裂素，生長素濃度在0.1-10mg/l，使用較多的是NAA，其次為IAA和IBA，生長素濃度過高時容易引起愈傷組織化和抑制根的生長；培養(yǎng)基中蔗糖的濃度降低到1.0-1.5%，以增強植株的自養(yǎng)能力；培養(yǎng)基不宜過硬以免影響生根；可在培養(yǎng)基中加入1%左右的活性碳，為提高小植株的光合能力；可將光強度增加到3000-10000lux，光周期可用24小時光照或16小時。（二）生根方法

①將新梢基部浸入IBA溶液中處理4-8h；②在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d；③直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。

上述三種方法均能誘導新梢生根，但前二種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。其原因是當根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。另外，也可采用下列方法生根：1、延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間；2、有意降低一些增殖倍率，減少細胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；3、切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。4、少數植物生根比較困難時，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。5、嫁接到根系發(fā)達、抗逆性強的合適砧木上，如三倍體西瓜苗接到瓠子上，在25-30℃、飽和濕度條件下，三天傷口長出愈傷，一周可成活。組培過程中異常問題診斷與處理任務玻璃化問題及解決辦法任務分析（相關知識點）反饋與評價拓展訓練任務任務實施任務提出（玻璃化的診斷與防治）一、玻璃化現(xiàn)象當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調癥。癥狀：葉和嫩梢呈水晶透明或半透明水漬狀；整株矮化腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表缺少角質層蠟質，沒有功能性氣孔，不具柵欄組織，僅有海綿組織。三、防治措施（1）增加培養(yǎng)基中的溶質水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；（2）減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；（3）增加光照；（4）增加容器通風；（5）降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；（6）降低培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。植物組織培養(yǎng)中常見的問題及解決辦法反饋與評價根據要求完成任務,初步分析出培養(yǎng)過程中有哪些異常情況以小組為單位，提交工作總結報告（異常情況、原因及措施）ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.12ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.老師對各組的任務完成情況進行點評，最后對此任務完成情況依據工作考核標準進行評分3外植體的離體培養(yǎng)技術

七、愈傷組織增殖與分化愈傷組織定義脫分化，具有分化潛能，薄壁細胞團愈傷組織的特點：生長旺盛的愈傷組織一般呈乳黃色或白色，有光澤；也有淺綠色或綠色；而老化的愈傷組織多轉變?yōu)辄S色甚至褐色。愈傷組織類型根據愈傷質地劃分為：愈傷組織顏色有白、綠、黃和紅色不同顏色的愈傷愈傷組織培養(yǎng)物在某些條件下，可以再分化產生不定芽或根的分生組織甚至是胚狀體，繼之，由這些有結構的組織而發(fā)育成苗或完整小植株。一、愈傷組織通過再分化形成再生植株的方式：主要有三種(1)先產生芽，后在莖的基部長根；2)先長根，再長芽；(3)愈傷組織的不同部位分別形成根和芽。1、器官的形成一般愈傷組織開始分化時，由大小不等的細胞開始逐漸形成大小均勻的細胞，保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。在分化時，愈傷組織的表層和內部都可形成分生中心。芽多發(fā)生在愈傷組織的表層，屬外起源。根發(fā)生在組織的深處，與整體植株發(fā)生類似，是內起源。愈傷組織的外部形態(tài)也隨分化而改變，一般由疏松轉向緊密。2、體細胞胚的發(fā)生愈傷組織體細胞胚植株3、激素對愈傷組織分化的影響植物生長調節(jié)物質在分化過程中的作用是極為明顯的，合適的植物生長物質配比在器官分化中起著重要的作用。如仙人掌科的金牛掌莖段培養(yǎng)中，當6-BA加倍時，莖段的愈傷組織可以再分化出仔球，而6-BA濃度過高(150倍)或過低(10倍)則無仔球形成。器官分化的植物激素控制理論大多數植物組織或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理論。生長素與細胞分裂素的比例小時則產生苗，比例大時則生根，而兩種激素的比例適中時，則產生無結構的愈傷組織。THANKS感謝各位,請指導!@YourName組培過程中的異常情況診斷與處理植物組織培養(yǎng)中常見的問題及解決辦法任務分析（相關知識點）反饋與評價拓展訓練任務任務實施任務提出（組培異?，F(xiàn)象的診斷與防治）細菌菌落呈黏液狀，顏色多為白色，1～2d出現(xiàn)真菌菌落多為黑色、綠色、白色的絨毛狀、棉絮狀，3～10d出現(xiàn)任務污染問題及解決辦法任務分析（相關知識點）污染一組織培養(yǎng)過程中的污染源戶外風大菌類進屋機會多屋內太潮菌類繁衍多物品帶菌多屋內不干凈屋內清理帶菌組培苗接種不正確任務污染問題及解決辦法通風經常開窗，保持室內空氣流通去濕保持室內空氣干燥光照紫外線能殺滅或抑制真菌生長防霉污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷預防措施任務污染問題及解決辦法若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中人為引起材料帶內生菌影響植物材料正常生長切口引起真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經高壓滅菌后扔掉。但若是細菌污染，因此只要及時發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感菌的部分剪下轉接，材料仍可以用。若是外植體，菌類從材料培養(yǎng)基以上部分長起，且發(fā)生在5天以后若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢污染材料用抗生素等殺菌藥劑的處理污染原因判斷及污染苗搶救任務污染問題及解決辦法植物組織培養(yǎng)中常見的問題及解決辦法將培養(yǎng)過程中的異常苗挑選出來，并拿筆記本做好記錄工作前準備分成四組，每組將挑選出的異常苗進行診斷，經小組討論擬出初步防治措施工作實施任務實施植物組織培養(yǎng)中常見的問題及解決辦法反饋與評價根據要求完成任務,初步分析出培養(yǎng)過程中有哪些異常情況以小組為單位，提交工作總結報告（異常情況、原因及措施）ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.12ThemeGalleryisaDesignDigitalContent&ContentsmalldevelopedbyGuildDesignInc.老師對各組的任務完成情況進行點評，最后對此任務完成情況依據工作考核標準進行評分3復習思考題

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污染問題是植物組織培養(yǎng)中首先要解決的問題，對組培研究的成敗有著至關重要的影響。結合你的實踐經驗，分析如何降低組培過程中污染現(xiàn)象的發(fā)生？外植體的離體培養(yǎng)技術

六、愈傷組織誘導培養(yǎng)

（一）培養(yǎng)基培養(yǎng)基一般包括大量元素、微量元素和一種碳水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。這樣簡單的培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)只有很少幾種植物組織能夠培養(yǎng)和維持下去，大多數組織需要添加各種各樣的附加物（完全培養(yǎng)基），如維生素、氨基酸、糖醇，生長素、細胞分裂素、赤霉素、螯合劑如EDTA、各種營養(yǎng)性的提取物如椰子汁等。注意：選用完全已知的合成化合物，不大主張用復雜的天然產物，如酵母提取物、番茄汁、椰子汁等。必須強調：適合于誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基不一定適合于維持這些愈傷組織；適合于液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基也不一定適合于固體培養(yǎng)。培養(yǎng)基中的N，大多數都用硝態(tài)氮，只有MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基中才用硝態(tài)和銨態(tài)的混合物。K的水平在近代的培養(yǎng)基中有逐漸提高的趨勢。有趣的是，各種離子濃度大為不同的培養(yǎng)基往往能使相同的組織快速生長。例如Hildebrandt培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基顯著不同，但二者都能培養(yǎng)煙草的愈傷組織。注意：激素的種類和用量的添加一般誘導愈傷常添加2.4-D（二）愈傷的培養(yǎng)方式：培養(yǎng)分為固體和液體培養(yǎng)兩大類。液體培養(yǎng)又分靜止和振蕩培養(yǎng)的二類。繼代培養(yǎng)（傳代）：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于養(yǎng)分的枯竭，水分的散失，組織代謝產物的積累，影響愈傷組織生長，因此必須將組織轉移到新的培養(yǎng)基上。一般在25-28℃下進行固體培養(yǎng)時，每隔4-5周進行一次繼代培養(yǎng)。組織塊較小時，繼代培養(yǎng)時可將整塊組織轉移。組織塊較大時，可先將組織分成幾小塊再接種。繼代培養(yǎng)必須及時進行，長期不傳代常常由于代謝產物的累積，對組織起毒害作用，某些植物愈傷組織的褐化現(xiàn)象即往往由此引起的。褐化的愈傷組織反復地進行繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織恢復活力而迅速生長理論上愈傷組織是可以無限制繼代，但愈傷組織繼代次數增加，形態(tài)發(fā)生能力逐漸喪失。原因：遺傳因素即繼代培養(yǎng)中通常出現(xiàn)染色體紊亂。

遺傳上表現(xiàn)不穩(wěn)定：染色體出現(xiàn)多倍體和非整倍體組培過程中異常問題診斷與處理任務褐變問題及解決辦法任務分析（相關知識點）反饋與評價拓展訓練任務任務實施任務提出（褐變的診斷與防治）一、褐化現(xiàn)象

褐變——是指外植體在培養(yǎng)過程，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放出褐色物質，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。（植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。）在褐變過程中，會產生醌類物質，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。褐變原理：褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性有直接關系。這些酚類化合物在完整的組織和細胞中，與多酚氧化酶是分隔存在的，因而比較穩(wěn)定。但在建立外植體時，切口附近的細胞受到傷害，其分隔效應被打破，酚類化合物外溢。但酚類很不穩(wěn)定，在溢出過程中與多酚氧化酶接觸，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發(fā)生聚合，進一步引起其他酶系統(tǒng)失活，從而導致組織代謝紊亂，生長停滯不，最終衰老死亡。二、褐化的主要原因（1）品種：由于多酚氧化酶活性上的差異，有些品種的外植體在接種后較易褐變，而有些品種的外植體在接種后不易褐變。如一般木本植物，單寧、色素含量高的植物易發(fā)生褐變。核桃單寧含量很高，在進行組織培養(yǎng)時難度很大，不僅接種后的初代培養(yǎng)期發(fā)生褐變，而且在形成愈傷組織以后還會因為褐變而出現(xiàn)死亡。

（2）生理狀態(tài)：一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。（幼齡材料酚類化合物含量少，而成齡材料比較多。

）（3）取材部位如蘋果頂芽作外植體褐變程度輕，比側芽容易成活。石竹和菊花也是頂端莖尖比側芽莖尖更容易成活。油棕用幼嫩器官或組織，如胚等作為外植體進行培養(yǎng)，褐變較輕，而用高度分化的葉片作外植體，接種后則很容易褐變?？傊稚课唤臃N后醌類物質形成少；而分化部位接種后醌類物質形成多。（4）取材時期如24個蘋果品種進行莖尖培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，以冬春季取材褐變死亡率最低，其他季節(jié)取材則都有不同程度地加重。核桃的夏季材料比其他季節(jié)材料更易氧化褐變，因而一般都選在早春或秋季取材。造成這種季節(jié)性差異的原因，主要是由于植物體內酚類化合物含量和多酚氧化酶活性呈季節(jié)性變化，植物在生長季節(jié)都含有較多的酚類化合物之故。多酚氧化酶活性和酚類含量基本是對應的，春季較弱，隨著生長季節(jié)的到來，酶活性逐漸增強，因而有人認為取材時期比取材部位更加重要。

（5）外植體大小及受傷害程度如金冠蘋果莖尖小于0.5mm時褐變嚴重,當莖尖長度在5mm～15mm時褐變較輕,成活率可達85%。另外，取外植體時還要考慮其粗度，細的可切短些，粗的可切得長些。外植體組織受傷害程度直接影響褐變。為了減輕褐變，在切取外植體時，應盡可能減小其傷口面積，傷口剪切盡可能平整些。用椰子的完整胚、葉片作外植體進行培養(yǎng)，很少發(fā)生褐變。除了機械傷害外，接種時各種化學消毒劑對外植體的傷害也會引起褐變。酒精消毒效果很好，但對外植體傷害很重；氯化汞對外植體傷害比較輕。一般來講，外植體消毒時間越長，消毒效果越好，但褐變也越嚴重，因而，消毒時間應掌握在一定范圍內，才能保證較高的外植體成活率。（6）培養(yǎng)條件不當：例如光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。（7）培養(yǎng)基成分：pH值與濃度過高的無機鹽會使褐化程度增加，激素的種類或濃度也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐化現(xiàn)象加深。如6－BA或KT能促進褐變發(fā)生，而生長素類如IAA可減輕褐變發(fā)生。（8）材料轉瓶周期：對于易褐變的材料，接種后轉瓶時間長，傷口周圍積累醌類物質增多，褐變加重，以致全部死亡。而縮短轉瓶周期可減輕褐變。三、防治措施（1）選擇合適的外植體及正確的處理：一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體。春季取外植體，褐變發(fā)生較輕。夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐變要嚴重。冬季的芽不易生長，宜選用早春和秋季的材料作為外植體。預處理能減輕醌類物質的毒害作用。處理方法如下：外植體經流水沖洗后，在2-5℃的低溫下處理12-24小時，再用升汞或70％酒精消毒，然后接種于只含有蔗糖的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天，使組織