蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見問題

蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及常見問題免疫印跡技術(shù)的基礎(chǔ)-免疫反應(yīng)

免疫測定(immunoassay)利用抗原抗體反應(yīng)來測定標(biāo)本中抗原或抗體的方法檢測對象：具體免疫活性的物質(zhì)反應(yīng)特性：高度的特異性和敏感性第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

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WesternBlot常見問題分析內(nèi)容概要第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。WesternBlot原理第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的互作目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析WesternBlot的應(yīng)用第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

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WesternBlot常見問題分析內(nèi)容概要第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天WesternBlot流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天通過水溶法或有機(jī)溶劑制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機(jī)溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通過層析或電洗脫法制備目的蛋白

蛋白樣品的制備第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天蛋白樣品的定量Bradford法考馬斯亮藍(lán)G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式，在一定濃度的乙醇和酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，與蛋白結(jié)合后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處有最大吸收值，化合物顏色深淺與蛋白的濃度高低成正比。TIANGEN產(chǎn)品

Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天不連續(xù)的電泳緩沖體系。SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天凝膠成分N,N’-亞甲雙丙烯酰胺和丙烯酰胺

SDS配膠的Tris緩沖液TEMED過硫酸銨Tris-甘氨酸電泳緩沖液第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（％）線性分離范圍（KD)1512-431016-687.536-945.057-212第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜膜的選擇尼龍膜硝酸纖維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：480μg/cm2

；硝酸纖維素膜：80μg/cm2

）目的蛋白與硝酸纖維膜的結(jié)合能力弱需要更大的機(jī)械強(qiáng)度第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)45min或過夜。半干法將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。

轉(zhuǎn)膜方法第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天麗春紅S染色蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色

只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋白探針的Western印跡過程。轉(zhuǎn)膜后檢測第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)膜后的封閉脫脂奶粉BSAWesternBlot膜封閉液（生物試劑公司提供）

把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入封閉劑，搖床上平緩搖動，于室溫溫育1-2小時。倒掉緩沖液，立即加入一抗溶液與濾膜溫育。第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

一抗用量也根據(jù)0.1ml/cm2來計算，室溫1-2小時。倒掉一抗溶液，用250mlPBS漂洗液濾膜3次，每次

10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，室溫溫育

1-2小時。一抗、二抗孵育第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天二抗與底物反應(yīng)顯色辣根過氧化物酶法堿性磷酸酶法化學(xué)發(fā)光顯色法Anti－His第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用舉例：用Westernblot檢測患者血清中的HIV病毒抗體Step1：經(jīng)電泳將HIV混合抗原按分子量大小分離Step2：印跡轉(zhuǎn)移已分離的抗原至硝酸纖維膜上，封閉Step3：加入待檢病人血清，漂洗Step4：加入合適的、標(biāo)記的二抗（HRP或AP），漂洗Step5：加入顯色底物（或放射自顯影），顯色檢測第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天

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WesternBlot常見問題分析內(nèi)容概要第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Westernblot常見問題—SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入AP和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊QA第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天條帶比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”條帶？凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適Westernblot常見問題—SDS電泳QA第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？

可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的紙片確保膜和膠塊之間沒有氣泡緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫Westernblot常見問題—轉(zhuǎn)膜及抗體檢測QA第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天蛋白分子量<10KD蛋白的等電點=8SDS濃度不合適凝膠太厚蛋白分子量<10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜更換高pH值Buffer在陰極buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高轉(zhuǎn)膜效率延長轉(zhuǎn)膜時間Westernblot常見問題—蛋白轉(zhuǎn)膜效率低AR第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天膜沒有均勻浸濕膜或者緩沖液污染封閉不充分抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)抗體濃度過高轉(zhuǎn)膜前用100%甲醇將膜完全浸濕拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度ARWesternblot常見問題—顯色背景高第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天抗體保存不當(dāng)抗原不充足膜的漂洗過度抗體長期保存應(yīng)在－70℃，使用前做效價檢測增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照減少漂洗的時間和次數(shù)Westernblot常見問題—雜交信號弱AR第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天一抗不是唯一特異的二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合ARWesternblot常見問題—顯現(xiàn)非特異性條帶第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天分子量Marker：確定蛋白條帶的分子量已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照空白載體對照：如果是表達(dá)蛋白需要做表達(dá)前的內(nèi)參：看家基因編碼表達(dá)的蛋白

參照體系第28頁,共29