熒光探針與分子傳感器

熒光探針與分子傳感器郭祥群博士，博士生導(dǎo)師全國(guó)高?；瘜W(xué)教育研究中心第四屆學(xué)術(shù)委員會(huì)副主任，教育部高等學(xué)校本科教學(xué)工作水平評(píng)估專家，中國(guó)化學(xué)會(huì)理事先后獲得國(guó)家級(jí)獎(jiǎng)2項(xiàng)，省部級(jí)獎(jiǎng)4項(xiàng)，發(fā)表科研與教學(xué)研究論文100余篇。研究興趣：熒光光譜分析的原理與技術(shù)，在研項(xiàng)目涉及生物活性自由基的熒光表征，海洋污染生物監(jiān)測(cè)技術(shù)研究，食品安全等。聯(lián)系方式:xqguoL),2187288(O),2182355(H)200507052第2頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FluorescentProbesIntroductionFluorescentSensor

熒光傳感FluorescentTracer熒光示蹤

FRET共振能量轉(zhuǎn)移熒光Application

1.Radicalprobes2.Ionprobes3.NIRFFluorescenceimage4.DNAsequence5.Proteinprobes6.DNAprobes7.Membraneprobes8.pHprobes200507053第3頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FluorescenceresearchKeyword:Fluorescen*Period:Jan/2005-Jun/2005Database:

美國(guó)化學(xué)會(huì)(ACS)數(shù)據(jù)庫(kù)3566篇WPS電子期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù)206篇SDOS全文數(shù)據(jù)庫(kù)（上交鏡像）1890篇英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)（RSC)數(shù)據(jù)庫(kù)120篇研究與應(yīng)用領(lǐng)域涉及：生命環(huán)境材料等講座要求了解：熒光探針表征應(yīng)用研究意義200507054第4頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天MolecularProbeMolecularreporterFromJ.Fluorescence200507055第5頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天homepagewww.probes.comMolecularprobes200507056第6頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天JablonskidiagramT1h

Ah

AAbsorption10-15sVibrational

relax,VR,10-1210-14sInternalconversion,IC,10-1110-13sIntersystemcrossing,ISC,10-210-6sFluorescencePhosphorescenceICISCS0S1S2321010-8s10-3100sh

Fh

PHOMOLUMO第7頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天CharacteristicsofFluorophoreExcitationwavelength激發(fā)波長(zhǎng)

exEmissionwavelength發(fā)射波長(zhǎng)

emExtinction(absorption)coefficient吸光系數(shù)

Stoke’sshiftFluorescencelifetime熒光壽命

Fluorescencequantumyield熒光量子產(chǎn)率

FluorescenceAnisotropy各項(xiàng)異性rFluorescencePolarization熒光偏振p200507058第8頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Excitationandemissionspectra

1ExcitationspectrumEmissionspectraF

emF

ex

em

ex200507059第9頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Fluorescencelifetimerelaxation(10-12s)S0S1S1hvAhvF

knrSimplifiedJablonskidiagram

:EmissionrateKnr:nonradiativedecayrateDefinitionAveragelifetime:theaveragetimethemoleculespendsintheexcitedstatepriortoreturntothegroundstate.Expression第10頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FluorescenceQuantumYieldDefinition

ThefluorescencequantumyieldistheratioofthenumberofphotonsemittedtothenumberabsorbedExpression

第11頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Sensor(1)+SRTS信號(hào)單元，R識(shí)別單元，T靶分子hvhvhv自由基傳感Z.-Y.Bian,X.-Q.Guo*,AnalyticalScience,21553-559,2005第12頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Sensor(2)DDhue

-hvhvhvPETPhotoinducedElectronTransferhvHg2+E.M.Nolan,etal.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125:14270-14271SRT2005070513第13頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Sensor(3)RShvhvFRET

F

D,ex

D,em

A,ex

A,em

F

D,ex

D,em

A,ex

A,emT+hvhv’FluorescenceResonanceEnergyTransfer第14頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天ProbingDNAMolecularbeacons分子信標(biāo)ADQFTargetDNAssDNAbindingproteinDenaturingreagentQFFQ2005070515第15頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Sensor(4)+S-RThvhvAl3+hv2005070516第16頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Sensor(5)+S-RT+競(jìng)爭(zhēng)型+S-RT催化劑中間體+hvhv催化型2005070517第17頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天TheFusionofIntegalMembraneProtein熒光素標(biāo)記鼠蛋白質(zhì)羅丹明標(biāo)記人蛋白質(zhì)鼠細(xì)胞人細(xì)胞37°C15°C融合異核體FromInstantnotes,Biochemistry,E2Tracer膜內(nèi)蛋白側(cè)向運(yùn)動(dòng)2005070518第18頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天CelltracerA30μm–thicksectionofazebrafishembryostainedwithCellTrackerCM-DiI(C7000,C7001)priortoimmunohistochemicalanalysis.Aone-day-oldzebrafishembryowasimmobilizedandimpaledinthehindbrainwithamicroelectrodefilledwith1mg/mLCellTrackerCM-DiIin95%ethanol.Onedaylater,thebrainwasfixed,embedded,frozeninliquidnitrogenandsectionedonacryostat.Afterblockingwith0.1%TritonX-100inPBScontaining2%BSAand2%normalgoatserum,the30μm–thicksectionwasincubatedwithprimaryanti-glialantibodyinconjunctionwithfluoresceingoatanti–mouseIgGantibody.Thissectionwasthenviewedsequentiallythroughopticalfiltersetsappropriateforrhodamineandfluorescein,andtheresultingimagesweresuperimposed.TheimagewascontributedbyWilliamTrevarrow,BeckmanInstitute,CaliforniaInstituteofTechnology.C7000C68H105Cl2N3O熒光染色的斑馬魚胚胎第19頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天TracerAgF-AgAb抗體在免疫反應(yīng)前后熒光探針自身的熒光量子產(chǎn)率不發(fā)生變化的情況測(cè)反應(yīng)剩余的標(biāo)記抗原，熒光正比抗原量測(cè)固相熒光，熒光反比抗原量測(cè)固相洗脫，熒光反比抗原量F標(biāo)記抗原待測(cè)抗原?—F?—F熒光分子F????—F?—F?第20頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FRET

FluorescenceResonanceEnergyTransfer第21頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天PrincipleofFRETRateofenergytransfer

DquantumyieldofD

DlifetimeofDr

distancebetweenAandDnrefrcativeindexNAvogadro’snumberk

orientationfactorJ

overlapintegral

F

D,ex

D,em

A,ex

A,em2005070522第22頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Orientationfactork=2/3randomizebyrotationaldiffusionpriortoenergytransfer2005070523第23頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FRETsensordesignbasedondonorandacceptordistancechangesK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-4132005070524第24頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FRETprobingcAMPK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413cAMPcyclicadenosinemonophosphate環(huán)腺苷酸環(huán)腺苷酸依賴蛋白激酶支架結(jié)構(gòu)四聚體表征cAMP2005070525第25頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FRETprobingPDE磷酸二酯酶BeforehydrolysisAfterhydrolysisK.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413BeforeAfter香豆素phosphodiesterasehvhvhv第26頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天EmissionspectraPDE2005070527第27頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天FRETsensordesignbasedonmodulationofspectraloverlap

F

D,ex

D,em

A,ex

A,em

F

D,ex

D,em

A,ex

A,em有利于能量轉(zhuǎn)移不利于能量轉(zhuǎn)移2005070528第28頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Probingphosphatase磷酸酶LFabsQFabsDonorEmiLF(內(nèi)酯）QF(醌型）K.Kikuchi,etal.,TrAC,2004,23(6),407-413PTP蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶香豆素?zé)晒馑氐?9頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物活性自由基研究的重要性?OHO2-?RO?ROO?NO活性氧自由基其他R?GS?為維持生命所必須過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致生物大分子損傷生命過(guò)程中所產(chǎn)生的自由基，是行使生理功能及介導(dǎo)其生化反應(yīng)所必需的。如在線粒體呼吸鏈上電子傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的自由基在線粒體能量代謝中起著重要的作用。2005070530第30頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天?OH抽氫導(dǎo)致DNA斷裂2005070531第31頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天硫中心自由基引起細(xì)胞損傷2005070532第32頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天順磁標(biāo)記熒光探針-ProbingfreeradicalParamagnetic(Lowfluorescence)Diamagnetic(Highfluorescence)產(chǎn)物抗磁性，穩(wěn)定自由基之間的反應(yīng)快速多功能探針：ESR；熒光（強(qiáng)度、偏振、壽命等）熒光顯微技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞、組織的自由基作用研究2005070533第33頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天比率型熒光分子-ProbingNOSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2002,2250-2251NO?FRET

ex=360nm

em=470nm

em=410nm

ex=360nm熒胺香豆素2005070534第34頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天?OH比率型熒光探針-Probing?OHSoh,N.etal.,Chem.Commun.,2004,496-497以與自由基作用的特征靶分子或官能團(tuán)作為識(shí)別基團(tuán)熒光素羅丹明脫氧胸腺嘧啶核苷二聚體第35頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ca2+indicatorFura-2Fura-Ca2+Fura鈣具有使原生質(zhì)膠體穩(wěn)定以及調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和通透性的作用。對(duì)各種細(xì)胞的興奮性具有正負(fù)效應(yīng)。ExcitationEmission2005070536第36頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Ca2+indicatorIndo-1Indo-1-Ca2+2005070537第37頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天ICTprinciple2005070538第38頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天ImageofFura-2-Ca2+False-colorimage（假色成像）offreeCa2+concentrationinaPurkinjeneuron（梨狀神經(jīng)元）fromembryonicmousecerebellum（胚鼠小腦）Thecompositeimage,whichrepresentstheratioofimagesobtainedwithexcitationat340nmand380nm,revealsthemobilizationofinternalCa2+storeswithoutcontributionfromCa2+influx.Fura-2-Ca2+胚鼠小腦梨狀神經(jīng)元中游離Ca2+濃度熒光成像2005070539第39頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天ImageofspiralCa2+waveFluo-3(F1240)confocalimageofaspiralCa2+waveinitiatedbyinjectionofanonhydrolyzableanalogofinositol1,4,5-triphosphate（肌醇三磷酸非水解模擬物）inaXenopuslaevisoocyte（瓜蟾卵母細(xì)胞）.TheimagewascontributedbyDavidClapham,HarvardUniversity,andreproducedwithpermissionfromCell69,283(1992).瓜蟾卵母細(xì)胞中螺旋Ca2+波共焦熒光成像Fluo-32005070540第40頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Na+indicatorSBFISBFISBFI-Na+海馬切片CA1錐形神經(jīng)元Na+成像2005070541第41頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Cd2+indicatorFluorescenceemissionspectraofamixtureof1μMBTC-5N(B-6845)and1μMTCPPinsolutionscontainingzeroto1.0μMCd2+.BTC-5N,tetrapotassiumsalt2005070542第42頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Zn2+indicatorAPTRA-BTC,tripotassiumsaltFluorescenceexcitationspectraofAPTRA-BTC(A-6895)insolutionscontainingzeroto25μMZn2+.2005070543第43頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天pHindicator5-sulfofluoresceindiacetate,sodiumsalt(SFDA)2005070544第44頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNA-basedpHsensorTatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130第45頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天TatsuoOhmishietal.,Biochemistry2005,447125-7130DNA-basedpHindicator表征MCF-7乳腺癌細(xì)胞編程性死亡過(guò)程ApoptosisMCF-7乳腺癌細(xì)胞2005070546第46頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天熒光成像通過(guò)靜脈注射或腹腔注射到生物體內(nèi)的近紅外熒光探針吸著并聚集于腫瘤等組織中，腫瘤中存在特異的細(xì)胞、蛋白質(zhì)、酶等，這些物質(zhì)可與熒光探針結(jié)合或反應(yīng)而發(fā)出熒光，可根據(jù)熒光的位置、強(qiáng)度得知腫瘤的位置、大小，是否轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散及腫瘤的陰性、陽(yáng)性等一系列信息.2005070547第47頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天近紅外成像為什么選擇近紅外？2005070548第48頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天GFP綠色熒光蛋白Endostatin內(nèi)生抑制素Cy5.5花菁熒光染料NIR1,NIR2,GFP不同濾光片CY5.5標(biāo)記的內(nèi)生抑制素特異識(shí)別腫瘤第49頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天2005070550第50頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天2005070551第51頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Self-quenchingprobeRalphWissleder,et.al.NatureAmerica1999,17:375-378酶活化酶作用位點(diǎn)C-PGC腫瘤伴生溶酶體蛋白酶特異識(shí)別自猝滅熒光探針（或細(xì)胞成像）多甲氧基聚乙烯乙二醇-聚賴氨酸-cy5.5(C-PGC),2005070552第52頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天2005070553第53頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Phasecontrastimage相差成像NIRFimage腫瘤細(xì)胞成像NIRFNIRFLysosomalcompartment溶酶體分隔2005070554第54頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天NIRFimage2005070555第55頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Template3’CCGGTAGCAACT5’Primer5‘GG3’GGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTdATPdCTPdGTPdTTPddATPdATPdCTPdGTPdTTPddCTPdATPdCTPdGTPdTTPddGTPdATPdCTPdGTPdTTPddTTPF1--AF2--CF3--GF4--TDNApolymerasedATP脫氧腺苷dCTP脫氧胞苷dGTP脫氧鳥苷dTTP脫氧胸苷ddATP雙脫氧腺苷ddCTP雙脫氧胞苷ddGTP雙脫氧鳥苷ddTTP雙脫氧胸苷FDNAsequence第56頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天近紅外成像熒光探針七次甲基花菁素類(圖2，a)2005070557第57頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Proteinprobes蛋白質(zhì)熒光探針RG對(duì)牛血清白蛋白（BSA）的響應(yīng)圖WWW.第58頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNAprobeAbsorptionandfluorescenceemissionspectraofethidiumbromdeboundtoDNAEthidiumbromide溴化乙錠2005070559第59頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天DNAprobeHoechst33258(bis-benzimide)AbsorptionandfluorescenceemissionspectraofHoechst33258boundtoDNA.2005070560第60頁(yè),共64頁(yè)，2024年2月25日，星期天Normalandcamptothecin-treatedbovinepulmonaryarteryendothelialcells(BPAEC)werestainedwithC4-BODIPY500/510C9(B-3824andHoechst33258(H-1398,H-3569).BODIPYandHoechstfluorescencewererecordedusinglongpassfiltersappropriateforfluoresceinandDAPI,respectively.AnoverlayoftheimagesindicatesthataredshiftinBODIPYfluorescenceissignificantinnormalcells(leftpanel)comparedtothatinapoptoticcells(rightpan