高中生物3.2基因工程的基本操作程序知識梳理新人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬┠康幕虻暮Y選與獲取1.目的基因概念在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于__________改變受體細(xì)胞性狀__________或__________獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物________等的基因就是目的基因（根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__________編碼蛋白質(zhì)的基因___________）。2.篩選目的基因的方法（1）從相關(guān)的__________已知結(jié)構(gòu)__________和__________功能清晰__________的基因中進(jìn)行篩選。（2）獲取方法①__________人工合成__________②__________基因文庫中獲取目的基因__________③__________利用PCR獲取和擴(kuò)增__________3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR的概念：PCR是__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)______DNA半保留復(fù)制______的原理，在______體外______提供參與DNA復(fù)制的__________各種組分__________與______反應(yīng)條件______，對___________目的基因的核苷酸序列______進(jìn)行__________大量復(fù)制__________的技術(shù)。①全稱：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)___________②原理：___________DNA半保留復(fù)制___________③操作環(huán)境：__________體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）___________④目的：__________對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制___________⑤優(yōu)點(diǎn)：___________可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因___________（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的_____模板_____4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的_____原料_____解旋酶打開DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA_____子鏈_____引物使DNA聚合酶能夠從_____引物的3’_____端開始連接脫氧核苷酸注：引物是一小段能與______DNA母鏈__________的一段堿基序列__________互補(bǔ)配對_的______短單鏈核酸__________。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的_____模板_____4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的_____原料_____引物使DNA聚合酶能夠從_____引物的3’_____端開始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的_____DNA聚合酶_____催化合成DNA子鏈緩沖液（含_____Mg2+_____）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的_____DNA聚合酶_____其他不同的溫度_____變性、復(fù)性和延伸_____需要不同溫度注：復(fù)制的原料實(shí)為_____dNTP_____（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時(shí)水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加_____ATP_____。（4）過程目的基因DNA__________受熱變性__________后______解為單鏈______，______引物_____與單鏈相應(yīng)______互補(bǔ)序列______結(jié)合；然后以__________單鏈DNA__________為模板在______DNA聚合酶______作用下進(jìn)行___延伸____，即將4種______脫氧核苷酸______加到__________引物的3’__________，如此__________重復(fù)循環(huán)多次__________，每次循環(huán)一般可以分為_變性、復(fù)性和延伸_三步。注：__變性___溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到55℃左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈DNA結(jié)合___延伸__溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由_____5′端向3′_____端延伸拓展：DNA復(fù)制的相關(guān)計(jì)算1.子代DNA分子總數(shù)：_____2n_____個(gè)；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：______2n-1______個(gè)；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=______2n+1_____條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：______2n______條①n代后，DNA分子有______2n______個(gè)②n代后，DNA鏈有______2n+1______條③第__________代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有______2n__________個(gè)⑤n代后，共消耗______2n+1-2______個(gè)引物⑥第n代復(fù)制，消耗了______2n______個(gè)引物⑦n代后，完整的目的基因有______2n-2n______個(gè)4.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫來獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多_____DNA_____片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。①_____基因組文庫_____：包含一種生物所有的基因。②_____部分基因文庫_____：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫。（2）利用化學(xué)方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體必須包括______目的基因______、______標(biāo)記基因_____、_____啟動(dòng)子__、______終止子______等（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有______復(fù)制原點(diǎn)______）。（1）啟動(dòng)子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，緊挨__________轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)__________。③功能：__________RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA___________。④特殊類型：_誘導(dǎo)型啟動(dòng)子___________。⑤誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)：__________當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)__________。（2）終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA__________片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：__________使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來__________。注：啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對比比較項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上____三個(gè)相鄰的堿基_____mRNA上三個(gè)相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因__下游___mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號（不編碼氨基酸）（3）標(biāo)記基因①作用：______便于重組DNA分子的篩選______②常見類型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等（4）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程：一般用同一種限制酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再用DNA連接酶將兩者連接。（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法（1）操作方式①用_______微量注射器________將______________含目的基因的DNA溶液_________直接注入__子房____中。②在_____植物受粉后_____的一定時(shí)間內(nèi)，_____剪去柱頭_____，將____DNA溶液____滴加在_____花粉管通道__________上，使目的基因借助_____花柱切面______進(jìn)入___胚囊___。（2）受體細(xì)胞：_____受精卵__________。2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：__________目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程_________________________________。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌特點(diǎn)：①能在自然條件下侵染__________雙子葉植物_____和_____裸子植物__________，而對大多數(shù)__________單子葉植物_____沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有__________Ti質(zhì)粒_____，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將_____Ti質(zhì)粒_____上的_____T-DNA_____（________可轉(zhuǎn)移的DNA____）____轉(zhuǎn)移_____到被侵染的細(xì)胞，并且將其__________整合到該細(xì)胞的染色體DNA上__________。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：將目的基因插入_________Ti質(zhì)粒的T-DNA__________中，通過農(nóng)桿菌的_轉(zhuǎn)化_____作用，就可以使目的基因____進(jìn)入植物細(xì)胞_____，并___________整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上__________，使目的基因能夠_____維持穩(wěn)定和表達(dá)__________。3.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞—顯微注射法（1）受體細(xì)胞：______受精卵______注：受精卵容易表現(xiàn)出全能性。4.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞—Ca2+處理法（1）受體細(xì)胞：常用________原核生物____作為受體細(xì)胞，其中以______大腸桿菌______最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點(diǎn)：_______________繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對較少、易于培養(yǎng)____________________（3）Ca2+處理法（_____感受態(tài)細(xì)胞法_____）的一般過程：——Ca——Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性Ca2+處理大腸桿菌——這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞——這種細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中——將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中——一般利用溫度變化導(dǎo)入總結(jié)：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法受體細(xì)胞類型方法說明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞染色體的DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞→目的基因表達(dá)簡便、經(jīng)濟(jì)，我國科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）用Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟(jì)、有效（四）目的基因的檢測與鑒定檢測目的檢測方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA_____DNA分子雜交_____技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了_____mRNA_____分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)_____雜交帶_____目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)_____抗原—抗體雜交_____技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個(gè)體水平的檢測如抗蟲、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性1.DNA分子雜交法（DNA探針法）DNA分子雜交的基礎(chǔ)：具有\(zhòng)t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"互補(bǔ)堿基序列的\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"DNA分子，可以通過\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"堿基對之間形成\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"氫鍵等，形成穩(wěn)定的\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"雙鏈區(qū)。在進(jìn)行DNA分子雜交前，先要將兩種生物的DNA分子從細(xì)胞中提取出來，再通過加熱或提高pH的方法，將雙鏈DNA分子解旋成為單鏈，這個(gè)過程稱為變性。然后，將兩種生物的DNA單鏈放在一起雜交，其中一種生物的DNA單鏈用\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"同位素進(jìn)行標(biāo)記。如果兩種生物DNA分子之間存在互補(bǔ)的部分，就能形成雙鏈區(qū)。由于同位素被檢出的靈敏度高，即使兩種生物DNA分子之間形成百萬分之一的雙鏈區(qū)，也能夠被檢出。2.分子雜交分子雜交其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（做探針）間通過\t"/item/%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的\t"/item/%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"雜交分子。3.抗原-抗體雜交Western雜交，即蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交。與\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"SouthernBlot或\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"NorthernBlot雜交方法類似，WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"PAGE（\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，