第五章 DNA的復(fù)制課件1

第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制第一節(jié)概述第五章DNA的復(fù)制一、研究DNA復(fù)制的目的任何一種生物都必須具有繁衍后代并將自身的遺傳物質(zhì)傳遞下去的最基本的能力。就長期而言，每一種生物都必須不斷地改變和優(yōu)化自己的遺傳物質(zhì)，以便更好地適應(yīng)外部環(huán)境的改變，并在變化的環(huán)境中生存下來。但就短期而言，生物個體為了生存，必須保證遺傳信息的高度穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。第五章DNA的復(fù)制因?yàn)榻^大多數(shù)的變異都是有害的，可能引起諸如癌癥、血友病、白化病和各種各樣功能缺失性疾病，如果這些變異出現(xiàn)在性細(xì)胞上，就有可能遺傳給后代，而有功能缺失變異的后代在長期自然選擇中將被淘汰，只有極少數(shù)有益的變異被后代傳承下來，成為物種進(jìn)化的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)，這就是達(dá)爾文的優(yōu)勝劣汰，適者生存的進(jìn)化論。第五章DNA的復(fù)制DNA是由兩條核苷酸鏈構(gòu)成的雙螺旋分子，生物體成長發(fā)育和繁衍后代所需要的所有的遺傳信息都儲藏在DNA的序列里。生物物種的傳遞和個體數(shù)目的增殖是通過細(xì)胞分裂來實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞分裂發(fā)生時，親代細(xì)胞都必須將攜帶的DNA準(zhǔn)確地復(fù)制成兩份并分配到兩個子代細(xì)胞中去。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制二、歷史的回顧在研究基因遺傳學(xué)的歷史上，最重大的發(fā)現(xiàn)莫過于Watson和Crick于1953年提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論，以及隨后提出的DNA半保留復(fù)制假說(semiconservativemodel）。根據(jù)他們的假說，雙螺旋DNA在復(fù)制過程中各以其中一條鏈為模板，通過堿基互補(bǔ)配對(A-T，G-C)合成另一條互補(bǔ)DNA序列。新生的互補(bǔ)鏈與母鏈構(gòu)成子代DNA分子，因此DNA雙螺旋被“半保留”地復(fù)制。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制1957年，Kornberg首次發(fā)現(xiàn)了大腸桿菌的DNA聚合酶(DNA聚合酶I)。隨后于1958年，DNA半保留復(fù)制的假說也被MatthewMeselson和FrankStahl的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。60年代早期的研究發(fā)現(xiàn)，正在復(fù)制的染色體上有一個移動的Y字型復(fù)制區(qū)域，這個區(qū)域被稱為復(fù)制叉。1968年對細(xì)菌DNA復(fù)制的研究發(fā)現(xiàn)存在著岡崎片段(Okazakifragment)，進(jìn)而提出了不連續(xù)復(fù)制的學(xué)說。目前已知參與DNA復(fù)制的蛋白就超過20種，肯定還存在一些未知的蛋白因子，因此DNA的復(fù)制還有待進(jìn)一步深入研究。第五章DNA的復(fù)制第二節(jié)DNA復(fù)制的基本規(guī)律和幾種復(fù)制模型第五章DNA的復(fù)制一、半保留復(fù)制①．一端沿氫鍵逐漸斷開；②．以單鏈為模板，堿基互補(bǔ)；③．氫鍵結(jié)合，聚合酶等連接；④．形成新的互補(bǔ)鏈；⑤．形成了兩個新DNA分子。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制二、幾種復(fù)制模型第五章DNA的復(fù)制1、凱恩斯(Cairns)復(fù)制模型第五章DNA的復(fù)制2、滾環(huán)(或滾筒)復(fù)制模型首先一個引發(fā)體組裝在模板鏈（＋鏈）上，開始合成RNA引物，然后在DNApolⅢ作用下，引物延伸生成一個互補(bǔ)鏈（－鏈）。生成的雙鏈DNA分子通過一個噬菌體編碼的內(nèi)切酶在＋鏈上的特定部位制造一個缺口。最后在DNApolⅢ作用下，＋鏈從暴露出的3’羥基延伸，取代原來的＋鏈。第五章DNA的復(fù)制3、非環(huán)狀復(fù)制第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制三、不連續(xù)復(fù)制第五章DNA的復(fù)制DNA的合成至少在一條鏈上是以不連續(xù)的方式進(jìn)行的。復(fù)制叉向前移動，留下兩條單鏈作模板合成新的子鏈。合成方向與復(fù)制叉前進(jìn)方向一致的一條子鏈稱為前導(dǎo)鏈(1eadingstrand)，原則上前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)的；而另一條與前導(dǎo)鏈走向相反DNA子鏈稱為后隨鏈(1aggingstrand)。隨著復(fù)制叉的推移，后隨鏈將沿著與復(fù)制叉移動相反的方向，先合成一些小的DNA片段，然后在DNA連接酶的作用下，再彼此連接成一條完整的DNA長鏈。第五章DNA的復(fù)制

第三節(jié)參與DNA復(fù)制的幾種主要的酶第五章DNA的復(fù)制按照它們的功能可以分成三類：一類是在復(fù)制中能夠影響DNA結(jié)構(gòu)的酶，如拓?fù)洚悩?gòu)酶和解旋酶等，它們主要負(fù)責(zé)將DNA的超螺旋、雙螺旋雙鏈松散，打開成DNA單鏈或者向松弛的雙鏈閉環(huán)DNA分子引入超螺旋。另外一類是參與DNA合成的酶，如DNA引發(fā)酶，DNA聚合酶和DNA連接酶等，主要負(fù)責(zé)DNA的合成和將小片段DNA連接成DNA的長鏈。還有一類是沒有酶活性的輔助蛋白因子，如單鏈結(jié)合蛋白(single-strandDNA-bindingprotein，SSB)、DNA聚合酶輔助蛋白因子等。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制首先是解旋酶(helicase)解開雙鏈DNA，拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)在復(fù)制叉前面引入負(fù)超螺旋，消除由于解鏈產(chǎn)生的正超螺旋，然后DNA聚合酶(DNApolymerase)的多酶聚合體催化脫氧核苷酸加入到與模板互補(bǔ)的核苷酸鏈的3’端，延伸DNA鏈.DNA鏈的延伸需要一段引物(RNA片段),該引物由DNA引物合成酶(DNAprimase),或稱引發(fā)酶合成.第五章DNA的復(fù)制DNA合成方向?yàn)?’-3’，模板閱讀的方向?yàn)?’-5’。前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)的，后隨鏈合成短的不連續(xù)的岡崎片段，每一段都有自己的引物。FENl內(nèi)切酶(flapendonuclease)切開RNA引物與DNA的連接，由RNA酶H降解RNA引物，其缺口由DNA聚合酶δ/ξ補(bǔ)齊，最后DNA連接酶(DNAligase)將岡崎片段連接起來形成連續(xù)的DNA鏈。第五章DNA的復(fù)制增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)是DNA聚合酶的輔助蛋白因子，幫助DNA聚合酶復(fù)合物形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)固定在DNA模板上，在復(fù)制時不至于從模板上脫落下來。RPA(replicationproteinA，RPA)是單鏈DNA結(jié)合蛋白(相當(dāng)于大腸桿菌的SSB)，與單鏈DNA結(jié)合，并使之穩(wěn)定。第五章DNA的復(fù)制一、拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)酶廣泛存在于各種生物，在大腸桿菌中即已發(fā)現(xiàn)4種。其中的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ能與磷酸基團(tuán)共價連接，切斷磷酸二酯鍵，使DNA單鏈產(chǎn)生瞬間缺口，致使兩邊的DNA鏈能夠自由旋轉(zhuǎn)，從而解除DNA鏈上的正超螺旋，使DNA復(fù)制得以繼續(xù)進(jìn)行。由于切開的磷酸二酯鍵的能量儲存在拓?fù)洚悩?gòu)酶與磷酸基團(tuán)的連接鍵中，當(dāng)它從DNA磷酸基團(tuán)釋放時，儲存的能量可讓切開的磷酸二酯鍵重新連接，因此被看作是一種可逆性的核酸酶(圖5-11)。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制另外一種DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，又稱為DNA旋轉(zhuǎn)酶(DNAgyrase)，由A和B兩個亞基組成。B亞基帶有ATP水解酶，能結(jié)合ATP，具有水解ATP的能力。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ往往作用在染色體上兩條雙鏈NA互相交叉的位點(diǎn)，利用ATP水解提供能量有效地完成以下反應(yīng)：①切斷其中一條雙鏈DNA形成一個缺口(為另外一條雙鏈DNA開一道“門”)，兩個亞基與斷開的末端共價連接；②使另外一條雙鏈DNA通過缺口；③重新封閉缺口并離開DNA(圖5—12)。第五章DNA的復(fù)制通過這種方式，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ能有效地將兩條交叉的DNA鏈分開，防止在DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的DNA纏繞(圖5-13)。這種功能在變異的酵母細(xì)胞中可以顯示出來。一種變異的酵母在轉(zhuǎn)換到37℃的條件下培育時，它的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ?qū)⑹セ钚?，這時它的子代染色體在DNA復(fù)制后，將保留著相互纏繞的狀態(tài)而不能分開。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制二、解旋酶(DNAhelicase)DNA在復(fù)制、修復(fù)和連接過程中，兩條互補(bǔ)鏈必須部分分開以形成單鏈DNA，即解旋。該過程是由DNA解旋酶催化完成的，DNA解旋酶也稱為解鏈酶或螺旋酶。當(dāng)解旋酶與DNA單鏈結(jié)合時，可利用水解ATP產(chǎn)生的能量打斷互補(bǔ)堿基配對的氫鍵，以每秒1000個堿基對的速度將雙螺旋打開，促使解鏈酶沿DNA鏈推進(jìn)(圖5—14)。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制NA雙螺旋模板的解旋需要兩個解旋酶協(xié)同作用，一個沿著前導(dǎo)鏈合成方向移動，另一個沿著后隨鏈合成方向移動，因?yàn)閮蓷l鏈的方向相反，兩個酶的運(yùn)動方向也正好相反，因此可以認(rèn)為是兩種不同的酶，事實(shí)上也的確存在這兩種類型的解旋酶。第五章DNA的復(fù)制解旋酶多以六聚體或二聚體的形式存在。利用電鏡圖像重建和X射線衍射技術(shù)顯示，噬菌體T7的解旋酶是一個由6個相同的亞基組成的六聚體環(huán)，環(huán)上有ATP結(jié)合位點(diǎn)。第五章DNA的復(fù)制三、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)雙螺旋DNA被解旋酶打開后，形成單鏈的DNA，單鏈區(qū)將與單鏈結(jié)合蛋白(singlestrandDNA-bindingprotein，SSB)結(jié)合，避免單鏈退火或形成鏈內(nèi)的氫鍵。單鏈結(jié)合蛋白又稱雙螺旋去穩(wěn)定蛋白(helix-destabilizingproteins，HDP)。第五章DNA的復(fù)制性質(zhì)它不具有任何酶的活性，也無需水解ATP提供能量，由于它對已變性的DNA具有強(qiáng)烈的親和能力，因此能彼此協(xié)同地與單鏈DNA(復(fù)制叉的單鏈區(qū))緊密結(jié)合，以避免單鏈退火和在單鏈內(nèi)部由于堿基配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，同時還將加強(qiáng)單鏈DNA與DNA聚合酶的親和力。SSB與DNA的結(jié)合沒有序列專一性，當(dāng)DNA聚合酶前進(jìn)時，將置換出結(jié)合在單鏈上的SSB蛋白。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制SSB蛋白的發(fā)現(xiàn)SSB蛋白首先是從噬菌體T4感染的大腸桿菌中分離制得的，它是噬菌體T4的基因32編碼的產(chǎn)物(gp32)，分子量為35000Da，以單體形式存在。后來，在其他原核以及真核細(xì)胞如大腸桿菌、大腸桿菌噬菌體、小牛胸腺細(xì)胞以及鼠和人細(xì)胞中都相繼發(fā)現(xiàn)了SSB蛋白。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制四、引發(fā)酶(DNAprimase)DNA聚合酶的一個共同特征是只能催化脫氧核糖核苷酸加到DNA鏈的3’-羥基上，因此需要引物提供3’-羥基端，而不能從游離核苷酸起始合成。該引物是由DNA引發(fā)酶(也稱引物酶)催化合成的大約10nt的RNA片段。十分重要的功能是充當(dāng)前導(dǎo)鏈上DNA聚合酶的“剎車板”。第五章DNA的復(fù)制第五章DNA的復(fù)制五、DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA聚合酶是指以脫氧核苷三磷酸dNTP為底物，以DNA為模板催化合成DNA的一類酶。它廣泛存在于各種不同的生物包括細(xì)菌、植物和動物中。所有DNA聚合酶的作用方式都基本相同，可用以下的一個簡單方程表示：

(dNMP)n+dNTP=(dNMP)n+1+ppi第五章DNA的復(fù)制DNA聚合酶所需要的反應(yīng)條件包括四種dNTP、Mg2+以及引物和DNA模板。引物的作用是啟動DNA的合成，它可以是RNA，也可以是DNA以及RNA-DNA的共聚物，但引物的3’端必須具有游離的羥基(3’-OH)，因此DNA聚合酶的作用是促使dNTP加到引物或正在延伸中的DNA鏈的3’-OH端，催化DNA鏈的合成。添加的dNTP的種類由模板DNA決定，催化合成的方向即DNA鏈延伸的方向?yàn)?’-3’。第五章DNA的復(fù)制引物-模板結(jié)構(gòu)有下列五種情況:第一種是完整的雙鏈DNA，無論它是線狀還是環(huán)狀的，都不能作為DNA合成的模板；第二種是帶有一個缺口的雙鏈DNA，它可以作為某些DNA聚合酶的模板；第三種是帶引物的雙鏈DNA；第四種是有引物的單鏈DNA，幾乎所有的DNA聚合酶都能利用它作為底物，這一小段引物可以是DNA，但多數(shù)情況下是RNA。第五章DNA的復(fù)制第五種是單鏈DNA，T4DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I和真核細(xì)胞DNA聚合酶d都能利用它作為引物-模板，當(dāng)使用單鏈DNA作引物-模板時，DNA聚合酶能使單鏈DNA的3’-尾端部分回折與自身的一段DNA的堿基配對結(jié)合，未能配對的3’-尾端部分被聚合酶的3’-’5’外切活力切除，留下游離的3’-OH端，然后在DNA聚合酶的作用下，從該3’端開始合成DNA，這樣的單鏈DNA顯然具有雙重的作用，它既是模板，又是引物。第五章DNA的復(fù)制第四節(jié)DNA復(fù)制的過程DNA復(fù)制的過程大致可分為三個階段：復(fù)制的起始、復(fù)制的延伸、復(fù)制的終止。第五章DNA的復(fù)制一、復(fù)制的起始DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，兩條DNA鏈由無數(shù)堿基對間的氫鍵緊緊連在一起。DNA的復(fù)制是由起始蛋白結(jié)合在雙鏈DNA上，并將兩條鏈解開而開始的。但DNA復(fù)制不是一個隨機(jī)的過程，而是從DNA分子上一個或多個特定的位點(diǎn)開始的，這樣的位點(diǎn)稱為復(fù)制起始位點(diǎn)(originofreplication)，常用ori表示。第五章DNA的復(fù)制一、復(fù)制的起始原核生物的DNA只有一個復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制從這里開始，進(jìn)行到終點(diǎn)(terminus)結(jié)束，完成整個DNA分子的復(fù)制，因此原核生物的染色體只有一個復(fù)制單位(也稱為復(fù)制子，replicon)。真核生物的DNA復(fù)制是從多個位點(diǎn)開始的，所以真核生物的DNA復(fù)制有多個復(fù)制子。第五章DNA的復(fù)制二、復(fù)制的延伸一般而言，DNA復(fù)制首先是起始蛋白結(jié)合在DNA起始位點(diǎn)上，形成前引發(fā)復(fù)合體，并將起始位點(diǎn)某些特定區(qū)域的雙螺旋結(jié)構(gòu)打開，為DNA延伸所需要的多種酶的結(jié)合提供空間。首先加入到引發(fā)復(fù)合體中的是解旋酶，它負(fù)責(zé)解開雙鏈DNA，由拓?fù)洚悩?gòu)酶去除由于解鏈產(chǎn)生的超螺旋。第五章DNA的復(fù)制然后引發(fā)酶和DNA聚合酶組成的被稱為復(fù)制體(replisome)的多酶聚合體結(jié)合上去，合成RNA引物，催化脫氧核苷酸加入到與模板互補(bǔ)的核苷酸鏈的3’端合成DNA鏈。DNA合成方向是5’—3’，模板閱讀為3’—5’。前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)的，后隨鏈合成的是不連續(xù)的岡崎片段。在DNA合成完畢之后，由RNA酶降解清除岡崎片段的RNA引物，再由DNA聚合酶將缺口補(bǔ)齊，最后DNA連接酶將各個岡崎片段連接起來成為連續(xù)的DNA鏈.第五章DNA的復(fù)制三、復(fù)制的終止

DNA復(fù)制的時候，復(fù)制叉前進(jìn)時如果不遇到特殊的終止信號，將一直復(fù)制下去，如果到達(dá)DNA的末端，或者遇到下一個復(fù)制叉，DNA復(fù)制就會終止。

第五章DNA的復(fù)制第五節(jié)確保DNA復(fù)制準(zhǔn)確性的機(jī)制第五章DNA的復(fù)制DNA復(fù)制具有非常高的精確度，平均每復(fù)制109個核苷酸，才有一個核苷酸的差錯。這種以堿基的精確互補(bǔ)配對為基礎(chǔ)的復(fù)制，其高精確度雖已超乎人們的想像，但堿基配對有時仍會產(chǎn)生差錯。

第五章DNA的復(fù)制例如，稍微改變DNA螺旋的構(gòu)象，也能讓G和T之間形成兩個氫鍵。此外，四個DNA堿基出現(xiàn)瞬間互變異構(gòu)體(tautomers)的概率是萬分之一到十萬分之一，在DNA雙螺旋構(gòu)象不發(fā)生改變的情況下，這些堿基互變異構(gòu)體之間也能形成錯配，如C配A。如果DNA聚合酶對這些引入的脫氧三磷酸核苷酸與DNA模板之間的錯配不予校正，則將導(dǎo)致頻繁的變異。

第五章DNA的復(fù)制DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性不僅僅依賴于堿基的配對，還得依靠許多“校對”的機(jī)制不斷地糾正可能發(fā)生的差錯。校對的第一步發(fā)生在新的核苷酸參與合成之前，由DNA聚合酶來完成。一方面是由于正確配對的核苷酸與DNA聚合酶的親和力比錯配的核苷酸大。另一方面是因?yàn)楹塑账崤cDNA聚合酶結(jié)合之后，聚合酶的構(gòu)象將發(fā)生改變，不正確的核苷酸容易與DNA聚合酶發(fā)生分離，從而達(dá)到校正的目的。第五章DNA的復(fù)制第二步校對發(fā)生在新的核苷酸添加上去之后，由DNA聚合酶3’—5’的外切活性來完成。因?yàn)橥ㄟ^第一步還沒有得到校正的錯配的核苷酸，不能提供合適的3’-OH，供DNA聚合酶作用，使鏈延伸。這時DNA聚合酶將用其相對獨(dú)立的催化位點(diǎn)(或者分開的亞基)，即3’—5’外切酶位點(diǎn)將錯配的核苷酸切除。第五章DNA的復(fù)制用外切酶位點(diǎn)變異的聚合酶，使錯配的核苷酸停留在聚合酶外切位點(diǎn)，即保持其不被切除的狀態(tài)(圖5-34B)，或者在正常的聚合過程中加入Mg2+的螯合劑，抑制DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)終止，讓DNA新鏈停留在聚合位點(diǎn)(圖5-34A)，將聚合酶的修正狀態(tài)和聚合狀態(tài)分別固定下來，第五章DNA的復(fù)制然后通過X-衍射成像技術(shù)即可觀察到DNA聚合酶的這兩種構(gòu)象。進(jìn)一步的研究表明，DNA聚合酶是采取“自