第三章 微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)課件

第三章微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

A：研究微生物的途徑：（群體）培養(yǎng)物：在微生物學(xué)中，在人為規(guī)定的條件下培養(yǎng)，繁殖得到的微生物群體。純培養(yǎng)物：只有一種微生物的培養(yǎng)物。（利于研究、應(yīng)用、重復(fù)結(jié)果）B：利用顯微技術(shù)進(jìn)行研究顯微技術(shù)包括顯微標(biāo)本的制作、觀察、測定、分析及記錄等方面的內(nèi)容。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第一節(jié)微生物的分離和純培養(yǎng)

無菌技術(shù)用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)單細(xì)胞（單孢子）分離選擇培養(yǎng)分離第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)一、無菌技術(shù)

無菌技術(shù)：在分離、轉(zhuǎn)接及培養(yǎng)純培養(yǎng)(物)時防止其被其他微生物污染的技術(shù)。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)保持無菌的方法

高壓蒸氣滅菌高溫干熱滅菌棉塞超凈工作臺等

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)接種操作

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)二、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

菌落：單個微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞生長群體。菌苔：當(dāng)固體培養(yǎng)基表面眾多菌落連成一片時，便成為菌苔。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)菌落菌落或菌苔是對微生物進(jìn)行分類和鑒定的重要依據(jù)。細(xì)菌菌落特征剖面圖第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)細(xì)菌菌落特征正面圖菌落第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)培養(yǎng)平板培養(yǎng)平板（平板）：指熔化的固體培養(yǎng)基倒入無菌平皿，冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基的平皿。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)平板分離微生物純培養(yǎng)技術(shù)

稀釋倒平板法

涂布平板法

平板劃線分離法

稀釋搖管法

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、稀釋倒平板法：無菌水、梯度稀釋、50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基、滅過菌的培養(yǎng)皿。注意要稀釋得當(dāng)。分離出單個菌落以后，重復(fù)上述操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Pourplate稀釋倒平板法第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)涂布平板法Spreadplate無菌水、梯度稀釋涂布平板第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)稀釋倒平板法和涂布平板法第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)平板劃線分離法第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)稀釋搖管法用于分離嚴(yán)格厭氧菌。先將一系列盛有無菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養(yǎng)基與空氣隔開。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)三、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

用于細(xì)胞大的細(xì)菌、原生動物和藻類等的純化分離。稀釋法：經(jīng)高度稀釋后，同一個稀釋度的試管中大多數(shù)（95%以上）表現(xiàn)不生長，很可能得到的是純培養(yǎng)。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)四、單細(xì)胞（單孢子）分離

單細(xì)胞分離：采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細(xì)胞或單個個體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。單細(xì)胞分離法的難度與細(xì)胞或個體的大小成反比。個體較大的可在低倍顯微鏡下進(jìn)行，個體較小的則需采用顯微操作儀。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)五、選擇培養(yǎng)分離

當(dāng)某一種微生物所存在的數(shù)量與其他微生物相比非常少時，單采用一般的平板稀釋方法幾乎是不可能分離到該種微生物的，故需采用選擇培養(yǎng)分離法。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離

如要分離高溫菌，可在高溫條件進(jìn)行培養(yǎng)；要分離某種抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上進(jìn)行分離。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2、富集培養(yǎng)主要是指利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數(shù)量大大增加，人們能夠更容易地從自然界中分離到所需的特定微生物。富集條件：物理、化學(xué)和生物等。以從土壤中分離能降解酚類化合物對羥基苯甲酸的微生物的實驗為例。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)六、微生物的保藏技術(shù)

保藏期間微生物不死亡、不污染、不會因發(fā)生而丟失重要的生物學(xué)性狀。許多國家都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏委員會美國典型菌種保藏中心世界菌種保藏聯(lián)合會等

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)菌種保藏菌種保藏：就是根據(jù)菌種特性及保藏目的的不同，給微生物菌株以特定的條件，使其存活而得以延續(xù)。

對于生產(chǎn)中使用的菌種保藏培養(yǎng)基，要求比較豐富的氮源，以防止菌種退化變質(zhì)。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)菌種保藏方法連續(xù)移接改變條件（干燥、低溫、缺氧、缺乏營養(yǎng)等）使菌株的代謝水平降低，乃至完全停止，達(dá)到半休眠或完全休眠的狀態(tài)，而在一定時間內(nèi)得到保藏，有的可保藏幾十年或更長的時間。在需要時再通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復(fù)活力。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、傳代培養(yǎng)保藏是微生物保存的基本方法。瓊脂斜面、半固體瓊脂柱和液體培養(yǎng)等。橡皮塞封口或用石蠟覆蓋，并放置低溫保存。4℃保存。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2、冷凍保藏代謝作用停止。細(xì)胞體積大者要比小者對低溫更敏感，而無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁敏感。其原因是低溫會使細(xì)胞內(nèi)水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞，尤其是細(xì)胞膜的損傷。速凍及快速解凍可減少損傷；還可加一些保護(hù)劑，如0.5%左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)因此在采用冷凍法保藏菌種時，一般應(yīng)加入各種保護(hù)劑以提高培養(yǎng)物的存活率。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)3、干燥保藏法沙土管保存和冷凍真空干燥保藏是最常用的二項微生物干燥保藏技術(shù)。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)沙土管保存一般將菌種接種至斜面，培養(yǎng)至長出大量的孢子后，洗下孢子制備孢子懸浮液，加入無菌沙土試管中，減壓干燥，直至將水分抽干，最后用石蠟、橡膠塞等封閉管口，置冰箱保存。此法主要適用于產(chǎn)孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等，保藏時間相對較長。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)冷凍真空干燥保藏是將加有保護(hù)劑的細(xì)胞樣品預(yù)先冷凍，使其凍結(jié)，然后在真空下通過水的升華作用除去水分。達(dá)到干燥的樣品可在真空或惰性氣體的密閉環(huán)境中置低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧及低溫的狀態(tài)，生命活動處于休眠，可以達(dá)到長期保藏的目的。用水升華的方式除去水分，手段比較溫和，細(xì)胞受損傷的程度相對比較小，存活率及保藏效果均不錯，是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第二節(jié)顯微鏡和顯微技術(shù)

顯微鏡的種類及原理

顯微觀察樣品的制備

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)一、顯微鏡的種類及原理

普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡普通生物顯微鏡由三部分構(gòu)成：照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成。機(jī)械裝置：保證光學(xué)系統(tǒng)的準(zhǔn)確配制，用于固定材料和觀察方便。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)分辨率重要性能參數(shù)。顯微鏡物象是否清楚不僅決定于放大倍數(shù)，還與顯微鏡的分辨率（resolution）有關(guān)。分辨率是指顯微鏡（或人的眼睛距目標(biāo)25cm處）能分辨物體最小間隔的能力。分辨率的大小決定于光的波長和鏡口角以及介質(zhì)的折射率。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)分辨率肉眼分辨率一般只有0.25mm光學(xué)顯微鏡分辨率0.18μm電子顯微鏡可達(dá)0.2nmR=0.5λ/ｎsinα/2式中：n=介質(zhì)折射率；α=鏡口角（標(biāo)本對物鏡鏡口的張角），ｎsinα/2

=鏡口率介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)二、顯微觀察樣品的制備

要根據(jù)顯微鏡和樣品的特點來制備。主要講述光學(xué)顯微鏡的制樣。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、活體觀察壓滴法：將菌懸液滴于載玻片上，加蓋蓋玻片后立即進(jìn)行顯微鏡觀察。懸滴法：在蓋玻片中央加一小滴菌懸液后反轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上后進(jìn)行顯微鏡觀察，為防止液滴蒸發(fā)變干，一般還應(yīng)在蓋玻片四周加封凡士林。菌絲埋片法：將無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，經(jīng)培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，用顯微鏡對菌絲的形態(tài)進(jìn)行觀察。插片法：

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2、染色觀察固定的目的：殺死細(xì)菌并使菌體粘附于坡片上。增加細(xì)菌對染料的親和力。常用的方法有酒精燈火焰加熱和化學(xué)固定二種。

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)細(xì)菌染色法死菌正染色負(fù)染色：簡單染色法鑒別染色法

革蘭氏染色法

抗酸性染色法芽孢染色法莢膜染色法等

活菌:用美藍(lán)或TTC（氯化三苯基四氮唑）等作活菌染色

姬姆薩染色法染色觀察第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第三節(jié)顯微鏡下的微生物

微生物類群包括細(xì)胞型和非細(xì)胞型兩類，這里主要介紹細(xì)胞型微生物。

細(xì)菌和古生菌

真菌

藻類

原生動物

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)一、細(xì)菌和古生菌

細(xì)菌的形態(tài)和排列古生菌原核生物的細(xì)胞大小

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、細(xì)菌的形態(tài)和排列球菌(Coccus)桿菌(Bacillus)螺旋菌(Spirlla)其他形狀的細(xì)菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)球菌(coccus)單球菌雙球菌四聯(lián)球菌八疊球菌葡萄球菌鏈球菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)ArrangementofSphericalBacterialCellsdiplococci

streptococci

tetracocci

sarcinae

staphylococci

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù).................................................單球菌（顯微鏡下示意圖）單球菌(singlecoccus)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)......................................................................雙球菌（顯微鏡下示意圖）雙球菌(doublecoccus)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Micrococcus–aerobic,gram-positive,cellarrangesmainlyinpairs,orirregularclusters.Theyareoftenyellow,orangeorredincolour第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

上：顯微鏡效果下：電鏡照片

四聯(lián)球菌(Micrococcuslactis)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)八疊球菌(Sarcinaureae)八疊球菌（顯微鏡下示意圖）第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

葡萄球菌左：電鏡照片右：顯微鏡下的金黃色葡萄球菌葡萄球菌(Staphylococcusaureus)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Staphylococcus-facultativelyanaerobic,gram-positive,usuallyformirregularclusters,nonmotile,catalasepositivebutoxidasenegative,fermentglucoseanaerobically.staphylococcistaphylococci第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)鏈球菌鏈球菌（顯微鏡下示意圖）第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)鏈球菌（電鏡照片）第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Streptococcus-facultativelyanaerobicormicroaerophilic,catalasenegative,gram-positive,Cellarrangesinpairsorchains,usuallynonmotile,

Afewspeciesareanaerobicratherthanfacultative.第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

電子顯微鏡下的結(jié)核菌（綠色的就是結(jié)核桿菌）桿菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)動物宿主細(xì)胞感染桿菌瀕臨死亡

電鏡照片第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)鏈桿菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)鏈顯微鏡下的鏈桿菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)螺旋菌（Spirlla)

弧菌(vibrio)

螺菌（spirllum）

螺旋體(spirochaeta)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Vibrio,SpirillumandSpirochetevibriospirillumspirochete第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)顯微鏡下的螺旋菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

幽門螺旋菌左：顯微數(shù)碼攝像右：結(jié)構(gòu)示意圖第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)放線菌的分布與生活方式放線菌一般分布在含量較低；有機(jī)物豐富和呈微生物堿性的土壤中。107個／g左右能看到：北方春季深層黑土地的白絲能聞到：泥土特有的“泥腥味”第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)ChainofconidiosporesAgarsurfaceSubstratemyceliumAerialhyphaeVarioustypesofspore-bearingstructuresonthestreptomyces第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)放線菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)（模式圖）氣生菌絲孢子絲分生孢子基內(nèi)菌絲固體基質(zhì)第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)基內(nèi)菌絲（Substratemycelium)

又稱營養(yǎng)菌絲，功能是吸收營養(yǎng)，直徑0.2-1.2um長度100－600um，色素可有可無。基內(nèi)菌絲放線菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)氣生菌絲（Aerialmycelium)

基內(nèi)菌絲長到一定時期，長出培養(yǎng)基外，伸向空間的菌絲，直徑1－1.4um,長短不一，形狀不一，顏色較深。

氣生菌絲第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)孢子絲(Reproductivemycelium)

當(dāng)氣生菌絲生長發(fā)育到一定階段，氣生菌絲上分化出的可形成孢子的菌絲。孢子的形狀及在氣生菌絲上排列的方式隨種而異。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)Varioustypesofspore-bearingstructuresonthestreptomyces第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)放線菌孢子絲類型直形彎曲叢生成束單輪生無螺旋

開環(huán)鉤形原始螺旋形松螺旋

緊螺旋螺旋單輪生無螺旋兩級輪生螺旋兩級輪生第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)放線菌的菌落形態(tài)菌落質(zhì)地硬而且致密，菌落小而不廣泛延伸菌落表面呈緊密的絨狀或堅實、干燥多皺。接種針難以挑取，有時可挑碎，有時可將整個菌落挑起。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)2、古生菌第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)細(xì)菌電子顯微鏡照片3、原核生物的細(xì)胞大小普通光學(xué)顯微鏡下用測微尺測細(xì)菌大小第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)細(xì)菌細(xì)胞的大小細(xì)胞的大小是細(xì)菌分類特征不同細(xì)菌細(xì)胞大小不同同一細(xì)菌的不同菌齡細(xì)胞大小不同細(xì)菌細(xì)胞大小還與營養(yǎng)等因素相關(guān)細(xì)胞大小的測量結(jié)果只是近似值或平均值第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)二、真菌

霉菌

酵母菌

第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)FungiFilamentousfungi2.Unicellularfungi第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)1、霉菌霉菌即絲狀真菌，有分枝與不分枝、無隔菌絲（根霉、毛霉）與有隔菌絲（青霉、曲霉）之分。

菌絲體：由許多菌絲交織在一起而組成。

在固體培養(yǎng)基上，真菌菌絲可分為：營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和繁殖菌絲。第三章-微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)霉菌霉菌在發(fā)酵工業(yè)上廣泛用來生產(chǎn)酒精、抗生素（青霉素、灰黃霉素）、有機(jī)酸（檸檬酸、葡萄糖酸）、維生素等。在農(nóng)業(yè)上用于飼料發(fā)酵、植物生長激素（赤霉素）、殺蟲農(nóng)藥（白僵菌劑）等。另外，霉菌也是造成物品霉變的主要原因。

第三章-