第三章 DNA復(fù)制課件

3DNA復(fù)制第三章DNA復(fù)制23.1DNA復(fù)制的基本原則3.2DNA復(fù)制的方式3.3DNA復(fù)制的酶類(lèi)體系3.4DNA復(fù)制過(guò)程3.5端粒和端粒酶第三章DNA復(fù)制23.1DNA復(fù)制的基本原則3.1.1DNA的半保留復(fù)制

概念：在復(fù)制時(shí)，以DNA每條鏈為模板，合成互補(bǔ)鏈，形成的兩個(gè)子代DNA分子與親代DNA分子完全相同，各有一條鏈來(lái)自親本，一條鏈為新合成的。

DNA復(fù)制模式的提出：半保留復(fù)制模式、全保留復(fù)制模式和分散復(fù)制模式第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制21958年，Meselson及Stahl以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，借助放射性同位素（15N）標(biāo)記和CsCl密度梯度離心（Densitygradientcentrifugation）等技術(shù)首次證明了DNA的半保留復(fù)制模型的正確性第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.1.2DNA復(fù)制的半不連續(xù)性

1968年，日本學(xué)者岡崎等用3H-脫氧胸苷標(biāo)記的噬菌體T4感染大腸桿菌，再通過(guò)CsCl密度梯度離心分離出標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)先合成的是1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。說(shuō)明DNA復(fù)制中先合成較短片段，再由連接酶連成大分子DNA

第三章DNA復(fù)制2DNA復(fù)制是以半不連續(xù)方式進(jìn)行，一條鏈的合成按5′→3′方向連續(xù)合成，其合成方向與復(fù)制叉的移動(dòng)方向一致，稱(chēng)為前導(dǎo)鏈（Leadingstrand），另一條鏈的DNA合成是在復(fù)制叉打開(kāi)到一定程度后才開(kāi)始的，先合成許多不連續(xù)的小片段（岡崎片段，Okazakifragment），最后合成一條完整的DNA鏈，稱(chēng)為后滯鏈（Laggingstrand）。第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.1.3DNA復(fù)制的引物DNA的合成需要引物，RNA的合成不需要引物。實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自M13噬菌體DNA在大腸桿菌細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程被利福平（Rifampicin）抑制的實(shí)驗(yàn)。

第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制2目的：保持DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性。原因：DNA聚合酶具有校正活性，而RNA聚合酶沒(méi)有校正功能。在低保真引物完成功能后將其刪除，而代之以DNA聚合酶Ⅰ指導(dǎo)合成的高保真DNA鏈。結(jié)果：使DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性提高了105倍。

第三章DNA復(fù)制23.1.4DNA的雙向復(fù)制大多數(shù)真核和原核生物的DNA都進(jìn)行雙向復(fù)制，即復(fù)制時(shí)兩個(gè)復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向推進(jìn)。當(dāng)然也存在單向復(fù)制，即僅有一個(gè)復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)，而另一個(gè)復(fù)制叉一直停留在復(fù)制的起點(diǎn)。Gyurasits和Wake通過(guò)對(duì)枯草桿菌DNA復(fù)制的放射自顯影實(shí)驗(yàn)揭示了DNA的雙向復(fù)制機(jī)制

第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.2DNA復(fù)制的方式DNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱(chēng)為復(fù)制子（Replicon）。原核基因組中只含有一個(gè)環(huán)狀的復(fù)制子，在唯一起始點(diǎn)啟動(dòng)會(huì)引發(fā)整個(gè)基因組的復(fù)制。大腸桿菌基因組從唯一的起始點(diǎn)OriC開(kāi)始進(jìn)行雙向復(fù)制，形成的兩個(gè)復(fù)制叉基本以相同速度推進(jìn)，其復(fù)制終點(diǎn)在OriC正對(duì)面近乎180o處。真核細(xì)胞中的每條染色體的復(fù)制均是通過(guò)多個(gè)復(fù)制子完成的，通常也是進(jìn)行雙向復(fù)制，相鄰復(fù)制叉相遇后發(fā)生融合，因此不存在明顯的終止位點(diǎn)。第三章DNA復(fù)制23.2.1θ型復(fù)制原核生物DNA從起始點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制，隨著復(fù)制叉向前推進(jìn)，復(fù)制區(qū)域就像在非復(fù)制區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生氣泡并不斷擴(kuò)大，形成θ結(jié)構(gòu)。

Cairns揭示了大腸桿菌DNA的θ型復(fù)制過(guò)程。第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.2.2滾環(huán)復(fù)制有些環(huán)狀DNA以滾環(huán)模式復(fù)制，即雙鏈中的一條鏈產(chǎn)生一個(gè)缺口，DNA聚合酶從缺口上的3′端開(kāi)始，以另一條完整鏈為模板進(jìn)行鏈的延伸，這樣新合成的鏈將替代原來(lái)的親本鏈，好象模板環(huán)在不斷滾動(dòng)。（圖3-7A

）

第三章DNA復(fù)制2圖3-7B：噬菌體ΦΧ174的單鏈DNA首先形成雙鏈的復(fù)制型（Replicativeform），在DNA正鏈的復(fù)制起始點(diǎn)上進(jìn)行單鏈切斷，5′端與A蛋白相連，DNA聚合酶Ⅲ以未切斷的負(fù)鏈為模板，從正鏈的3′端開(kāi)始不斷延伸進(jìn)行復(fù)制，5′端卻不斷地脫離環(huán)狀模板被剝離出來(lái)，成為越來(lái)越長(zhǎng)的游離單鏈。當(dāng)復(fù)制回到起始點(diǎn)時(shí)，具有內(nèi)切酶活性的A蛋白切割起始點(diǎn)并結(jié)合于新的5′端，被替代的正鏈以環(huán)狀形式釋放。

第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.2.3D環(huán)復(fù)制線粒體和葉綠體的雙鏈環(huán)狀DNA從特殊位點(diǎn)開(kāi)始解鏈，但兩條親代鏈中只有一條作為模板（H鏈）合成新鏈，開(kāi)始復(fù)制出一小段DNA，取代了原來(lái)的互補(bǔ)鏈（L鏈），這樣一條單鏈和一條雙鏈組成的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為置換環(huán)（Displacementloop）或D環(huán)。隨著復(fù)制的繼續(xù)進(jìn)行，D環(huán)不斷擴(kuò)大，L鏈被不斷置換，直至L鏈上的起始位點(diǎn)暴露，開(kāi)始新的H鏈的合成。因此雙鏈DNA的兩條鏈分別有自己不同的Ori。第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.3DNA復(fù)制的酶類(lèi)體系3.3.1原核生物DNA復(fù)制的酶及蛋白質(zhì)3.3.1.1DNA聚合酶（DNApolymerases）

大腸桿菌中至少具有5種DNA聚合酶，其中DNA聚合酶Ⅲ是復(fù)制過(guò)程中最重要的酶，DNA聚合酶Ⅰ在復(fù)制、重組以及其他修復(fù)過(guò)程中起清除作用。而DNA聚合酶Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ則均與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)。第三章DNA復(fù)制2表3-1大腸桿菌DNA聚合酶的比較第三章DNA復(fù)制2DNA聚合酶Ⅰ主要作用是在DNA復(fù)制的過(guò)程中負(fù)責(zé)清除RNA引物，該功能依賴于其5′→3′外切酶活性。DNA聚合酶Ⅰ的“缺口平移”過(guò)程可用于制備放射性標(biāo)記核酸探針。DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段稱(chēng)為Klenow片段，失去了原來(lái)的5′→3′外切酶活性。第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制2DNA聚合酶Ⅲ至少包含10個(gè)亞基。α、ε、θ三個(gè)亞基構(gòu)成的催化核心，α亞基具有5′→3′聚合酶活性，ε亞基具有3′→5′外切酶活性，θ亞基負(fù)責(zé)激活外切酶活性。兩個(gè)β亞基形成“夾鉗”（Clamp），套在DNA模板上，在復(fù)制時(shí)沿著模板滑動(dòng)，防止聚合酶從DNA上脫離。二聚化亞基τ使兩個(gè)催化核心連接在一起。由γ2δδ′χψ組成的γ復(fù)合體作為夾鉗裝載機(jī)（Clamploader），負(fù)責(zé)將β亞基結(jié)合到DNA上。因此，DNA聚合酶Ⅲ是一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的二聚體，每個(gè)單體都具有一個(gè)催化核心、一個(gè)二聚化亞基、一個(gè)具有前進(jìn)能力的亞基，能同時(shí)催化兩條DNA鏈的合成第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.3.1.2解旋酶（Helicase）

解旋酶能利用水解ATP產(chǎn)生的能量使DNA解鏈。在大腸桿菌中，有12種不同的解旋酶。解旋酶通常是多聚體，典型的是六聚體結(jié)構(gòu)。第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.3.1.3單鏈結(jié)合蛋白

（Single-strandbindingprotein,SSB）單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合并保護(hù)DNA單鏈，阻止其恢復(fù)成雙鏈體狀態(tài)。SSB一般以單體形式結(jié)合，但結(jié)合具有協(xié)同性。大腸桿菌的SSB是一個(gè)四聚體。第三章DNA復(fù)制23.3.1.4DNA連接酶（DNAligase）大腸桿菌的DNA連接酶分子量為74000，能催化雙鏈DNA中單鏈切口處的5′-磷酸和3′-羥基形成磷酸二酯鍵。連接反應(yīng)需要能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶是以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體則是以ATP作為能量來(lái)源。第三章DNA復(fù)制23.3.1.4拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）

DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，受超螺旋結(jié)構(gòu)所限制。拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠調(diào)控DNA分子超螺旋水平，通過(guò)斷裂和再連接DNA鏈，改變DNA連接數(shù)。類(lèi)型：Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶斷裂一條DNA鏈，連接數(shù)每次改變1，反應(yīng)無(wú)需供給能量；Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶則斷裂兩條DNA鏈，連接數(shù)每次改變2，反應(yīng)需要由ATP提供能量。第三章DNA復(fù)制23.3.2真核生物DNA復(fù)制的酶及蛋白質(zhì)真核細(xì)胞擁有多種DNA聚合酶，在復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中起主要作用的有DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε。復(fù)制作用的酶一般是多亞基的，而負(fù)責(zé)修復(fù)的酶則通常只有一個(gè)亞基。其中DNA聚合酶γ復(fù)制線粒體DNA，DNA聚合酶β則是一種高保真的堿基切除修復(fù)酶

。第三章DNA復(fù)制2

細(xì)胞核DNA的復(fù)制主要涉及DNA聚合酶α、δ和ε。

DNA聚合酶α具有引物酶的活性和聚合酶活性，但不具備校正活性，因此現(xiàn)在認(rèn)為DNA聚合酶α起始前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，之后由DNA聚合酶δ繼續(xù)鏈的延伸工作。DNA聚合酶δ不僅是具有校正活性的高保真聚合酶，而且具有高度的前進(jìn)能力。

DNA聚合酶ε有時(shí)能取代DNA聚合酶δ延伸后滯鏈，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶ε具有別的活性，比如它也能去除岡崎片段上的引物。第三章DNA復(fù)制2表3-2真核生物主要DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)及功能

第三章DNA復(fù)制23.4DNA復(fù)制過(guò)程3.4.1原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程3.4.1.1起始大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)為oriC，由245bp組成，關(guān)鍵序列：3個(gè)13bp重復(fù)序列（堿基組成：GATCTNTTNTTTT）和4個(gè)9bp重復(fù)序列（堿基組成：TTATNCANA）。

第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制24個(gè)9bp重復(fù)序列為DnaA蛋白提供起始結(jié)合位點(diǎn)，大約2~4個(gè)DnaA蛋白各帶1個(gè)ATP結(jié)合在此位點(diǎn)上，并聚集在一起形成核心，DNA纏繞其上。HU蛋白與DNA結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲，使DnaA蛋白作用于鄰近3個(gè)成串排列的、富含AT的13bp序列。在ATP存在的條件下，3個(gè)13bp序列被變性，成為首先解鏈的位點(diǎn)。緊接著，2個(gè)DnaB-DnaC復(fù)合體進(jìn)一步結(jié)合到解鏈區(qū)上并取代DnaA對(duì)13bp序列的結(jié)合，復(fù)合體分別結(jié)合于解鏈區(qū)的兩端，各自包含1個(gè)DnaB六聚體和6個(gè)DnaC單體。DnaB利用其解旋酶活性繼續(xù)擴(kuò)大解鏈區(qū)，每個(gè)DnaB進(jìn)一步激活一個(gè)DnaG引發(fā)酶，在兩個(gè)復(fù)制叉上分別開(kāi)始進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈上RNA引物的合成，并開(kāi)始DNA的復(fù)制第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制2在細(xì)菌的oriC中，共有11個(gè)GATC序列，Dam甲基化酶能使其中的腺嘌呤N6被甲基化。當(dāng)DNA完成復(fù)制后，oriC是半甲基化狀態(tài)。半甲基化的起點(diǎn)不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到新鏈的oriC被完全甲基化。起點(diǎn)處的GATC的半甲基化持續(xù)時(shí)間（13min）大大超過(guò)基因組其余部位的GATC的半甲基化持續(xù)時(shí)間（1.5min）。只有與oriC靠近的dnaA基因啟動(dòng)子的再甲基化需要相同的延遲期。當(dāng)dnaA啟動(dòng)子處于半甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄被阻遏，DnaA蛋白濃度降低。即當(dāng)關(guān)鍵性起始蛋白DnaA的合成受到阻遏時(shí)，起點(diǎn)也是無(wú)活性。第三章DNA復(fù)制23.4.1.2延伸延伸階段同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，前者持續(xù)合成，后者分段合成前導(dǎo)鏈開(kāi)始合成后就一直繼續(xù)下去，保持與復(fù)制叉處DNA的解旋同步。后滯鏈的合成則是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅲ延長(zhǎng)。由于DNA的兩條互補(bǔ)鏈方向相反，又由同一個(gè)聚合酶的不對(duì)稱(chēng)二聚體所催化，即二者的合成應(yīng)該是協(xié)調(diào)一致的。因此，后滯鏈必須繞成一個(gè)突環(huán)（Loop）第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制2DnaB具有激活引物酶DnaG的功能，二者組合形成引發(fā)體（Primosome）。引發(fā)體由ATP提供能量沿復(fù)制叉方向運(yùn)動(dòng)，DNA聚合酶Ⅲ的一個(gè)催化核心連續(xù)合成前導(dǎo)鏈，同時(shí)另一個(gè)催化核心在后滯鏈突環(huán)上從一個(gè)岡崎片段滑動(dòng)到另一個(gè)岡崎片段，無(wú)需從聚合酶復(fù)合體上解離下來(lái)。其基本過(guò)程如下：在DnaB解旋時(shí)，與之結(jié)合的DnaG合成一小段岡崎片段的引物，合成的方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反。一個(gè)新的β夾鉗在此處被裝配，使DNA聚合酶Ⅲ的一個(gè)催化核心被定位在該引物上。接著，DNA聚合酶Ⅲ在引物3′-OH端延伸片段，直到遇到上一個(gè)岡崎片段的引物為止，可能正是此停頓成為合成下一個(gè)岡崎片段RNA引物的信號(hào)，開(kāi)始又一個(gè)岡崎片段的起始合成。隨即β夾鉗解離，釋放催化核心和DNA鏈。催化核心再與下一個(gè)起始位置上的β夾鉗連接，開(kāi)始下一個(gè)岡崎片段的合成第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.4.1.3終止細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉一般以近似相同的速度一起向前推移，最后在oriC的對(duì)面相遇，此為復(fù)制的終止區(qū)域（Terminusregion）。大腸桿菌有5個(gè)終止位點(diǎn)，分別以terA~terE表示，每個(gè)ter的終止作用都是不對(duì)稱(chēng)的，即不讓對(duì)側(cè)的復(fù)制叉超過(guò)中點(diǎn)后繼續(xù)復(fù)制。第三章DNA復(fù)制2ter位點(diǎn)上的23bp保守序列是Tus（Terminusutilizationsubstance，終止利用物質(zhì)）蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。Tus-ter復(fù)合體能阻礙DnaB的解旋酶活性，使復(fù)制叉的移動(dòng)停止，有效避免復(fù)制過(guò)量情況的發(fā)生。兩個(gè)復(fù)制叉匯合之后，復(fù)制停止。此時(shí)兩環(huán)狀染色體相互纏繞，成為連鎖體（Catenane）。連鎖體的分離需要拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ參與作用，從而使兩個(gè)連鎖體的閉環(huán)雙鏈DNA彼此解開(kāi)，在細(xì)胞分裂時(shí)分別進(jìn)入子細(xì)胞第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制23.4.2真核生物DNA復(fù)制的要點(diǎn)3.4.2.1起始真核染色體具有多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都擁有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)釀酒酵母的自主復(fù)制序列（Autonomouslyreplicationsequence，ARS）可能相當(dāng)于復(fù)制的真正起點(diǎn)。

ARS以不同的概率被使用

不同ARS元件均具有11bp的保守序列，富含AT堿基對(duì)，其臨近序列也富含AT，但不具有保守性。

第三章DNA復(fù)制2所有真核生物DNA復(fù)制的起始都需要蛋白質(zhì)ORC（Originrecognitioncomplex），ORC相對(duì)分子質(zhì)量約400×103，由6種蛋白質(zhì)組成。在整個(gè)復(fù)制過(guò)程中，ORC與ARS的11bp共同序列及臨近序列結(jié)合，說(shuō)明復(fù)制的啟動(dòng)可能依賴其條件變化，而不是重新與起始點(diǎn)的結(jié)合。執(zhí)照因子（Licensingfactor）MCM2~MCM7的存在則是復(fù)制起始所必須的。在復(fù)制前與染色體物質(zhì)結(jié)合，但在復(fù)制后可能被快速降解，只有在下次細(xì)胞分裂后才能重新進(jìn)入細(xì)胞核第三章DNA復(fù)制2第三章DNA復(fù)制2真核生物DNA復(fù)制的模型：解旋酶在某一特定復(fù)制原點(diǎn)上使雙螺旋解螺旋，具有啟動(dòng)功能的DNA聚合酶α在2個(gè)復(fù)制叉上合成約10個(gè)核苷酸的RNA引物和隨后約20~30個(gè)核苷酸的DNA，之后，α酶被其他DNA聚合酶取代而進(jìn)行延伸反應(yīng)，這就是所謂的“聚合酶開(kāi)關(guān)”（Polymeraseswitch）。在DNA復(fù)制延伸的過(guò)程中，三種聚合酶分別行使功能，前導(dǎo)鏈由具有高度前進(jìn)性能力的DNA聚合酶δ繼續(xù)復(fù)制，此時(shí)DNA聚合酶α繼續(xù)在后滯鏈上合成引物和一小段DNA岡崎片段，然后這段岡崎片段由第三種DNA聚合酶（δ或ε）完成合成。各種輔助蛋白組分如PCNA