第二章 DNA復(fù)制課件

RuifangLi

HenanUniversityofTechnology

第二章DNA的復(fù)制第二章-DNA復(fù)制4DNA在細胞內(nèi)的存在形式HenanUniversityofTechnology真核細胞原核細胞和單細胞真核細胞染色體線粒體質(zhì)粒第二章-DNA復(fù)制一、染色體（Chromosome)

染色體（chromosome）是細胞在有絲分裂時遺傳物質(zhì)存在的特定形式，是間期細胞染色質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密包裝的結(jié)果。真核生物的染色體在細胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。染色質(zhì)是一種纖維狀結(jié)構(gòu)，叫做染色質(zhì)絲，它是由最基本的單位—核小體(nucleosome)成串排列而成的。第二章-DNA復(fù)制（一）染色體的結(jié)構(gòu)和組成原核生物(prokaryote)

第二章-DNA復(fù)制{組蛋白(

H1H2AH2BH3H4)非組蛋白}核小體{DNA蛋白質(zhì)染色體真核生物染色體的組成第二章-DNA復(fù)制組蛋白的一般特性：■進化上的保守性■無組織特異性■肽鏈氨基酸分布的不對稱性■組蛋白的可修飾性1、組蛋白第二章-DNA復(fù)制在細胞周期特定時間可發(fā)生甲基化、乙?；?、泛素化等。H3、H4修飾作用較普遍，H2B有乙?；饔?、H1有磷酸化作用。所有這些修飾作用都有一個共同的特點，即降低組蛋白所攜帶的正電荷。這些組蛋白修飾的意義：一是改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，直接影響轉(zhuǎn)錄活性；二是核小體表面發(fā)生改變，使其他調(diào)控蛋白易于和染色質(zhì)相互接觸，從而間接影響轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白的可修飾性第二章-DNA復(fù)制（二）核小體(nucleosome)1、定義：用于組成染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，是由DNA鏈纏繞一個組蛋白核構(gòu)成的。第二章-DNA復(fù)制2、核小體的結(jié)構(gòu)核心顆粒、連接區(qū)DNA第二章-DNA復(fù)制6.8:142:11680:18400:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosome螺旋管橫切面第二章-DNA復(fù)制3、DNAC值是指一種生物單倍體基因組DNA的總含量。C值矛盾：生物基因組的大小與生物進化程度不一致的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象稱為C值矛盾(C—Valueparadox)。

第二章-DNA復(fù)制Cvalueparadoxofnucleotide

霉菌藻類G+細菌G-細菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類棘皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌支原體A生物體進化程度高低與大C值不成明顯相關(guān)（非線性）B親緣關(guān)系相近的生物大C值相差較大

第二章-DNA復(fù)制（三）原核生物和真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點比較

第二章-DNA復(fù)制●基因組很小，大多只有一條染色體●

結(jié)構(gòu)簡煉●存在多順反子轉(zhuǎn)錄單元X174D-E-J-F-G-HmRNA蛋白J、F、GHDEE.coli色氨酸操縱子9個順反子9個酶(第六章)1、原核生物基因組結(jié)構(gòu)特點第二章-DNA復(fù)制

●有重疊基因（Sanger發(fā)現(xiàn)）基因內(nèi)基因部分重疊基因一個堿基重疊第二章-DNA復(fù)制2、真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點●真核基因組結(jié)構(gòu)龐大

3×109bp、染色質(zhì)、核膜●單順反子●基因不連續(xù)性斷裂基因（interruptedgene）、內(nèi)含子(intron)、外顯子(exon)●非編碼區(qū)較多多于編碼序列(9:1)●含有大量重復(fù)序列第二章-DNA復(fù)制■不重復(fù)序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質(zhì)。

■中度重復(fù)序列：在基因組中的拷貝數(shù)為101～104。如：rRNA、tRNA

一般是不編碼蛋白質(zhì)的序列，在調(diào)控基因表達中起重要作用

第二章-DNA復(fù)制■高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)達到幾百個到幾百萬個。

●衛(wèi)星DNA：A?T含量很高的簡單高度重復(fù)序列。第二章-DNA復(fù)制二、DNA的結(jié)構(gòu)概念指4種脫氧核苷酸的連接及其排列順序，DNA序列是這一概念的簡稱。堿基序列（一）DNA的一級結(jié)構(gòu)第二章-DNA復(fù)制（二）

DNA的二級結(jié)構(gòu)1、定義：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

2、分類：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA第二章-DNA復(fù)制ABZ第二章-DNA復(fù)制ABZ第二章-DNA復(fù)制（三）

DNA的高級結(jié)構(gòu)1、定義：指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。是一種比雙螺旋更高層次的空間構(gòu)象。2、主要形式：超螺旋結(jié)構(gòu)（正超螺旋和負超螺旋）第二章-DNA復(fù)制正超螺旋：線形或環(huán)狀雙鏈DNA分子以與DNA雙螺旋相同方向旋轉(zhuǎn)，使DNA分子進一步纏繞，而形成的超螺旋。負超螺旋：線形或環(huán)狀雙鏈DNA分子以與DNA雙螺旋相反的方向旋轉(zhuǎn)，使DNA分子進一步纏繞，而形成的超螺旋。L=T+WL：連環(huán)數(shù)。在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。T：纏繞數(shù)。指DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)。（每10.4堿基對的B-DNA螺旋數(shù)為1）W:超螺旋周數(shù)。第二章-DNA復(fù)制（四）

雙鏈DNA特性及在生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用4.1DNA雙鏈的變性與復(fù)性DNA變性（denaturation）：當(dāng)DNA溶液溫度接近沸點或者pH較高時，互補的兩條鏈會分開，稱為DNA變性。DNA復(fù)性（renaturation）：當(dāng)變性DNA的溶液緩慢降溫時，兩條互補的DNA單鏈可重新聚合，形成規(guī)則的雙螺旋，稱為DNA復(fù)性。兩條異源核苷酸單鏈通過序列互補形成雙鏈化合物的過程，稱為核酸雜交。核酸雜交有DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA等類型。第二章-DNA復(fù)制原位雜交：用標(biāo)記的核酸探針，在組織、細胞、基因文庫或凝膠譜帶中，對目標(biāo)DNA進行定位和相對定量的過程。此雜交過程具有高度特異性。4.1.1DNA雙鏈的變性與復(fù)性特性的應(yīng)用第二章-DNA復(fù)制

Northern雜交技術(shù)

Southern雜交技術(shù)◆原位雜交技術(shù)分類第二章-DNA復(fù)制Southern雜交定義：

Southern雜交技術(shù)（Southernblotting）就是用探針標(biāo)記的單鏈DNA或RNA檢測特定DNA的技術(shù)。EdwinMellorSouthern(1975)Southern雜交方法（1）菌落原位雜交（2）凝膠原位雜交4.1.1.1Southern印記雜交技術(shù)第二章-DNA復(fù)制（1）菌落原位雜交感光雜交硝酸纖維素膜影印平板NaOH溶液浸泡SSC溶液浸泡清洗烘干固定用X光膠片覆蓋薄膜第二章-DNA復(fù)制（2）凝膠原位雜交利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段；將膠上的DNA變性并將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上；經(jīng)干烤或者紫外線照射固定；與標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。第二章-DNA復(fù)制4.1.1.2Northern印記雜交技術(shù)1、定義：

Northern印跡雜交（Northernblot）是利用的DNA探針或RNA探針檢測特異性RNA的技術(shù)。通常用于檢測基因的表達情況，即mRNA的情況。Northern雜交由斯坦福大學(xué)的GeorgeStark教授于1975年發(fā)明。第二章-DNA復(fù)制1)將待測定RNA分子通過一定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物（硝酸纖維素膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上）上，即印跡（blotting）；2)固定于膜上的RNA與同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強度下退火，即分子雜交過程。Northern印跡雜交基本過程：第二章-DNA復(fù)制第二章-DNA復(fù)制4.2DNA解鏈溫度（Tm）及應(yīng)用DNA溶液在260nm波長處吸光度增加到最大值一半時的溫度稱為DNA的解鏈溫度或稱熔點(meltingtemperature)。Tm=69.3+0.41(G+C)%核苷酸長度小于25mer,Tm=4(G+C)+2(A+T)應(yīng)用：計算核苷酸鏈長度第二章-DNA復(fù)制4.3DNA超螺旋結(jié)構(gòu)特征對DNA電泳遷移率的影響質(zhì)粒DNA的三種帶型：1.半開環(huán)質(zhì)粒DNA分子（opencircularDNA,ocDNA）：質(zhì)粒的一條鏈斷裂；松弛的環(huán)狀分子；泳動速度最慢；2.線性DNA分子(LineDNA,L-DNA):質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂；泳動速度居中。3.共價閉合環(huán)狀DNA分子(Covalentlyclosedcircular,cccDNA)：質(zhì)粒雙鏈沒有斷裂；超螺旋結(jié)構(gòu)；泳動速度最快；應(yīng)用：通過DNA遷移率判斷質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)是否被破壞。第二章-DNA復(fù)制內(nèi)容提要：●DNA的半保留復(fù)制●與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)●DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）●DNA復(fù)制的其它方式●真核生物中DNA的復(fù)制特點三、DNA的復(fù)制第二章-DNA復(fù)制1、復(fù)制：以親代DNA分子為模板合成子代DNA的過程，稱為復(fù)制。每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式稱半保留復(fù)制。（一）DNA的半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）第二章-DNA復(fù)制2、實驗證據(jù)（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl第二章-DNA復(fù)制“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“l(fā)ight”DNA“Hybrid”DNA第二章-DNA復(fù)制Semi-conservativeConservativeDispersive第二章-DNA復(fù)制3、DNA半保留復(fù)制的生物學(xué)意義：

DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代。

第二章-DNA復(fù)制（二）與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA兩條鏈中的一條為模板鏈，合成子代DNA3、DNA聚合酶:以DNA為模板的DNA合成酶●以四種脫氧核苷酸三磷酸為底物●反應(yīng)需要有模板的指導(dǎo)●反應(yīng)需要有3

-OH存在●DNA鏈的合成方向為5

3

●需要鎂離子第二章-DNA復(fù)制性質(zhì)聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生鏈合成--+DNA聚合酶Ⅰ主要是修復(fù)紫外光引起的DNA損傷；以及在DNA復(fù)制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。DNA聚合酶Ⅱ修復(fù)DNA作用。DNA聚合酶Ⅲ

DNA復(fù)制的主要聚合酶，還具有3’-5’外切酶的校對功能，提高DNA復(fù)制的保真性原核生物中的DNA聚合酶(大腸桿菌）第二章-DNA復(fù)制Klenow片段：DNA聚合酶I被蛋白酶水解成兩段，其C端2/3區(qū)域被稱為Klenow片段具有DNA聚合活性和3’5’外切活性。第二章-DNA復(fù)制

α

β

γ

δ

ε定位細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核5’-3’外切-----3’-5’外切--+++功能引物合成損傷修復(fù)線粒體DNA的復(fù)制細胞核DNA的復(fù)制復(fù)制修復(fù)真核生物中的DNA聚合酶第二章-DNA復(fù)制4、引物：DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物5、引物合成酶（引發(fā)酶）：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物（Primer)。實質(zhì)是以DNA為模板的RNA聚合酶。第二章-DNA復(fù)制

6、DNA連接酶（1967年發(fā)現(xiàn)）：若雙鏈DNA中一條鏈有切口（nick），一端是3’-OH，另一端是5’-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，而使切口連接。

但是它不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來

DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用3’5’3’5’OHP第二章-DNA復(fù)制7、DNA拓撲異構(gòu)酶(DNATopisomerase)：拓撲異構(gòu)酶I：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，作用是松解負超螺旋，使負超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松弛型（B型）DNA。拓撲異構(gòu)酶II：該酶能暫時性地切斷和重新連接雙鏈DNA，作用是將負超螺旋引入DNA分子，使正超螺旋型DNA轉(zhuǎn)變成松弛型DNA。同復(fù)制有關(guān)。例：大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶第二章-DNA復(fù)制第二章-DNA復(fù)制第二章-DNA復(fù)制8、解鏈酶（DNAhelicase)

DNA解鏈酶通過水解ATP獲得能量，沿5’

3’方向隨著復(fù)制叉的前進解開雙鏈DNA。在E.coli中，除沿5’

3’方向解鏈的解鏈酶I、II、III外，還有一個沿3’

5’移動解鏈的rep蛋白參與解鏈。第二章-DNA復(fù)制9、單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSBP)：穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復(fù)性和保護單鏈不被核酸酶降解。10.滑動DNA夾（slidingDNAclamp）：由多個相同的蛋白亞基組成的“油炸圈餅”狀結(jié)構(gòu)。與DNA聚合酶結(jié)合，提高DNA聚合酶在復(fù)制叉上的延伸能力。第二章-DNA復(fù)制（三）DNA的復(fù)制過程（大腸桿菌為例）雙鏈的解開

RNA引物的合成

DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段第二章-DNA復(fù)制1、雙鏈的解開DNA的復(fù)制有特定的起始位點，叫做復(fù)制原點(origin或ori）。富含A、T的區(qū)段?；靖拍睿旱诙?DNA復(fù)制

從復(fù)制原點到復(fù)制終點的區(qū)域組成一個復(fù)制單位，稱為一個復(fù)制子(replicon)。

復(fù)制子中控制復(fù)制終止的位點稱為復(fù)制終點(terminus)。第二章-DNA復(fù)制DNA復(fù)制時在DNA鏈上通過解旋、解鏈和SSB蛋白的結(jié)合等過程形成的Y字型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉（replicationfork）。復(fù)制叉復(fù)制叉第二章-DNA復(fù)制根據(jù)復(fù)制叉移動方向和速度：單起點、雙向等速多起點、雙向等速單向復(fù)制多起點、相向復(fù)制第二章-DNA復(fù)制大約20個DnaA蛋白在ATP的作用下與oriC處的4個9bp保守序列相結(jié)合，得到DnaA復(fù)制起始復(fù)合物。雙鏈解開、復(fù)制起始首先，由拓撲異構(gòu)酶I解開負超螺旋，獲得自由的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。第二章-DNA復(fù)制在HU蛋白和ATP的共同作用下,DnaA復(fù)制起始復(fù)合物使3個13bp直接重復(fù)序列變性,形成開鏈。第二章-DNA復(fù)制解鏈酶（DnaB）六聚體在DnaC幫助幫助下，與兩條單鏈DNA相結(jié)合,進一步解開DNA雙鏈第二章-DNA復(fù)制2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引發(fā)酶(引物合成酶)，引發(fā)前導(dǎo)鏈RNA引物的合成。后隨鏈RNA引物由引發(fā)體引發(fā)。n,n’,n”,DnaB,DnaC,DnaI6種蛋白，在引發(fā)前體作用下，合在一起，并與引發(fā)酶進一步組裝成引發(fā)體。引物長度約為幾個至10個核糖核苷酸。第二章-DNA復(fù)制3、DNA鏈的延伸第二章-DNA復(fù)制DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuousreplication)DNA復(fù)制時其中一條子鏈的合成是連續(xù)的，而另一條子鏈的合成是不連續(xù)的，故稱半不連續(xù)復(fù)制。在DNA復(fù)制時，合成方向與復(fù)制叉移動的方向一致并連續(xù)合成的新生鏈為前導(dǎo)鏈（leadingstrand）；合成方向與復(fù)制叉移動的方向相反，形成許多不連續(xù)的片段，最后再連成的一條完整的DNA鏈，稱為后隨鏈(laggingstrand)。在DNA復(fù)制過程中，滯后鏈?zhǔn)紫仁菙鄶嗬m(xù)續(xù)的按5

3方向合成的多個短片段，這些不連續(xù)的小片段稱為岡崎片段(Okazakifragment)。第二章-DNA復(fù)制3、DNA鏈的延伸RNA引物由DNA聚合酶I切除并將缺口補齊，再由DNA連接酶將兩個岡崎片段連在一起。第二章-DNA復(fù)制4、切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填補上；在DNA連接酶作用下，連接相鄰的DNA鏈。第二章-DNA復(fù)制5、復(fù)制終止當(dāng)復(fù)制叉遇到22個堿基的重復(fù)性終止序列Ter基因時，Tus蛋白與Ter結(jié)合，形成蛋白質(zhì)終止復(fù)合物，使解旋酶不能再將DNA解鏈，阻擋復(fù)制叉前移，等相反方向的復(fù)制叉到達后停止復(fù)制。由于參與DNA復(fù)制的酶脫離DNA雙鏈，將有未被復(fù)制的50-100bp序列通過DNA修復(fù)方式填補空缺，而后DNA拓撲異構(gòu)酶使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。第二章-DNA復(fù)制1、環(huán)狀雙鏈DNA(1)θ型復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA雙向等速復(fù)制時的復(fù)制方式（四）DNA復(fù)制的方式第二章-DNA復(fù)制（1）正鏈復(fù)制原點被專一性切割;（2）正鏈3‘－OH延伸，5‘端被單鏈結(jié)合蛋白保護。

（2）滾環(huán)型復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA單向復(fù)制的特殊方式如：ΦΧ174的雙鏈環(huán)狀DNA復(fù)制型（RF）第二章-DNA復(fù)制（3）D環(huán)復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA單向復(fù)制的特殊方式如：動物線粒體DNA第二章-DNA復(fù)制2、線狀雙鏈DNA眼型5’端補平方式：（1）3‘末端互補序列將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變成環(huán)形后補平T4噬菌體（2）DNA末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)草履蟲線粒體（3）末端蛋白介入Ф29腺病毒DNA第二章-DNA復(fù)制（五）真核生物與原核生物復(fù)制比較1、復(fù)制起點個數(shù)：真核生物每條染色體上有多個復(fù)制起點；原核生物每條染色體上只有1個復(fù)制起點。2、復(fù)制子大?。赫婧松飶?fù)制子小，40-100kb；原核生物復(fù)制子大小與基因組有關(guān)。3、復(fù)制起始時間：真核生物染色體在全部復(fù)制完之前,各個起始點不再重新開始DNA復(fù)制；而在快速生長的原核生物中，復(fù)制起點可以連續(xù)開始新的復(fù)制(多復(fù)制叉)。真核生物快速生長時，往往采用更多的復(fù)制起點。4、復(fù)制速度:真核生物DNA聚合酶移動速度慢，50bp/s；原核生物DNA聚合酶移動速度快，～1000bp/s。第二章-DNA復(fù)制5、DNA聚合酶數(shù)量：真核生物DNA聚合酶種類多；原核生物DNA聚合酶種類少。6、引發(fā)酶：真核生物引發(fā)酶與DNA聚合酶α結(jié)合形成緊密復(fù)合物，在細胞內(nèi)無法分開；原核生物引發(fā)酶僅在復(fù)制時與解旋酶一起工作。7、RNA引物的切除與缺口的修補：真核生物用RNA酶H1切斷DNA與RNA連接處的磷酸二酯鍵，由FEN1蛋白降解RNA引物，DNA聚合酶ε修復(fù)缺口，最后DNA連接酶連接；原核生物用DNA聚合酶I切除降解RNA引物，并修復(fù)缺口，最后DNA連接酶連接。第二章-DNA復(fù)制8、5’端缺口的修復(fù)：真核生物通過端粒酶，形成端粒修復(fù)；原核生物5’缺口末端補平方式有（1）3‘末端互補序列將線性復(fù)制子轉(zhuǎn)變成環(huán)形后補平（2）DNA末端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；（3）末端蛋白介入補平。第二章-DNA復(fù)制（六）DNA復(fù)制的保真度1、△G正確脫氧核苷酸與錯誤脫氧核苷酸添加到DNA3‘的能量差。2、DNA聚合酶的校對功能。3、錯配修復(fù)酶第二章-DNA復(fù)制DNA修復(fù)系統(tǒng)功能錯配修復(fù)恢復(fù)錯配堿基切除修復(fù)切除突變的堿基核甘酸切除修復(fù)修復(fù)被破壞的DNADNA直接修復(fù)修復(fù)嘧啶二體或甲基化DNA第二章-DNA復(fù)制1、錯配修復(fù)●Dam甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺苷酸甲基化●甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進行●根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基第二章-DNA復(fù)制

根據(jù)母鏈甲基化原則找出錯配堿基的示意圖發(fā)現(xiàn)錯配堿基在水解ATP的作用下，MutS，MutL與堿基錯配點的DNA雙鏈結(jié)合MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發(fā)現(xiàn)甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈第二章-DNA復(fù)制

甲基化指導(dǎo)的錯配修復(fù)示意圖錯配堿基位于切口3’下游端，錯配堿基位于切口5’上游端，第二章-DNA復(fù)制2、堿基切除修復(fù)一些堿基在自發(fā)或突變下會發(fā)生脫酰胺，然后改變配對性質(zhì)，造成氨基轉(zhuǎn)換突變腺嘌呤變?yōu)榇吸S嘌呤與胞嘧啶配對鳥嘌呤變?yōu)辄S嘌呤與胞嘧啶配對胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏づc腺嘌呤配對第二章-DNA復(fù)制胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶第二章-DNA復(fù)制如果復(fù)制發(fā)生就會產(chǎn)生一個突變第二章-DNA復(fù)制糖苷水解酶識別改變了的堿基，把堿基從N-β-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為AP位點。第二章-DNA復(fù)制由AP磷酸內(nèi)切酶將受損核苷酸的糖苷-磷酸鍵切開，并移去包括AP位點核苷酸在內(nèi)的小片段DNA，。第二章-DNA復(fù)制DNA連接酶連接利用DNA聚合酶I補上核苷酸第二章-DNA復(fù)制3、核苷酸切除修復(fù)1）通過特異的核酸內(nèi)切酶識別損傷部位2）由酶的復(fù)合物在損傷的兩邊切除幾個核苷酸3）DNA聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈4）DNA連接酶將切口補平第二章-DNA復(fù)制識別損傷部位損傷的兩邊切除幾個核苷酸DNA聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈DNA連接酶將切口補平第二章-DNA復(fù)制4、DNA的直接修復(fù)在DNA光解酶的作用下將環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉(zhuǎn)移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對第二章-DNA復(fù)制DNA復(fù)制原理在分子生物學(xué)技術(shù)中的應(yīng)用體外DNA復(fù)制——PCR反應(yīng)第二章-DNA復(fù)制（一）PCR擴增原理PCR的基本工作原理就是以擬擴增的DNA分子的兩條單鏈為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的原理合成新的DNA鏈。通過不斷重復(fù)這一過程，使目的DNA片段得以體外合成和擴增。第二章-DNA復(fù)制（二）參與PCR擴增的物質(zhì)1、原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP，總稱dNTP)2、模板DNA3、特異性引物4、熱穩(wěn)定性DNA聚合酶5、含二價鎂離子的緩沖溶液第二章-DNA復(fù)制（三）PCR反應(yīng)步驟①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：溫度降至一定溫度(55℃-60℃)，引物與經(jīng)加熱變性成單鏈的模板DNA互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：72℃條件下，DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的子代鏈。循環(huán)重復(fù)變性—退火—延伸過程。在擴增過程中，新合成的DNA片段可以作為下一個循環(huán)的模板。因而，PCR技術(shù)可使目的DNA片段的合成量呈指數(shù)型增長。第二章-DNA復(fù)制5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘55‘5‘55123目的基因變性加熱退火引物與模板結(jié)合延伸底物聚合變性退火延伸變性退火延伸第二章-DNA復(fù)制理論上講，PCR產(chǎn)物的量以遞增（n為循環(huán)次數(shù)）。第二章-DNA復(fù)制DNA的化學(xué)合成法第二章-DNA復(fù)制

化學(xué)合成DNA的實質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個個接上去，每接一個單體就是一個循環(huán)反應(yīng)，包括：基團保護、分離、縮合、分離、去保護五大操作單元。具體操作過程有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酸液三酯法原理設(shè)計的第二章-DNA復(fù)制化學(xué)合成的單元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活縮合氧化脫取代基玻璃珠連接臂第二章-DNA復(fù)制DNA化學(xué)合成的用途合成天然基因修飾改造基因

設(shè)計新型基因

制備探針、引物、接頭

如生長激素釋放抑制素基因、腦啡肽基因、胰島素基因、干擾素基因等如組織型纖溶酶原激活劑基因、尿激酶原基因等

第二章-DNA復(fù)制SNP原理及應(yīng)用SNP(全稱SingleNucleotidePolymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)，是指在基因組DNA序列中，由于單個核苷酸的變異而引起的多態(tài)性。單核苷酸變異包括轉(zhuǎn)換、顛換、缺失和插入。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁,而且多是C轉(zhuǎn)換為T,原因是CG中的C常為甲基化的,自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。SNP具有很高的遺傳性，成為第三代遺傳標(biāo)記,人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等都可能與SNP有關(guān)。第二章-DNA復(fù)制SNP原理及應(yīng)用用于高危群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計和測試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP在基因組中分布相當(dāng)廣泛，研究表明在人類基因組中每300堿基對就出現(xiàn)一次。大量存在的SNP位點，使人們有機會發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實驗操作來看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病基因的表達，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。SNP在基礎(chǔ)研究中也發(fā)揮了巨大的作用，通過對Y染色體SNP的分析，使得在人類進化、人類種群的演化和遷徙領(lǐng)域取得了一系列重要成果。第二章-DNA復(fù)制SNP檢測技術(shù)一、基因芯片技術(shù)基因芯片又稱DNA芯片(DNAchip)或DNA微陣列(DNAmicroarray)。其原理是采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上,然后加入標(biāo)記的待測樣品,進行多元雜交,通過雜交信號的強弱及分布,來分析目的分子的有無、數(shù)量及序列,從而獲得受檢樣品的遺傳信息。其工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交如Southern和Northern印跡雜交一致,都是應(yīng)用已知核酸序列