第五章 細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)課件

微生物學(xué)檢驗(yàn)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第五章

細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)本章內(nèi)容第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)1第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)2第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)3第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化與微型化4第五節(jié)細(xì)菌的其他鑒定技術(shù)5第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)本章內(nèi)容學(xué)習(xí)目標(biāo)：

掌握：革蘭染色的原理、操作及結(jié)果判斷；細(xì)菌接種技術(shù)、培養(yǎng)方法、細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象、生化反應(yīng)的原理。

熟悉：細(xì)菌染色標(biāo)本檢查的基本程序，細(xì)菌培養(yǎng)常用培養(yǎng)基和器材。

了解：細(xì)菌不染色標(biāo)本的檢查方法和用途；免疫學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)及自動(dòng)化檢測技術(shù)等鑒定微生物。本章重點(diǎn)：★革蘭染色的原理、操作方法及意義★細(xì)菌培養(yǎng)及生長現(xiàn)象★細(xì)菌生化反應(yīng)及臨床應(yīng)用第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)一、染色標(biāo)本鏡檢

（一）染色標(biāo)本檢查的一般程序第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)1.單染色法

細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分鐘，水洗后待玻片燥后即可鏡檢（二）常用的染色方法第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（二）常用的染色方法2.革蘭染色法【方法】

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（二）常用的染色方法2.革蘭染色法【結(jié)果】紫色——革蘭陽性菌（×1000）紅色——革蘭陰性菌（×1000）第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（二）常用的染色方法3.抗酸染色法【結(jié)果】

抗酸染色結(jié)果（×1000）：紅色為抗酸桿菌，藍(lán)色為非抗酸桿菌第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（三）其他染色法1.特殊結(jié)構(gòu)染色法（1）莢膜染色法莢膜染色結(jié)果，×1000第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（三）其他染色法1.特殊結(jié)構(gòu)染色法（2）鞭毛染色法鞭毛染色結(jié)果，×1000第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（三）其他染色法1.特殊結(jié)構(gòu)染色法（3）芽孢染色法芽孢染色結(jié)果，×1000第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（三）其他染色法1.特殊結(jié)構(gòu)染色法（4）異染顆粒染色法

異染顆粒亞甲藍(lán)染色結(jié)果：白喉棒狀桿菌，×1000第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)（三）其他染色法2.負(fù)染色法墨汁莢膜染色（腦脊液中的新型隱球菌，×400）第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)二、不染色標(biāo)本鏡檢

1.壓滴法壓滴法鏡檢結(jié)果：尿涂片，×400第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)二、不染色標(biāo)本鏡檢2.懸滴法第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)二、不染色標(biāo)本鏡檢

3.毛細(xì)管法

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)三、其他顯微鏡檢查第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)檢驗(yàn)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)一、基本條件

接種環(huán)培養(yǎng)皿紅外接種滅菌器第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)箱生物安全柜第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)一、基本條件第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

培養(yǎng)基成份培養(yǎng)基：人工配制的適合細(xì)菌生長繁殖的綜合營養(yǎng)基質(zhì)。營養(yǎng)物質(zhì)：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇類、血液、雞蛋及動(dòng)物血清、生長因子、無機(jī)鹽等水凝固劑：瓊脂、明膠抑制劑：孔雀綠、煌綠、膽鹽、抗生素等指示劑：溴麝香草酚藍(lán)，溴甲酚紫、酚紅等第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：普通瓊脂平板營養(yǎng)培養(yǎng)基：滿足營養(yǎng)需求較高細(xì)菌的生長，如血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板等鑒別培養(yǎng)基：含有某些特定的底物，用于鑒別細(xì)菌，如克氏雙糖鐵培養(yǎng)基（KIA）及各種生化反應(yīng)用培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：具有選擇性抑制非目的菌生長作用，用于選擇性培養(yǎng)目的菌，如SS平板、中國藍(lán)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板等增菌培養(yǎng)基：用于含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯、GN增菌肉湯特殊培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)基、L型細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基種類（按用途分）第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)基第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)液體培養(yǎng)基第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類）液體培養(yǎng)基：不含凝固劑，用于增菌和接種純種細(xì)菌。半固體培養(yǎng)基：含0.2％～0.5％瓊脂，用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力。固體培養(yǎng)基：含2％～3％瓊脂，用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)。第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)基滅菌★基礎(chǔ)培養(yǎng)基：121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘★含糖培養(yǎng)基：113℃滅菌15分鐘★含雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3天3次★不耐高溫的液體成分：濾過除菌調(diào)配—溶化—調(diào)Ph—過濾澄清—分裝—滅菌—檢定—保存培養(yǎng)基制備程序第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

（一）無菌技術(shù)

細(xì)菌檢驗(yàn)的操作應(yīng)在無菌室或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行無菌室、生物安全柜使用前后均需進(jìn)行消毒滅菌細(xì)菌檢驗(yàn)使用過的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌處理標(biāo)本的采集嚴(yán)格無菌操作無菌試管、燒瓶的使用時(shí)注意管口滅菌第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

（二）細(xì)菌接種與分離技術(shù)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)滅菌接種環(huán)（針）—冷卻—挑取標(biāo)本（細(xì)菌）—接種—滅菌接種環(huán)（針）平板劃線法

分區(qū)劃線連續(xù)劃線

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)連續(xù)劃線法第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)斜面接種半固體穿刺接種液體接種第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)（三）細(xì)菌培養(yǎng)方法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：培養(yǎng)需氧或兼性厭氧菌培養(yǎng)溫度：35℃～37℃

培養(yǎng)時(shí)間：18～24小時(shí)二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等—培養(yǎng)厭氧菌第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)三、細(xì)菌的生長現(xiàn)象第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)菌落與菌苔血平板上溶血現(xiàn)象第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象第二節(jié)細(xì)菌接種與培養(yǎng)技術(shù)菌膜對照沉淀渾濁沿穿剌線擴(kuò)散生長在穿剌線上生長細(xì)菌在半固體培養(yǎng)基中的現(xiàn)象第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)一、碳水化合物的代謝試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：多糖→單糖→丙酮酸→酸性產(chǎn)物(或產(chǎn)氣)→pH↓→呈酸性變色(或出現(xiàn)氣泡)方法：將待檢細(xì)菌以無菌操作接種到糖發(fā)酵管中，置35℃溫箱培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果。1、糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)一、碳水化合物的代謝試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：根據(jù)細(xì)菌在分解葡萄糖的代謝過程中對氧分子需求的不同，將細(xì)菌分為氧化、發(fā)酵和產(chǎn)堿型三類

2、O/F試驗(yàn)結(jié)果方法：取2支HL葡萄糖培養(yǎng)管煮沸驅(qū)氧，冷卻后接種細(xì)菌。將其中一管敞開，另一管用液體石蠟封管，培養(yǎng)18～

24h觀察結(jié)果第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

3、甲基紅試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解生成大量混合酸，使培養(yǎng)pH下降至4.4以下，加入甲基紅后，呈現(xiàn)紅色反應(yīng)。為甲基紅試驗(yàn)陽性。方法：將待檢菌種接種于葡萄糖蛋白胨水中,35℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后,往培養(yǎng)基中加入甲基紅指示劑少許,觀察結(jié)果。結(jié)果第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

4、V-P試驗(yàn)第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中，乙酰甲基甲醇被氧化為二乙酰，二乙酰與胍基化合物結(jié)合，生成紅色化合物，是為V-P試驗(yàn)陽性。方法：把待檢細(xì)菌接種在葡萄糖蛋白胨水中，35℃培養(yǎng)18~24h后，按每毫升培養(yǎng)液加入0.1ml含2％肌酸或肌酐的40％KOH溶液,數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)后觀察結(jié)果。結(jié)果空白對照陰性陽性第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

5、β-半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG）第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：有的細(xì)菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，能分解鄰硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)而生成黃色的鄰硝基苯酚，該試驗(yàn)也稱為ONPG試驗(yàn)。

方法：將被檢制成菌懸液，加入1滴甲苯充分振搖，37℃水浴5分鐘，使酶釋放，然后再加入0.25mlONPG，混勻后，置于37℃水浴中溫育，菌懸液呈黃色為陽性反應(yīng)。

結(jié)果陰性

陽性第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

6、七葉苷水解試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：某些細(xì)菌能分解七葉苷產(chǎn)生葡萄糖與七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中的Fe2+結(jié)合后，形成黑色的化合物，使培養(yǎng)基變黑。

方法：將待檢細(xì)菌接種到七葉苷培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變黑色者為陽性，培養(yǎng)基不變色為陰性。

結(jié)果+-第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌產(chǎn)生色氨酸酶，分解培養(yǎng)基中色氨酸，生成靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰靛基質(zhì)，是為靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性。方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，35℃培養(yǎng)18～24h，取出后沿試管壁加入靛基質(zhì)試劑數(shù)滴，在兩液面觀察結(jié)果。結(jié)果1、靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌產(chǎn)生酶，分解含硫氨基酸生成硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的亞鐵鹽或鉛鹽結(jié)合生成黑色化合物。方法：將細(xì)菌穿刺接種到醋酸鉛培養(yǎng)基中，35℃、18～24h，觀察結(jié)果。結(jié)果：黑色管為陽性2、硫化氫試驗(yàn)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌產(chǎn)生脲酶，水解尿素生成氨和二氧化碳，培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24h取出觀察。結(jié)果3、尿素酶試驗(yàn)-+第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

二、蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與三氯化鐵作用，形成綠色化合物方法：將待檢菌接種于苯丙氨酸微量培養(yǎng)管中（接種量稍大），培養(yǎng)后在培養(yǎng)基上直接滴加10％氯化鐵試劑，出現(xiàn)綠色反應(yīng)者為陽性。

結(jié)果4、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)-+第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

三、碳源利用試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：有的細(xì)菌能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鹽作為唯一的碳源，細(xì)菌在生長過程中分解枸櫞酸鹽產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基呈堿性反應(yīng)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后觀察結(jié)果。培養(yǎng)基由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽性，培養(yǎng)基中無菌生長、仍為綠色者為陰性。結(jié)果枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)+-第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：某些細(xì)菌具有氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶），能將二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺氧化生成紅色的醌類化合物。

方法：取潔凈濾紙條，粘取被檢細(xì)菌菌落，滴加氧化酶試劑1滴于菌落上。或?qū)⒃噭┲苯拥渭釉诒粰z細(xì)菌的菌落上。陽性者立即出現(xiàn)紅色，繼而變?yōu)樯罴t色至深紫色。

結(jié)果1、氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）試驗(yàn)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的觸酶（過氧化氫酶）能催化過氧化氫放出初生態(tài)氧，繼而形成氧分子出現(xiàn)氣泡。

方法：

取待檢細(xì)菌少許，置于潔凈的載玻片上，滴加3％H2O2試劑1～2滴，觀察結(jié)果。一分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

結(jié)果2、觸酶試驗(yàn)+-第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。

方法：于3支試管中分別加入1:4稀釋的血漿0.5ml，1支管加入待檢菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml,另兩支分別加陰陽性對照菌肉湯培養(yǎng)物0.5ml，35℃培養(yǎng)3～4h后觀察結(jié)果。結(jié)果3、凝固酶試驗(yàn)（試管法）

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白。

方法：取未稀釋的兔血漿和生理鹽水各一滴分別置于載玻片的兩側(cè)，挑取金黃色葡萄球菌少許分別與它們混合，立即觀察結(jié)果。細(xì)菌在生理鹽水中無自凝，菌液呈均勻混濁狀態(tài)凝固酶試驗(yàn)為陰性；菌液聚集成團(tuán)塊或顆粒狀，則血漿凝固酶試驗(yàn)為陽性。

結(jié)果4、凝固酶試驗(yàn)（玻片法）

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：某些細(xì)菌能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮磺酸，再與α-萘胺結(jié)合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸(紅色化合物)。

方法：將被檢細(xì)菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，加入甲液（對氨基苯磺酸0.8g、5mol／L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g、5mol／L、醋酸100ml）等量混合液，觀察結(jié)果。立即出現(xiàn)紅色者為陽性。若加入試劑不出現(xiàn)紅色，需要檢查硝酸鹽是否被還原，可于培養(yǎng)管內(nèi)加入少許鋅粉，如無色，說明亞硝酸鹽進(jìn)一步分解，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性。若加鋅粉后出現(xiàn)紅色，說明鋅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而待檢細(xì)菌無還原硝酸鹽的能力，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性。5、硝酸鹽還原試驗(yàn)

第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

紅色為陽性無色為陰性

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)5、硝酸鹽還原試驗(yàn)

-+無色+鋅粉→無色：陽性無色+鋅粉→紅色：陰性+-結(jié)果第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

四、酶類試驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)金黃色葡萄球菌β溶血素活性。其他鏈球菌不產(chǎn)生CAMP因子。方法：用產(chǎn)生β-溶血素的金黃色葡萄球菌在血平板上劃種一條直線，將待檢菌距金黃色葡萄球菌3mm處垂直劃種一短線。用同樣方法接種陰性和陽性對照菌株。35℃孵育18～24h。結(jié)果6、CAMP試驗(yàn)對照陰性陽性檢測菌陽性陽性矢狀溶血第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

五、復(fù)合生化反應(yīng)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)

原理：KIA瓊脂中含有牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、乳糖、葡萄糖、枸櫞酸銨鐵、酚紅指示劑等。乳糖的濃度為葡萄糖的10倍，若細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，培養(yǎng)基中的葡萄糖被分解后只能產(chǎn)生少量的酸，在最初培養(yǎng)的8～11小時(shí)內(nèi)，這些酸也足以使培養(yǎng)基的底層和斜面變黃色。但連續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，在細(xì)菌和氧的作用下，培養(yǎng)基的斜面所含氨基酸發(fā)生降解，釋放氨類，立即中和斜面部分的酸，培養(yǎng)18～24小時(shí)后，整個(gè)斜面轉(zhuǎn)變成堿性，斜面又變成紅色。培養(yǎng)基深層中，氨基酸的降解作用不足以中和所形成的酸，故仍呈黃色。因此KIA斜面呈堿性，深層呈酸性反應(yīng)，說明該菌只分解葡萄糖而不分解乳糖。若細(xì)菌分解乳糖則產(chǎn)生大量的酸，這些酸能中和斜面產(chǎn)生的堿，使整個(gè)培養(yǎng)基呈黃色。若細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸，則可產(chǎn)生H2S，H2S與培養(yǎng)基中枸櫞酸銨鐵起反應(yīng)，產(chǎn)生不溶性的黑色硫化亞鐵沉淀。

KIA試驗(yàn)第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

六、復(fù)合生化反應(yīng)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)

方法：用接種針挑取待檢細(xì)菌，先穿刺接種到KIA深層，距管底3～5mm為宜，再從深層向上提起，在斜面上由下至上劃線，35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，觀察結(jié)果

KIA試驗(yàn)

常見的反應(yīng)結(jié)果：①斜面堿性/底層堿性：不發(fā)酵糖類，如糞產(chǎn)堿桿菌。②斜面堿性/底層酸性：葡萄糖發(fā)酵，乳糖不發(fā)酵，如志賀菌。③斜面堿性/底層酸性（黑色）：葡萄糖發(fā)酵、乳糖不發(fā)酵，產(chǎn)生H2S。如沙門菌、普通變形桿菌。④斜面酸性/底層酸性：葡萄糖和乳糖發(fā)酵，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬。第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)

六、復(fù)合生化反應(yīng)

第三節(jié)細(xì)菌生化鑒定技術(shù)

KIA試驗(yàn)結(jié)果第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化一、微生物自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)（一）自動(dòng)血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)基本原理（1）放射性物質(zhì)標(biāo)記法一般采用放射性碳14標(biāo)記法：細(xì)菌生長時(shí)利用標(biāo)記底物產(chǎn)生含14C的CO2，當(dāng)14C標(biāo)記的CO2量超過界限時(shí)，檢測器報(bào)告陽性生長。（2）二氧化碳感受器每一血液培養(yǎng)瓶底部都含有Novel顏色感應(yīng)器，當(dāng)血液培養(yǎng)瓶內(nèi)有微生物生長釋出之CO2后，感應(yīng)器之酸堿值也跟著改變，從深綠色變?yōu)辄S色，檢測器報(bào)告陽性。（3）均質(zhì)熒光技術(shù)在血培養(yǎng)基內(nèi)含有發(fā)熒光物質(zhì)。微生物生長代謝過程中產(chǎn)生各種帶電荷的原子團(tuán)，培養(yǎng)瓶發(fā)出的熒光，即可檢測有細(xì)菌存在。第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)2．儀器的基本結(jié)構(gòu)和配套試劑

全自動(dòng)恒溫孵育系統(tǒng)包括恒溫裝置和震蕩培養(yǎng)裝置，儀器培養(yǎng)瓶容量常分為60瓶、120瓶、240瓶等，對培養(yǎng)瓶進(jìn)行震蕩恒溫培養(yǎng)，溫度常設(shè)為37℃。儀器均配置電腦，在電腦上可設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間、溫度等參數(shù)，顯示陽性或陰性瓶所在的位置，及自動(dòng)分析。3．注意事項(xiàng)及結(jié)果報(bào)告制度（1）培養(yǎng)瓶的選擇如果患者未使用抗生素，可選擇一般需氧菌培養(yǎng)瓶，如果已經(jīng)使用抗生素則選用可中和血液中抗生素的培養(yǎng)瓶。如懷疑厭氧菌、L型菌、真菌、分枝桿感染，則選用厭氧菌培養(yǎng)瓶、L型菌培養(yǎng)瓶、真菌培養(yǎng)瓶、分枝桿菌培養(yǎng)瓶。（2）采血時(shí)間對入院患者中有高熱、寒戰(zhàn)、白細(xì)胞增多或疑有感染者，最好在使用抗生素前采血送檢。住院患者出現(xiàn)發(fā)熱等敗血癥癥狀時(shí)，應(yīng)及時(shí)采血，盡可能在使用抗生素前采血。已使用抗生素的患者最好在下次使用抗生素前采血。第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化（3）采血量采血量一般為血培養(yǎng)瓶中肉湯培養(yǎng)基量的1/4-1/5為宜，成人一般每次采集3-10ml，以8-10ml最佳，小兒一般每次采集1-3ml即可。每天最好采血2-3次，以提高檢出率，并幫助判斷是感染菌或污染菌。（4）采血方法一般多從肘靜脈采血，采集前應(yīng)嚴(yán)格消毒采血部位，采血過程中注意無菌操作，否則易被皮膚表面細(xì)菌污染，導(dǎo)致假陽性。使用真空采血系統(tǒng)，利用配套的一次性使用的無菌采血管，血液因負(fù)壓作用進(jìn)入培養(yǎng)瓶中。（5）標(biāo)本送檢采血后應(yīng)及時(shí)送檢，檢驗(yàn)者收到血培養(yǎng)瓶后應(yīng)盡快上機(jī)。如不能及時(shí)送檢，應(yīng)將血培養(yǎng)瓶放置室溫保存。第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化（二）自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)

多數(shù)自動(dòng)血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)可檢測血液中的分枝桿菌，目前針對分枝桿菌有專門的自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，可對各類標(biāo)本中的分枝桿菌進(jìn)行培養(yǎng)及檢測，原理基本同自動(dòng)血培養(yǎng)檢測系統(tǒng)，配套專門的培養(yǎng)瓶。一般將各類標(biāo)本直接送檢，檢驗(yàn)者收到標(biāo)本后，如為清亮的穿刺液標(biāo)本，可直接注入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入儀器自動(dòng)培養(yǎng)并檢測。如為痰液等其他含有雜菌或細(xì)胞的標(biāo)本，應(yīng)先進(jìn)行消化、中和等處理后再注入培養(yǎng)瓶，否則會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化二、微生物鑒定的自動(dòng)化和微型化（一）微生物數(shù)碼分類原理1．?dāng)?shù)據(jù)庫由許多細(xì)菌條目組成，每個(gè)條目代表一個(gè)細(xì)菌種或一個(gè)細(xì)菌生物型。2．編碼將細(xì)菌生化反應(yīng)模式轉(zhuǎn)換成數(shù)學(xué)模式，可把生化反應(yīng)結(jié)果快速轉(zhuǎn)錄成數(shù)字（編碼），經(jīng)查閱編碼檢索本或電腦分析系統(tǒng)又可將數(shù)字轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的細(xì)菌名稱。3．查碼在編碼檢索本內(nèi)尋找數(shù)碼信息：如菌名，鑒定結(jié)果的評價(jià)，生化結(jié)果，陽性百分率，必須增加的補(bǔ)充試驗(yàn)項(xiàng)目，指出注意要點(diǎn)等。第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)4．解釋

如果一個(gè)編碼只對應(yīng)一種細(xì)菌，無論幾率大小，為該種細(xì)菌的可能性(ID%)均為99.99%。如果一個(gè)編碼對應(yīng)兩種或兩種以上種類的細(xì)菌，應(yīng)計(jì)算每種細(xì)菌出現(xiàn)的幾率所占的百分比ID%。如ID%≥99%，為該種菌的可能性非常大；如ID%≥90%，為該種菌的可能性較大；如ID%≥80%，為該種菌的可能性也較大，但需做補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)一步確證；如ID%<80%，則一般無法準(zhǔn)確區(qū)分菌種，必須增加多個(gè)補(bǔ)充試驗(yàn)才可得出準(zhǔn)確結(jié)果。第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化第五章細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)第四節(jié)微生物檢驗(yàn)的自動(dòng)化和微型化（二）微生物自動(dòng)鑒定儀器的基本結(jié)構(gòu)和配套試劑數(shù)碼分類鑒定系統(tǒng)的組成由鑒定卡、添加試劑及檢索工具配套形成的完整的微生物鑒定體系。（1）鑒定卡常用的生化反應(yīng)有：①發(fā)酵試驗(yàn)；②同化試驗(yàn)；③同化或發(fā)酵抑制試驗(yàn)；④酶試驗(yàn)；⑤其他傳統(tǒng)的生化反應(yīng)。（2）添加試劑：有些試驗(yàn)經(jīng)孵育后需添加試劑才能呈現(xiàn)顏色變化。添加的試劑有配套試劑盒或單種試劑。（3）檢索工具：檢索工具可由電