DB32-T 3115-2016菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20

B05

備案號：51460-2016DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3115-2016

菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

Technologyofvirus-freechrysanthemumstockproduce

2016-09-20發(fā)布2016-11-20實(shí)施

江蘇省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB32/T3115-2016

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》組織編制。

本標(biāo)準(zhǔn)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陳素梅、管志勇、吳丹、張飛、房偉民、蔣甲福、陳發(fā)棣。

II

DB32/T3115-2016

菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)要求和規(guī)程.

本標(biāo)準(zhǔn)適用于常見菊花脫毒種苗的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版

本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

NY/T1591-2008菊花切花種苗等級規(guī)格

DB32/T1530-2009切花菊種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3待脫毒材料

凡有待進(jìn)行脫毒處理的品種均應(yīng)是通過合法途徑引進(jìn)的，簽署有關(guān)品種權(quán)保護(hù)協(xié)議，或者經(jīng)自主選

育的、具有知識產(chǎn)權(quán)的品種。

4脫毒處理

4.1莖尖培養(yǎng)脫毒

4.1.1無菌苗再生體系的建立

經(jīng)檢測含有特定病毒的菊花，取其越冬腳芽，進(jìn)行外植體表面滅菌，具體步驟如下：剪除莖段上的

葉片，用流動(dòng)的蒸餾水沖洗15分鐘后，用濾紙吸干后，于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30s，再轉(zhuǎn)移到0.1%

升汞中洗滌3～5min，取出，用無菌水沖洗5～6次，每次不少于3min，經(jīng)消毒滅菌后的菊花莖段剪成小

段，每段長2-3cm，帶有1～2腋芽，接種于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)組培瓶1～2個(gè)莖段。

4.1.2剝?nèi)∏o尖

在超凈工作臺上操作，于解剖鏡下，將材料置于消毒的濾紙上，用經(jīng)消毒的手術(shù)刀和解剖針逐步剝

去外層葉片，切取0.5～1.0mm直徑大小的帶有1～2片葉原基的莖尖頂端組織。

4.1.3分化培養(yǎng)

將剝?nèi)〉那o尖接種于經(jīng)過高溫濕熱滅菌的分化培養(yǎng)基上，并對接種的莖尖分別編號，置于25℃、

光照強(qiáng)度1500～3000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)，2～3個(gè)月后可分化出新芽。

1

DB32/T3115-2016

4.1.4誘導(dǎo)生根

切取1～2cm分化出的新芽接入生根培養(yǎng)基中，在25℃和光照強(qiáng)度1500～3000lx條件下，培養(yǎng)15～

20d可長出新根。對每株生根苗進(jìn)行編號。

4.2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

4.2.1熱處理方法

將待脫毒的菊花植株放入光照培養(yǎng)箱中，采用變溫升溫的方式進(jìn)行熱處理，在日溫/夜溫分別為

26℃/20℃下培養(yǎng)2d，而后每兩天晝/夜溫度分別升高2℃，直至38℃/30℃，該溫度下培養(yǎng)40d。光照

時(shí)間16h/天，光強(qiáng)為2000lx。剝?nèi)崽幚磉^程長出的新梢頂端0.3～0.5mm的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)。

4.2.2熱處理莖尖培養(yǎng)脫毒

按照4.1莖尖培養(yǎng)脫毒方法進(jìn)行培養(yǎng)，分化出苗、轉(zhuǎn)接生根，對每株生根苗進(jìn)行編號。

5病毒檢測

5.1主要病毒種類

菊花B病毒ChrysanthemumvirusB（CVB)

番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus（TAV)

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus（TSWV)

黃瓜花葉病毒Cucumbermosaiccucumovirus（CMV)

菊花矮化類病毒Chrysanthemumstuntviroid（CSVd)

菊花萎黃斑駁類病毒Chrysanthemumchloroticmottleviroid(CChmvd)。

5.2檢測病毒，見附錄A。

取2～3cm高的植株葉片組織作為檢測樣品，確認(rèn)不帶病毒的材料為脫毒原種苗，用于進(jìn)一步繁殖。

6脫毒原種苗的保存、擴(kuò)繁與煉苗移栽

6.1脫毒原種苗保存

將脫毒原種試管苗轉(zhuǎn)接到MS瓊脂培養(yǎng)基上，置于20～25℃的光照培養(yǎng)室中保存，20～30d繼代轉(zhuǎn)

接一次，繼代次數(shù)控制在10～15代。

6.2脫毒原種苗的擴(kuò)繁

2

DB32/T3115-2016

調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素濃度的比例，使增殖比控制在2.5～3.5倍之間。切取增殖

后的組培不定芽，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

6.3脫毒原種苗的煉苗移栽

瓶苗株高6～7cm，5～6平展片，具5條以上3～4cm長的根時(shí)即可煉苗。煉苗以泥炭：珍珠巖（1:1,

V/V）為基質(zhì)，鋪于苗床或穴盤內(nèi)。將組培生根苗至于光亮處鍛煉2～3天，將其從組培瓶中取出，洗去

根部附著的培養(yǎng)基，然后種植于上述苗床或穴盤內(nèi)，20～30天后，每周澆1/4至1/8濃度的MS營養(yǎng)液

以促進(jìn)生長。溫度控制在15～25℃。

7脫毒原種苗的生物性狀觀察

隨機(jī)抽取每個(gè)無性系脫毒苗5～10株，與其母株一并種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母

株無差異者則可確認(rèn)為原種苗，有差異則淘汰整個(gè)無性系。

8脫毒原種苗的繁殖

8.1組織培養(yǎng)繁殖

按照3.4.2脫毒苗擴(kuò)繁的方法進(jìn)行。

8.2扦插繁殖

參照DB32/T1530-2009中的7、8、9執(zhí)行。

9建立脫毒苗母本圃

保護(hù)地栽培，在防蟲溫室內(nèi)作苗床栽培或地栽。土壤或基質(zhì)須經(jīng)蒸汽或藥劑消毒，定植前施顆粒有

機(jī)肥（1kg/m2），pH值6～7，電導(dǎo)率0.8～1.2。

10脫毒種苗的質(zhì)量檢測

脫毒種苗的質(zhì)量檢測參照NY/T1591-2008中5.1.3進(jìn)行抽樣檢查，并按照NY/T1591-2008中5.2

的內(nèi)容進(jìn)行檢測，確定種苗的質(zhì)量等級。

11包裝與貯運(yùn)

11.1包裝

種苗袋選用材質(zhì)為0.05～0.08mm的透明塑料薄膜，大小為35cm×35cm，袋上打12～16個(gè)直徑5mm

的透氣孔。每袋裝種苗50～100株，袋裝時(shí)須將帶基質(zhì)的根部朝下，莖葉部朝上，整齊排列，然后裝入

專用種苗箱。包裝箱材質(zhì)應(yīng)為雙瓦楞紙箱，種苗箱應(yīng)有良好的承載能力和耐濕性，寬40cm，長60cm，

3

DB32/T3115-2016

高20cm～22cm，兩側(cè)留有透氣孔。裝箱時(shí)種苗袋應(yīng)直立排放，每箱放置500～1000株。裝箱后用膠帶

封好箱口。

11.2包裝標(biāo)識

包裝箱(圖1)上應(yīng)有明顯標(biāo)識，內(nèi)容包括：產(chǎn)品名稱、質(zhì)量等級、包裝容量、生產(chǎn)單位、產(chǎn)地、采

收包裝日期，若需冷藏保存，應(yīng)注明冷藏溫度。標(biāo)識內(nèi)容要求字跡清晰、完整、規(guī)范。

圖1種苗包裝箱

11.3貯運(yùn)

可在2～5℃冷庫中貯存，貯存時(shí)間不超過7d。種苗運(yùn)輸時(shí)間超過3d時(shí)，則應(yīng)采用控溫4～6℃的

冷藏車。

4

DB32/T3115-2016

AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法

A.1設(shè)備和材料

槍頭、離心管和PCR管均需經(jīng)高溫消毒。

A.1.1微量移液器：200~1000μL、20~200μL、10~100μL、0.5~10μL、0.5~2.5μL、0~1.0μL。

A.1.2電子天平：精度為0.01g。

A.1.3高速冷凍離心機(jī)。

A.1.4PCR儀。

A.1.5水平凝膠電泳系統(tǒng)。

A.1.6凝膠成像系統(tǒng)。

A.2藥品和試劑

所用試劑為分析純，水為滅菌的雙蒸水。

A.2.1RNA提取試劑

Trizol，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC水，雙蒸水。

A.2.2反轉(zhuǎn)錄試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，5×M-MLV緩沖液，核糖核酸酶抑制劑，隨機(jī)引物，10mmol/LdNTP。-20℃貯藏。

A.2.3PCR試劑

TaqDNA聚合酶，10×Buffer，PCR引物（上游，下游）。

A.2.45×TBE緩沖液

A.2.5加樣緩沖液

0.25%溴酚藍(lán)溶解于40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

A.3操作步驟

A.3.1菊花總RNA的提取

菊花總RNA的提取按照TaKaRa公司提供的Trizol試劑盒說明書進(jìn)行，具體步驟包括：

(1)取菊花葉片l00mg，用液氮研磨，加入1mL的RNA提取液，混合均勻，于冰上靜置5min。

(2)4℃，12000g高速離心10min，吸取上層溶液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的EP離心管中。

(3)向離心管中加入1/5體積的氯仿溶液，振蕩，混合均勻，于室溫下靜置5min。

(4)4℃，12000g高速離心15min，吸取上層溶液轉(zhuǎn)移到新的1.5mLEP離心管中。

(5)重復(fù)步驟(3)、(4)兩次。

5

DB32/T3115-2016

(6)向1.5mLEP管中加入等體積的異丙醇(預(yù)冷)，搖勻，室溫下靜置10min。

(7)4℃，12000g高速離心l0min，棄上清。

(8)用1mL75%的乙醇洗滌2~3次，12000g高速離心10min，棄上清，于超凈工作臺上通風(fēng)干燥

RNA，并加入30μL的無RNase的DEPC水溶解。

(9)取2μL的RNA加58μL的DEPC水稀釋，用核酸定量儀在260/280nm測量RNA的濃度及純度。

(10)取2μL的RNA溶液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，其余的RNA放置于-80℃

保存?zhèn)溆谩?/p>

A.3.2第一鏈cDNA合成

cDNA合成參照試劑盒(M-MLVRTasecDNASynthesisKit,TaKaRa)，具體步驟如下：

(1)在離心管中配制下列混合液:

TotalRNA(10pg-5μg)1μL

RadomPrimer(25μM)1μL

RNaseFreedH2O4μL

(2)-70℃保溫10min后，迅速在冰上放置2min以上。

(3)離心數(shù)秒，使模板RNA/引物變性溶液聚集于離心管底部。

(4)在上述Microtube管中配置下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

上述模板RNA/引物變性溶液6μL

5×M-MLVBuffer2μL

dNTPsMixture(10mMeach)0.5μL

RNaseInhibitor(40U/nl)0.25μL

RTaseM-MLV(RHaseH-)(200U/μL)0.4μL

RNaseFreedH2O0.85μL

(5)30℃保溫10min。

(6)42℃延伸1h。

(7)70℃保溫15min后冰上冷卻，得到的cDNA直接用于PCR擴(kuò)增，也可置于-20℃保存。

A.3.3PCR擴(kuò)增及電泳

(1)在Microtube管中配制下列混合液:

10×PCRBuffer2.5μL

Mg2+1.5μL

dNTP(2.5mMeach)2.0μL

上游引物(20μM)1.0μL

下游引物(20μM)1.0μL

cDNA1.0μL

rTaq(5U/μL)0.2μL

6

DB32/T3115-2016

ddH2Oaddto25μL

(2)PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，按照不同病毒退火溫度不同，72℃延伸1min，

35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保溫。

(3)電泳：配制1%-1.75%(W/V)的瓊脂糖凝膠；放入電泳槽中，電泳液浸沒膠面1mm。樣品中加

入等體積的上樣緩沖液，混勻；沿著膠孔邊緣勻速加入。接通電源，選擇合適的電壓和時(shí)間電泳。電泳

結(jié)束后，膠塊置于紫外成像系統(tǒng)中，調(diào)整拍攝范圍和焦距，拍攝成像。

A.4結(jié)果判斷

陽性對照有目標(biāo)帶出現(xiàn)，陰性對照無帶時(shí)，檢測的效果為有效。檢測樣品有與陽性對照相同的目標(biāo)

帶出現(xiàn)時(shí)為陽性，無目標(biāo)帶為陰性。

表1菊花病毒的特異性引物

病毒名稱引物序列（5’-3’）退火溫度產(chǎn)物（bp）

菊花B病毒P1：ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC55℃650

（CVB）P2：TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT

番茄不孕病毒P1：CCATCCCTTCAACATCCGACTT52℃499

（TAV）P2：GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT

番茄斑萎病毒P1：CTCTGGTGTCATACTTCTTTGGG58℃264

（TSWV）P2：GGCTTGTAGAGGAAACTGGGAAT

黃瓜花葉病毒P1：GTAGTGAACGATGTAAACCTGGG59℃210

（CMV）P2：GCAGGAACTTTACGAACTGTCAC

菊花萎黃斑駁類病毒P1：CAGTTTCGGCTTGTGCGGGAGT53℃217

（CChMVd）P2：TCCGAGGAGAATATCCAACGAG

菊花矮化類病毒P1：ACTCCTGACCCTGCTGCTT50℃313

（CSVd）P2：AAGGTTCCACGGGCTTACT

_________________________________

7

DB32/T3115-2016

目次

前言................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3待脫毒材料.........................................................................1

4脫毒處理...........................................................................1

5病毒檢測...........................................................................2

6脫毒原種苗的保存、擴(kuò)繁與煉苗移栽...................................................2

7脫毒原種苗的生物性狀觀察...........................................................3

8脫毒原種苗的繁殖...................................................................3

9建立脫毒苗母本圃...................................................................3

10脫毒種苗的質(zhì)量檢測................................................................3

11包裝與貯運(yùn)........................................................................3

附錄A（規(guī)范性附錄）RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法...........5

I

DB32/T3115-2016

菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了菊花脫毒種苗生產(chǎn)技術(shù)要求和規(guī)程.

本標(biāo)準(zhǔn)適用于常見菊花脫毒種苗的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版

本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

NY/T1591-2008菊花切花種苗等級規(guī)格

DB32/T1530-2009切花菊種苗生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3待脫毒材料

凡有待進(jìn)行脫毒處理的品種均應(yīng)是通過合法途徑引進(jìn)的，簽署有關(guān)品種權(quán)保護(hù)協(xié)議，或者經(jīng)自主選

育的、具有知識產(chǎn)權(quán)的品種。

4脫毒處理

4.1莖尖培養(yǎng)脫毒

4.1.1無菌苗再生體系的建立

經(jīng)檢測含有特定病毒的菊花，取其越冬腳芽，進(jìn)行外植體表面滅菌，具體步驟如下：剪除莖段上的

葉片，用流動(dòng)的蒸餾水沖洗15分鐘后，用濾紙吸干后，于超凈工作臺上用75%酒精浸泡30s，再轉(zhuǎn)移到0.1%

升汞中洗滌3～5min，取出，用無菌水沖洗5～6次，每次不少于3min，經(jīng)消毒滅菌后的菊花莖段剪成小

段，每段長2-3cm，帶有1～2腋芽，接種于MS培養(yǎng)基中，每個(gè)組培瓶1～2個(gè)莖段。

4.1.2剝?nèi)∏o尖

在超凈工作臺上操作，于解剖鏡下，將材料置于消毒的濾紙上，用經(jīng)消毒的手術(shù)刀和解剖針逐步剝

去外層葉片，切取0.5～1.0mm直徑大小的帶有1～2片葉原基的莖尖頂端組織。

4.1.3分化培養(yǎng)

將剝?nèi)〉那o尖接種于經(jīng)過高溫濕熱滅菌的分化培養(yǎng)基上，并對接種的莖尖分別編號，置于25℃、

光照強(qiáng)度1500～3000lx、光照時(shí)間16h/天的條件下培養(yǎng)，2～3個(gè)月后可分化出新芽。

1

DB32/T3115-2016

4.1.4誘導(dǎo)生根

切取1～2cm分化出的新芽接入生根培養(yǎng)基中，在25℃和光照強(qiáng)度1500～3000lx條件下，培養(yǎng)15～

20d可長出新根。對每株生根苗進(jìn)行編號。

4.2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

4.2.1熱處理方法

將待脫毒的菊花植株放入光照培養(yǎng)箱中，采用變溫升溫的方式進(jìn)行熱處理，在日溫/夜溫分別為

26℃/20℃下培養(yǎng)2d，而后每兩天晝/夜溫度分別升高2℃，直至38℃/30℃，該溫度下培養(yǎng)40d。光照

時(shí)間16h/天，光強(qiáng)為2000lx。剝?nèi)崽幚磉^程長出的新梢頂端0.3～0.5mm的莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)。

4.2.2熱處理莖尖培養(yǎng)脫毒

按照4.1莖尖培養(yǎng)脫毒方法進(jìn)行培養(yǎng)，分化出苗、轉(zhuǎn)接生根，對每株生根苗進(jìn)行編號。

5病毒檢測

5.1主要病毒種類

菊花B病毒ChrysanthemumvirusB（CVB)

番茄不孕病毒Tomatoaspermyvirus（TAV)

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus（TSWV)

黃瓜花葉病毒Cucumbermosaiccucumovirus（CMV)

菊花矮化類病毒Chrysanthemumstuntviroid（CSVd)

菊花萎黃斑駁類病毒Chrysanthemumchloroticmottleviroid(CChmvd)。

5.2檢測病毒，見附錄A。

取2～3cm高的植株葉片組織作為檢測樣品，確認(rèn)不帶病毒的材料為脫毒原種苗，用于進(jìn)一步繁殖。

6脫毒原種苗的保存、擴(kuò)繁與煉苗移栽

6.1脫毒原種苗保存

將脫毒原種試管苗轉(zhuǎn)接到MS瓊脂培養(yǎng)基上，置于20～25℃的光照培養(yǎng)室中保存，20～30d繼代轉(zhuǎn)

接一次，繼代次數(shù)控制在10～15代。

6.2脫毒原種苗的擴(kuò)繁

2

DB32/T3115-2016

調(diào)節(jié)增殖培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素濃度的比例，使增殖比控制在2.5～3.5倍之間。切取增殖

后的組培不定芽，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

6.3脫毒原種苗的煉苗移栽

瓶苗株高6～7cm，5～6平展片，具5條以上3～4cm長的根時(shí)即可煉苗。煉苗以泥炭：珍珠巖（1:1,

V/V）為基質(zhì)，鋪于苗床或穴盤內(nèi)。將組培生根苗至于光亮處鍛煉2～3天，將其從組培瓶中取出，洗去

根部附著的培養(yǎng)基，然后種植于上述苗床或穴盤內(nèi)，20～30天后，每周澆1/4至1/8濃度的MS營養(yǎng)液

以促進(jìn)生長。溫度控制在15～25℃。

7脫毒原種苗的生物性狀觀察

隨機(jī)抽取每個(gè)無性系脫毒苗5～10株，與其母株一并種植至開花。觀察比較其主要生物性狀，與母

株無差異者則可確認(rèn)為原種苗，有差異則淘汰整個(gè)無性系。

8脫毒原種苗的繁殖

8.1組織培養(yǎng)繁殖

按照3.4.2脫毒苗擴(kuò)繁的方法進(jìn)行。

8.2扦插繁殖

參照DB32/T1530-2009中的7、8、9執(zhí)行。

9建立脫毒苗母本圃

保護(hù)地栽培，在防蟲溫室內(nèi)作苗床栽培或地栽。土壤或基質(zhì)須經(jīng)蒸汽或藥劑消毒，定植前施顆粒有

機(jī)肥（1kg/m2），pH值6～7，電導(dǎo)率0.8～1.2。

10脫毒種苗的質(zhì)量檢測

脫毒種苗的質(zhì)量檢測參照NY/T1591-2008中5.1.3進(jìn)行抽樣檢查，并按照NY/T1591-2008中5.2

的內(nèi)容進(jìn)行檢測，確定種苗的質(zhì)量等級。

11包裝與貯運(yùn)

11.1包裝

種苗袋選用材質(zhì)為0.05～0.08mm的透明塑料薄膜，大小為35cm×35cm，袋上打12～16個(gè)直徑5mm

的透氣孔。每袋裝種苗50～100株，袋裝時(shí)須將帶基質(zhì)的根部朝下，莖葉部朝上，整齊排列，然后裝入

專用種苗箱。包裝箱材質(zhì)應(yīng)為雙瓦楞紙箱，種苗箱應(yīng)有良好的承載能力和耐濕性，寬40cm，長60cm，

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高20cm～22cm，兩側(cè)留有透氣孔。裝箱時(shí)種苗袋應(yīng)直立排放，每箱放置500～1000株。裝箱后用膠帶

封好箱口。

11.2包裝標(biāo)識

包裝箱(圖1)上應(yīng)有明顯標(biāo)識，內(nèi)容包括：產(chǎn)品名稱、質(zhì)量等級、包裝容量、生產(chǎn)單位、產(chǎn)地、采

收包裝日期，若需冷藏保存，應(yīng)注明冷藏溫度。標(biāo)識內(nèi)容要求字跡清晰、完整、規(guī)范。

圖1種苗包裝箱

11.3貯運(yùn)

可在2～5℃冷庫中貯存，貯存時(shí)間不超過7d。種苗運(yùn)輸時(shí)間超過3d時(shí)，則應(yīng)采用控溫4～6℃的

冷藏車。

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

RNA病毒的反轉(zhuǎn)錄——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測法

A.1設(shè)備和材料

槍頭、離心管和PCR管均需經(jīng)高溫消毒。

A.1.1微量移液器：200~1000μL、20~200μL、10~100μL、0.5~10μL、0.5~2.5μL、0~1.0μL。

A.1.2電子天平：精度為0.01g。

A.1.3高速冷凍離心機(jī)。

A.1.4PCR儀。

A.1.5水平凝膠電泳系統(tǒng)。

A.1.6凝膠成像系統(tǒng)。

A.2藥品和試劑

所用試劑為分析純，水為滅菌的雙蒸水。

A.2.1RNA提取試劑

Trizol，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC水，雙蒸水。

A.2.2反轉(zhuǎn)錄試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，5×M-MLV緩沖液，核糖核酸酶抑制劑，隨機(jī)引物，10mmol/LdNTP。-20℃貯藏。

A.2.3PCR試劑

TaqDNA聚合酶，10×Buffer，PCR引物（上游，下游）。

A.2.45×TBE緩沖液

A.2.5加樣緩沖液

0.25%溴酚藍(lán)溶解于40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃保存。

A.3操作步驟

A.3.1菊花總RNA的提取

菊花總RNA的提取按照TaKaRa公司提供的Trizol試劑盒說明書進(jìn)行，具體步驟包括：

(1)取菊花葉片l00mg，用液氮研磨，加入1mL的RNA提取液，混合均勻，于冰上靜置5min。

(2)4℃，12000g高速離心10min，吸取上層溶液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的EP離心管中。

(3)向離心管中加入1/5體積的氯仿溶液，振蕩，混合均勻，于室溫下靜置5min。

(4)4℃，12000g高速離心15min，吸取上層溶液轉(zhuǎn)移到新的1.5mLEP離心管中。

(5)重復(fù)步驟(3)、(4)兩次