細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej

細(xì)菌的耐藥性抗菌藥物種類及作用機(jī)制抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)細(xì)菌耐藥機(jī)制及耐藥性檢測(cè)從哪里來？到哪里去？√1細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AntimicrobialSusceptibilityTest）：

測(cè)定抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法，簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AntimicrobialSusceptibilityTest,AST）1.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義2.藥物敏感性試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇3.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法肉湯稀釋法瓊脂稀釋法紙片瓊脂擴(kuò)散法

E試驗(yàn)

4.聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)

2細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20241.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的意義1、指導(dǎo)抗菌藥物臨床應(yīng)用2、預(yù)測(cè)抗菌治療效果3、提示細(xì)菌耐藥機(jī)制存在4、監(jiān)測(cè)細(xì)菌耐藥性5、根據(jù)一些細(xì)菌對(duì)某類藥物表現(xiàn)出固有耐藥性（或敏感性）進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

標(biāo)本：胸水診斷：肺炎檢驗(yàn)：肺炎克雷伯菌MIC阿米卡星>32R頭孢匹肟=<0.25S頭孢曲松0.5S環(huán)丙沙星>4R慶大霉素>16R亞胺培南1S哌拉西林/他唑巴坦=<1S妥布霉素8I復(fù)方黃胺>4/76R診斷治療3細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20242.藥物敏感性試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇CLSI－臨床微生物檢驗(yàn)的“圣經(jīng)”CLSI美國(guó)【臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)】ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute前身NCCLSNationalcommitteeforclinicallaboratory美國(guó)CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)，是國(guó)內(nèi)臨床細(xì)菌檢驗(yàn)遵循的主要標(biāo)準(zhǔn)。由于制訂該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)需要投入大量的人力、財(cái)力和物力，所以大多數(shù)國(guó)家包括中國(guó)都還沒有能力建立自己的標(biāo)準(zhǔn)而依賴CLSI的方法和標(biāo)準(zhǔn)。CLSI標(biāo)準(zhǔn)每年更新?。?！4細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20242.藥物敏感性試驗(yàn)常規(guī)抗菌藥物選擇A組：常規(guī)報(bào)告組，常規(guī)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的藥物；B組：選擇性報(bào)告組，臨床上重要，針對(duì)院內(nèi)感染控制，可用于常規(guī)試驗(yàn)，選擇性報(bào)告藥物；C組：補(bǔ)充報(bào)告組，替代性的補(bǔ)充性的藥物，在A/B組過敏或耐藥時(shí)選用；U組：僅用于治療泌尿道感染的藥物5細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024S：敏感，SusceptibleI：中介，Intermediate

對(duì)SIR的內(nèi)涵與外延藥物名稱MIC（ug/ml）解釋阿米卡星>32R頭孢匹肟=<0.25S頭孢曲松0.5S環(huán)丙沙星>4R慶大霉素>16R亞胺培南1S哌拉西林/他唑巴坦=<1S妥布霉素8I復(fù)方黃胺>4/76RR：耐藥，Resistant體外藥敏試驗(yàn)只能預(yù)測(cè)體內(nèi)治療效果，一般規(guī)律，耐藥=治療無效；敏感≠治療有效。6細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024抗菌藥物的臨床實(shí)踐劑量方案血藥濃度/時(shí)間其他組織或體液藥物濃度/時(shí)間感染部位藥物濃度/時(shí)間藥理學(xué)或毒副作用抗菌作用/時(shí)間藥代動(dòng)力學(xué)PK藥效動(dòng)力學(xué)PDPK：反應(yīng)體內(nèi)藥物濃度變化與時(shí)間關(guān)系PD：反應(yīng)抗菌藥物在體外抗菌活性變化過程＋MICMBCPAEMPC7細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024T>MIC：時(shí)間依賴性Cmax/MICAUC/MIC：濃度依賴性T>MIC：β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物紅霉素克林霉素四環(huán)素萬古霉素；Cmax/MICAUC/MIC：氨基糖苷類喹諾酮類T>MIC即兩次給藥時(shí)間間隔中血清抗菌藥物濃度大于病原菌對(duì)該藥物MIC值的時(shí)間。AUC/MIC指抗菌藥物血清濃度曲線下面積與病原菌對(duì)該藥物MIC值之比值。8細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法

紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)（K-B法，Kirby-Bauer法）稀釋法藥敏試驗(yàn)（MIC法）

濃度梯度法（E-Test）藥敏試驗(yàn)肉湯稀釋法瓊脂稀釋法9細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散，隨著擴(kuò)散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少，在紙片的周圍形成透明的抑菌圈。抑菌圈直徑大小受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度和測(cè)試菌本身的耐藥性影響，反映了測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度。微生物人員測(cè)量每種藥物的抑菌圈直徑，再根據(jù)CLSI最新抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)折點(diǎn)，判定為S、I、R。3.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法

紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)（K-B法，Kirby-Bauer法）報(bào)告模式“藥物名稱＋藥敏方法＋抑菌圈直徑＋藥敏解釋”金黃色葡萄球菌“利奈唑胺30ugKB28S”。10細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024操作方法：1.將56℃左右恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm

的平板，其厚度4mm。11細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20242.無菌挑取孵育16-24h的血平板上4-5個(gè)菌落。3.置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于McFarland0.5管。12細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20244.用無菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個(gè)方向均勻涂抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。13細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20245.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置3-10分鐘后貼上標(biāo)準(zhǔn)抗生素紙片。6.根據(jù)選擇的菌株挑選相應(yīng)的抗菌紙片14細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20247.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動(dòng)；各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。8.經(jīng)過35℃16-24h孵育。15細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20249.量取抑菌環(huán)直徑，根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)告細(xì)菌對(duì)該抗生素敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)。16細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024KB法影響因素

1.抗菌藥物紙片：紙片含藥量是影響抑菌圈大小的重要因素2.培養(yǎng)基：M-H培養(yǎng)基的質(zhì)量對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有直接影響，如培養(yǎng)基pH改變、瓊脂的厚度和硬度也可影響抑菌圈的大小。3.接種菌量：加大菌量可使抑菌圈減小，相反可使抑菌圈擴(kuò)大。4.試驗(yàn)操作質(zhì)量

(1)試驗(yàn)過程菌液層涂布應(yīng)厚薄均勻；接種細(xì)菌后，平板應(yīng)在室溫放置3-5min，待菌液被培養(yǎng)基吸收后，再貼紙片；孵育溫度、孵育時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格按照要求；堆放試驗(yàn)平板不超過兩塊，以使其受熱均勻。

(2)結(jié)果觀察測(cè)量抑菌圈應(yīng)仔細(xì)、精確。5.質(zhì)控菌株本身的藥敏特性是否合格，有無變異。17細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024質(zhì)量控制

采用參考菌株與待測(cè)菌株同批測(cè)試是藥敏試驗(yàn)質(zhì)控的主要措施。常用的質(zhì)控菌株是：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞桿菌ATCC27853等。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)待測(cè)菌的不同而分別選用。當(dāng)更換藥物和培養(yǎng)基時(shí)，也應(yīng)用參考菌株進(jìn)行檢測(cè)。18細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法

稀釋法藥敏試驗(yàn)（MIC法）

肉湯稀釋法瓊脂稀釋法稀釋法是將抗菌藥物作不同濃度的稀釋（通常為對(duì)倍稀釋），接種一定濃度的待測(cè)菌，35℃孵育18-24小時(shí)后，定量測(cè)定抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。肉湯稀釋法使用的稀釋物質(zhì)為溶劑，使用待檢菌懸液檢測(cè)藥物MIC，而瓊脂稀釋法使用的稀釋物為瓊脂，待測(cè)菌株點(diǎn)種在瓊脂表面進(jìn)行檢測(cè)。無論是哪種稀釋法均通過測(cè)量某菌種大量菌株的MICs來評(píng)價(jià)該菌是敏感還是耐藥，然后根據(jù)藥物的臨界濃度和其他相關(guān)因素來制定MIC界值。當(dāng)待測(cè)菌對(duì)同種藥物檢測(cè)出MIC值時(shí)，就可以用檢測(cè)值與界值比較，小于界值為S，高于界值為I或R。報(bào)告模式藥物名稱＋藥敏方法＋MIC值＋藥敏解釋金黃色葡萄球菌“利奈唑胺MIC0.5S19細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024肉湯稀釋法4 8 16 3264128256ug/ml混

混清抗生素倍比稀釋，種菌105CFU/ml，孵育35℃，16～20h，判讀。體外藥敏試驗(yàn)中使用的最低抑菌濃度(MIC)是指用稀釋法所測(cè)得的某抗菌藥物抑制檢測(cè)菌生長(zhǎng)的最低濃度，用μg/ml表示。20細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法

在微量聚乙烯微板孔中加入各種不同濃度的抗生素100μl，從低濃度往高濃度加樣，不需要更換吸管。挑選18~24小時(shí)的菌落置M-H肉湯增菌4~6小時(shí)。制備0.5麥?zhǔn)媳葷峁?，然?:200稀釋，使之最終濃度105CFU/ml。用微量加樣器接種100μl菌液到96孔中，蓋上蓋板。同時(shí)作陽(yáng)性、陰性對(duì)照。手工看濁度或儀器自動(dòng)判讀。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告細(xì)菌對(duì)某抗菌藥物為敏感、耐藥和中介。21細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024瓊脂稀釋法

濃度16 32 64128256ug/ml制備含對(duì)倍抗生素濃度梯度的平板，制備菌懸液，點(diǎn)種菌，104/每個(gè)點(diǎn)，孵育，判讀結(jié)果優(yōu)點(diǎn)：金標(biāo)準(zhǔn)，精確可靠，多用于研究。稀釋法藥敏試驗(yàn)（MIC法）

肉湯稀釋法瓊脂稀釋法缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大22細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024

濃度0.5 124ug/ml大腸埃希菌頭孢噻肟23細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20243.抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的方法

濃度梯度法（E-Test）藥敏試驗(yàn)E-Test即濃度梯度（多點(diǎn)藥物濃度法）瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。E試紙條背面含有干化、濃度由高至低連續(xù)梯度分布的抗菌藥，藥物濃度按log2梯度遞減?？咕幬飶木哂袧舛瓤潭鹊乃芰显嚰垪l中向瓊脂中擴(kuò)散，在試紙條周圍抑菌濃度范圍內(nèi)受試菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈，抑菌圈與試紙條的橫向相交處的讀數(shù)刻度為MIC值。該方法結(jié)合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，可得到微生物對(duì)抗菌藥物敏感度的定量結(jié)果，但價(jià)格較高。24細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20241.挑取16～20h的菌落2.用無菌生理鹽水制備成0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫鹊木?。操作方法?.用無菌棉簽浸入細(xì)菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個(gè)方向平均涂抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60℃）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周。25細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/20244.用鑷子將E-TEST試條的抗菌藥物的一面貼向瓊脂表面，有刻度的一面向外，直徑140mm的平板可放置

6條，90mm平板只能放置1～2試條。5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。6.孵育后形成一橢圓形抑菌圈，抑菌圈和試條的相交處的刻度即為抗菌藥物對(duì)該菌的最低抑菌濃度(MIC)。26細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024聯(lián)合藥物敏感試驗(yàn)

臨床上常因下列情況需聯(lián)合使用兩種以上的抗菌藥物：①用于病原菌尚不確定的急、重癥感染的經(jīng)驗(yàn)治療，如急性心內(nèi)膜炎、敗血癥等；②治療多種細(xì)菌所引起的混合感染；③對(duì)于某些多耐藥菌株感染，可取得協(xié)同抗菌作用；④減少或推遲治療過程中細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生；⑤減少某些抗菌藥物的用量從而減輕其毒副作用。27細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果判斷

聯(lián)合藥敏試驗(yàn)可以出現(xiàn)四種結(jié)果：①協(xié)同作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時(shí)，藥效顯著大于其單藥抗菌活性的總和；②相加作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時(shí)，藥效等于兩藥單獨(dú)抗菌活性的總和；③無關(guān)作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時(shí)，藥效等于活性最大的抗菌藥物的藥效；④拮抗作用：兩種抗菌藥物聯(lián)合作用時(shí)，藥效顯著低于其單獨(dú)抗菌活性，即一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物所削弱。28細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024

聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的方法

棋盤稀釋法原理先測(cè)定兩藥單藥時(shí)各自的MIC值，再將各種稀釋度的兩藥混合，測(cè)定兩藥聯(lián)合時(shí)各藥的MIC值，比較兩藥聯(lián)合時(shí)MIC值與其單獨(dú)MIC值，計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcectration，F(xiàn)IC)，作為協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗的判斷。結(jié)果判讀計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（FIC）：判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)＜0.5協(xié)同作用

0.5～1相加作用

1～2無關(guān)作用＞2拮抗作用29細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024向臨床醫(yī)師報(bào)告的藥敏結(jié)果1.檢測(cè)報(bào)告必須包括抗菌藥：不要用商品名；結(jié)果：要解釋成S、I、R2.可選擇的，但有用的內(nèi)容如果分離菌株屬于某一重要的耐藥表型，寫上其治療意義；抗菌藥物的費(fèi)用；標(biāo)準(zhǔn)劑量最后，一般只給出一線用藥的結(jié)果，其他結(jié)果保存在微生物室，需要時(shí)提供。30細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024病原菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果也許是臨床醫(yī)生最關(guān)心的問題，因?yàn)樗幟艚Y(jié)果直接影響到臨床醫(yī)生對(duì)藥物的選擇。病原菌對(duì)某種藥物無論敏感（S）、中介（I），還是耐藥（R）（有些抗菌藥物無I這個(gè)類別），都是通過微生物實(shí)驗(yàn)室使用特定的方法檢測(cè)出的結(jié)果。這些方法包括：紙片擴(kuò)散法（K-B法）、E-Test法、瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。一般來說，稀釋法能夠測(cè)定幾乎所有藥物的MIC，且最為準(zhǔn)確，是藥物敏感實(shí)驗(yàn)中的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法；K-B法能夠測(cè)定的藥物有限，且有與稀釋法不符合的現(xiàn)象，一些新藥是否能使用K-B法還存在爭(zhēng)議；E-Test法的準(zhǔn)確性介于稀釋法和K-B法之間，臨床常規(guī)檢測(cè)較少使用此法。在稀釋法中，手工的肉湯稀釋法是最經(jīng)典的藥敏方法，但無論哪種稀釋法，其操作都非常復(fù)雜，微生物實(shí)驗(yàn)室難以常規(guī)使用。目前，自動(dòng)化微生物鑒定藥敏儀可以同時(shí)對(duì)待測(cè)微生物進(jìn)行鑒定和藥敏檢測(cè)，藥敏所使用方法即是根據(jù)肉湯稀釋法改良的方法。由于自動(dòng)化鑒定藥敏儀使用的是金標(biāo)準(zhǔn)的藥敏方法，因此在對(duì)自動(dòng)化儀器結(jié)果有懷疑時(shí)，微生物專家只能依靠其他藥敏方法進(jìn)行驗(yàn)證，如K-B法或E-Test法。臨床醫(yī)生獲得的報(bào)告中不同藥物可能會(huì)出現(xiàn)兩種或多種方法的結(jié)果，因此臨床醫(yī)生需要仔細(xì)閱讀報(bào)告，以明確藥敏結(jié)果使用的方法。小結(jié)31細(xì)菌耐藥性原理抗菌藥物敏感試驗(yàn)kej5/9/2024體外藥敏試驗(yàn)的局限性（1）CLSI制定藥敏界值時(shí)固有的局限性，如所有藥物都是按血藥濃度為基礎(chǔ)制定標(biāo)準(zhǔn)，然而局部感染中相應(yīng)部位的藥物濃度高低無法考量，其他體液或組織藥物濃度可能高于或低于血藥濃度，因此造成臨床療效和藥敏檢測(cè)結(jié)果不符的現(xiàn)象；（2）體外藥敏試驗(yàn)不能反映病原菌和藥物在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的動(dòng)態(tài)變化。不同的患者感染的病原菌種類和數(shù)量不同、藥物與個(gè)體血漿蛋白結(jié)合率不同、藥物代謝產(chǎn)物的抗菌活性與原藥可能不同等，這些因素都會(huì)改變藥物的臨床療效。（3）體外藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)無法覆蓋到藥代學(xué)因素，目前制定的折點(diǎn)和劑量的關(guān)系中某些藥物并不能達(dá)到折點(diǎn)、劑量和療效的統(tǒng)一。我國(guó)使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)CLSI（美國(guó)）制定的標(biāo)準(zhǔn)，因此近年來很多微生物專家呼吁建立自己國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)，目的就是達(dá)到折點(diǎn)、劑量和療效的統(tǒng)一。（4）未找到真正的感染原因。有菌