酶的生物合成

生物體內(nèi)酶合成的過(guò)程稱為酶的生物合成。利用微生物代謝活動(dòng)生產(chǎn)所需酶的過(guò)程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。第2頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用：(1)微生物生長(zhǎng)繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來(lái)生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場(chǎng)需求。(2)微生物種類繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且在不同的環(huán)境下生存的微生物都有其完全不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。(3)這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。(4)特別是當(dāng)基因工程介入時(shí)，動(dòng)植物細(xì)胞中存在的酶，幾乎都能夠利用微生物細(xì)胞獲得。

因此，有計(jì)劃和仔細(xì)地篩選微生物菌種，通常可以獲得能夠生產(chǎn)幾乎任何一種酶的適當(dāng)細(xì)胞。第3頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)酶發(fā)酵生產(chǎn)用微生物菌種微生物菌種是發(fā)酵生產(chǎn)酶的首要條件。目前投入工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)酶的菌種包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等。第4頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第5頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、酶發(fā)酵生產(chǎn)用菌種的要求產(chǎn)酶量高，具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值；易培養(yǎng)，即能適應(yīng)大生產(chǎn)粗放的營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，包括廉價(jià)原料，對(duì)工藝條件要求不苛刻；代謝速率高，發(fā)酵周期短；產(chǎn)酶穩(wěn)定性好，菌種的生產(chǎn)性能不易退化，不易感染噬菌體；安全可靠，要求菌種不是致病菌，其代謝安全無(wú)毒，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上最好與病原體無(wú)關(guān)；選用產(chǎn)胞外酶的菌種，有利于酶的分離提取。第6頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、微生物產(chǎn)酶菌株的獲得從土壤以及發(fā)酵生產(chǎn)材料中分離；菌種保存中心。第7頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、含菌樣品的采集

采樣的目的、采樣地點(diǎn)、采樣方法及采樣的數(shù)量。若預(yù)先不了解某種產(chǎn)酶微生物的具體來(lái)源，一般可從土壤分離。產(chǎn)纖維素產(chǎn)脂肪酶產(chǎn)果膠酶產(chǎn)糖化酶第8頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、菌種的分離純化劃線分離法稀釋分離法第9頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.菌種的初篩第10頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.菌種的復(fù)篩5.產(chǎn)酶最佳條件的確定第11頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高經(jīng)誘變獲得高產(chǎn)菌種突變體利用代謝工程和代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來(lái)提高微生物的酶產(chǎn)量。運(yùn)用遺傳工程、基因工程的手段將原有菌株中的目的基因轉(zhuǎn)移到另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境適應(yīng)性更強(qiáng)的微生物細(xì)胞內(nèi)，使其高效表達(dá)。第12頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天7.微生物產(chǎn)酶菌種的保藏斜面保藏沙土管保藏冷凍保藏第13頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)發(fā)酵工藝條件及控制一、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。在設(shè)計(jì)和配制培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)特別注意各種組分的種類和含量，以滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的需要，并要調(diào)節(jié)至適宜的pH。還必須注意到，有些細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖階段和發(fā)酵階段所要求的培養(yǎng)基有所不同，在此情況下，要根據(jù)需要配制不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。第14頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天1．碳源碳源是指能夠向細(xì)胞提供碳素化合物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。通常碳源同時(shí)也是提供能量的能源。碳是構(gòu)成細(xì)胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發(fā)酵生產(chǎn)乃至其他產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)的必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前，在酶發(fā)酵生產(chǎn)中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。第15頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用情況大不相同，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇適宜的碳源。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，除了要從營(yíng)養(yǎng)的角度考慮碳源的選擇以外，還要考慮到碳源對(duì)酶生物合成的調(diào)節(jié)作用，主要要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用以及是否存在分解代謝物作用。在選擇碳源時(shí)應(yīng)盡量選用對(duì)所需的酶有誘導(dǎo)作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)選用對(duì)該酶有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶的生物合成有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。β-半乳糖苷酶發(fā)酵應(yīng)選用乳糖為碳源，而不用或少用葡萄糖為碳源等等。在選擇碳源時(shí)，必需考慮原料的供求和價(jià)格問(wèn)題。第16頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2．氮源氮是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡能夠向細(xì)胞提供氮源素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)稱為氮源。氮源可分為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種。有機(jī)氮源主要是各種蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物。如：酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。無(wú)機(jī)氮源是含氮的各種無(wú)機(jī)化合物，如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等各種銨鹽和硝酸鹽等。第17頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般說(shuō)來(lái)，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無(wú)機(jī)氮，微生物細(xì)胞中，異養(yǎng)型微生物用有機(jī)氮，自養(yǎng)型微生物用無(wú)機(jī)氮。碳和氮兩者的比例對(duì)酶的產(chǎn)量有顯著的影響。所謂碳氮比（C/N）一般是指培養(yǎng)基中碳元素（C）的總量與氮元素（N）總量之比。可通過(guò)測(cè)定或計(jì)算培養(yǎng)基中碳和氮的含量而求出。有的氮源及其濃度如氨基酸的變化對(duì)酶發(fā)酵有代謝調(diào)節(jié)作用。第18頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽的主要作用是提供細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的無(wú)機(jī)元素，并對(duì)培養(yǎng)基的PH、氧化還原電位和滲透壓起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)細(xì)胞對(duì)無(wú)機(jī)元素需要量的大小，可分為主要元素（大量元素）和微量元素兩大類。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細(xì)胞生命活動(dòng)不可缺少的，但需要量很少，過(guò)量反而會(huì)引起不良效果，必須嚴(yán)加控制。

第19頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天各種無(wú)機(jī)元素的功用各不相同，有些是細(xì)胞的主要組分，如：磷、硫等；有些是酶的組分，如：磷、硫、鋅、鈣等；有些是酶的激活劑或抑制劑，如：鉀、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鈣、鉬、鈷、氯、溴、碘等；有些則是對(duì)pH、滲透壓、氧化還原電位起調(diào)節(jié)作用的，如：鈉、鉀、鈣、氯、磷等。其中磷是特別重要的元素，它是構(gòu)成核酸和磷脂的成分。微量元素有的是某些酶的組成成分，有的是酶的激活劑，也有的是輔酶的必需成分。第20頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．生長(zhǎng)因子生長(zhǎng)因素是指細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所必不可缺的微量有機(jī)化合物主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，以及動(dòng)植物生長(zhǎng)激素等。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，通常在培養(yǎng)基中加進(jìn)玉米漿、酵母膏等天然原料。其中玉米漿最常用。第21頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、產(chǎn)酶促進(jìn)劑

在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。誘導(dǎo)物表面活性劑

表面活性劑能夠增加細(xì)胞透性，其處在氣-液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性，另外還可消泡提高氧傳遞系數(shù)。第22頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、發(fā)酵條件的控制及對(duì)產(chǎn)酶的影響1、溫度枯草桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為34～37℃黑曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為28～32℃通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高10℃，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。第23頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度有所不同，而且往往低于生長(zhǎng)最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)量。有些酶的發(fā)酵生產(chǎn)，要在不同階段控制不同的溫度條件。在生長(zhǎng)繁殖階段控制在細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度范圍內(nèi)，以利于細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，而在產(chǎn)酶階段，則需控制在產(chǎn)酶的最適溫度。第24頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程中，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會(huì)使培養(yǎng)基的溫度升高，同時(shí)，熱量不斷擴(kuò)散和散失，又會(huì)使培養(yǎng)基溫度降低，兩者綜合，決定了培養(yǎng)基的溫度。由于在發(fā)酵的不同階段，細(xì)胞新陳代謝放出的熱量差別很大，擴(kuò)散和散失的熱量受到環(huán)境溫度等因素的影響，使培養(yǎng)基的溫度變化明顯。為此必須經(jīng)常及時(shí)地進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，使培養(yǎng)基的溫度經(jīng)常維持在適宜的范圍內(nèi)。溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發(fā)酵罐中，均設(shè)計(jì)有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第25頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、pH值pH影響微生物體內(nèi)各種酶的活性，從而導(dǎo)致微生物的代謝途徑發(fā)生改變。影響微生物形態(tài)和細(xì)胞膜的透性，從而影響微生物對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。影響培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用。第26頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天不同細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的最適pH有所不同。一般細(xì)胞和放線菌的生長(zhǎng)最適pH為中性或微堿性（pH6.5～8.0）；霉菌和酵母的生長(zhǎng)最適pH為偏酸性（PH4.0～6.0）；植物細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH為5～6。有些細(xì)胞可以同時(shí)產(chǎn)生多種酶，通過(guò)控制培養(yǎng)基的PH，往往可以改變各種酶之間的產(chǎn)量比例。例如：黑曲霉可生產(chǎn)α—淀粉酶，又可生產(chǎn)糖化酶。當(dāng)培養(yǎng)基的PH偏向中性時(shí)，可使α—淀粉酶產(chǎn)量增加而糖化酶減少，反之，當(dāng)培養(yǎng)基的PH偏向酸性時(shí)，則糖化酶產(chǎn)量提高而α—淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生產(chǎn)蛋白酶，當(dāng)培養(yǎng)基的PH為堿性時(shí)，主要生產(chǎn)堿性蛋白酶，降低培養(yǎng)基的PH，則主要生產(chǎn)中性或酸性蛋白酶。第27頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)基的pH在細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖和代謝物產(chǎn)生的過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生變化。這種變化與細(xì)胞特性有關(guān)，也與培養(yǎng)基的組分密切相關(guān)。含糖量高的培養(yǎng)基，由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，會(huì)使培養(yǎng)基的pH向酸性方向移動(dòng)；含蛋白質(zhì)、氨基酸較多的培養(yǎng)基，經(jīng)代謝產(chǎn)生較多的胺類物質(zhì)，使pH向堿性方向移動(dòng)；以硫酸銨為氮源時(shí)，隨著銨離子被細(xì)胞利用，使培養(yǎng)基pH下降；以尿素為氮源時(shí)，先隨著尿素被脲酶水解生成氨，使培養(yǎng)基pH上升，然后又隨著氨被細(xì)胞同化而使PH下降；磷酸鹽的存在，對(duì)培養(yǎng)基的pH起一定的緩沖作用。所以在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過(guò)程中，必須對(duì)培養(yǎng)基的pH進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂坪驼{(diào)節(jié)。PH的調(diào)節(jié)可以通過(guò)改變培養(yǎng)基的組分或其比例來(lái)實(shí)現(xiàn)。必要時(shí)可使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調(diào)節(jié)控制培養(yǎng)基中pH變化。第28頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天生產(chǎn)上對(duì)pH的控制和調(diào)節(jié)的方法：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值，控制合適的C/N，調(diào)整生理酸性物質(zhì)與生理堿性物質(zhì)之間的比例。補(bǔ)料調(diào)節(jié)，即通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中流加碳源、氮源來(lái)調(diào)節(jié)pH值添加緩沖液，維持一定的pH值如pH值變化較大，可直接加酸或堿進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過(guò)對(duì)溶解氧的調(diào)節(jié)，來(lái)控制中間代謝產(chǎn)物的氧化程度。第29頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、溶解氧的控制培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。一般說(shuō)來(lái)，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時(shí)間越長(zhǎng)、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對(duì)于溶氧速率有明顯影響。調(diào)節(jié)通氣量調(diào)節(jié)氧的分壓調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間調(diào)節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質(zhì)

控制溶解氧方法第30頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制固定化細(xì)胞又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指用各種方法固定在載體上又能進(jìn)行生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。1、固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞制備好以后，一般要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以使固定在載體上的細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。待長(zhǎng)好后，才用于發(fā)酵產(chǎn)酶。為了使固定化細(xì)胞生長(zhǎng)良好，預(yù)培養(yǎng)應(yīng)采用利于生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基和工藝條件。然后改換成有利于產(chǎn)酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵工藝條件。有時(shí)也可采用相同的培養(yǎng)基和工藝條件進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵。第31頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、溶解氧的供給固定化細(xì)胞在進(jìn)行培養(yǎng)和發(fā)酵過(guò)程中，由于受到載體的影響，氧的溶解和傳遞受到一定的阻礙作用。特別是采用包埋法制備的固定化細(xì)胞，氧要通過(guò)凝膠層擴(kuò)散到凝膠粒內(nèi)部，才能供細(xì)胞應(yīng)用，使氧的供給成為主要的限制性因素。為此，必須增加溶解氧的量，才能滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的需要。由于固定化細(xì)胞反映器均不能采用強(qiáng)烈的攪拌，以免破壞固定化細(xì)胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通氣量。例如，游離的枯草桿菌細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶，通氣量一般控制在0.5∽1m3/(m3.min),而采用固定化細(xì)胞發(fā)酵，其通氣量要1∽2m3/(m3.min),或者更多。第32頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天

此外，可通過(guò)改變固定化載體，固定化技術(shù)或改變培養(yǎng)基組分等方法，以改善供氧。例如，瓊脂對(duì)氧的擴(kuò)散不利，應(yīng)盡量少用作固定化載體；在凝膠中加進(jìn)某些物質(zhì)，使其有利于氧的傳遞；采用過(guò)氧化氫酶與細(xì)胞共固定化，再在培養(yǎng)液中添加適量的過(guò)氧化氫，通過(guò)酶的作用，產(chǎn)生氧氣，共細(xì)胞使用；降低培養(yǎng)基的濃度，盡量降低培養(yǎng)基的粘度等。溶解氧的供給，是固定化細(xì)胞好氣性發(fā)酵的關(guān)鍵限制性因素之一。有待進(jìn)一步研究解決。第33頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.溫度的控制

固定化細(xì)胞對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，在分批發(fā)酵和半連續(xù)發(fā)酵中，溫度不難控制。但在連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，由于稀釋率較高，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較大。若只是在反應(yīng)器內(nèi)調(diào)節(jié)溫度，則在流加的培養(yǎng)液溫度差別較大時(shí)，難以達(dá)到要求。一般在培養(yǎng)液進(jìn)入反應(yīng)器之前，必須預(yù)先調(diào)節(jié)到適宜溫度。第34頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．培養(yǎng)基成分的控制培養(yǎng)基的濃度不宜過(guò)高，并可以通過(guò)改變培養(yǎng)基組分來(lái)降低培養(yǎng)基的黏度，有利于氧的溶解和擴(kuò)散，從而克服固定化細(xì)胞好氧發(fā)酵過(guò)程中氧溶解和傳遞的限制。培養(yǎng)基的組分不能影響固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性，或影響很小。第35頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制1、培養(yǎng)基滲透壓的控制2、控制培養(yǎng)基組分、防止細(xì)胞壁再生3、維持較高的原生質(zhì)體濃度第36頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)提高酶產(chǎn)量的方法一、酶生物合成的調(diào)控機(jī)制Reversetranscription第37頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天操縱子（operon）：是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位。第38頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)基因調(diào)節(jié)控制理論，在DNA分子中，與酶生物合成有密切關(guān)系的基因有4種。它們是調(diào)節(jié)基因(Regulatorgene)、啟動(dòng)基因(Promotergene)、操縱基因(Operatorgene)和結(jié)構(gòu)基因(Struturalgene)。第39頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天結(jié)構(gòu)基因是編碼蛋白的基因，它與多肽鏈有對(duì)應(yīng)關(guān)系。操縱基因在操縱子中起“開(kāi)關(guān)”作用，它可以與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的別構(gòu)蛋白（阻遏蛋白）中的一種結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而操縱酶生物合成的時(shí)機(jī)和合成速度。啟動(dòng)基因有兩個(gè)位點(diǎn)組成，一個(gè)是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，另一個(gè)是環(huán)腺苷酸（cAMP）與環(huán)腺苷酸接受蛋白（CRP）的復(fù)合物（cAMP-CRP）的結(jié)合位點(diǎn)。只有在cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動(dòng)基因的位點(diǎn)上時(shí)，RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動(dòng)基因的位點(diǎn)上，這樣，酶的合成才有可能開(kāi)始，否則酶就無(wú)法開(kāi)始合成。調(diào)節(jié)基因編碼調(diào)節(jié)蛋白。第40頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天操縱子的類型誘導(dǎo)型操縱子（inducibleoperon)：在無(wú)誘導(dǎo)物的情況下，其基因不表達(dá)或表達(dá)的水平很低，只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成mRNA，進(jìn)而經(jīng)翻譯合成酶。乳糖操縱子阻遏型操縱子（repressibleoperon）：在無(wú)阻遏物情況下，基因正常表達(dá)，當(dāng)有阻遏物存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄則受阻遏，酶不能合成。色氨酸操縱子此外，啟動(dòng)基因位點(diǎn)上的cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合與否，也對(duì)酶的生物合成起調(diào)節(jié)作用。第41頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因?qū)γ干锖铣傻恼{(diào)節(jié)控制有3種模式分解代謝物阻遏作用酶合成的誘導(dǎo)作用酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔?。?2頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、酶生物合成的誘導(dǎo)作用加進(jìn)某種物質(zhì),使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的過(guò)程,稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用。簡(jiǎn)稱為誘導(dǎo)作用。起誘導(dǎo)作用的物質(zhì)，稱為誘導(dǎo)劑。第43頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶生物合成的誘導(dǎo)作用（A）-無(wú)誘導(dǎo)物時(shí)（B）-添加誘導(dǎo)物時(shí)第44頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、酶生物合成的反饋?zhàn)瓒糇饔?.大腸桿菌生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在；

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現(xiàn)了菌生長(zhǎng)的經(jīng)濟(jì)原則：不需要就不合成。第45頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天某些代謝物可以阻止某些酶的合成，是通過(guò)阻止為該酶編碼的基因的表達(dá)而進(jìn)行的，這種現(xiàn)象叫做酶合成的阻遏。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。第46頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp代謝產(chǎn)物與阻遏蛋白結(jié)合，使之構(gòu)象發(fā)生變化與操縱基因結(jié)合，結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)色氨酸操縱子（酶的阻遏）

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)第47頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、分解代謝阻遏某些物質(zhì)（主要是葡萄糖和其他容易利用的碳源等）分解代謝的產(chǎn)物阻遏某些酶（特別是參與分解代謝的酶）生物合成的現(xiàn)象稱為分解代謝阻遏作用，也稱為葡萄糖效應(yīng)。分解代謝阻遏作用之所以產(chǎn)生，一是由于葡萄糖的分解代謝引起ATP濃度的上升，消耗胞內(nèi)的環(huán)腺苷酸（cAMP）;二是當(dāng)葡萄糖等作為唯一碳源時(shí)，葡萄糖的降解物對(duì)腺苷酸環(huán)化酶活性有抑制作用，降低cAMP的生成。第48頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制(降解物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動(dòng)子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復(fù)合物mRNA當(dāng)葡萄糖作唯一碳源時(shí)，葡萄糖的降解物對(duì)腺苷酸環(huán)化酶有抑制作用，則cAMP的濃度降低，CAP-cAMP復(fù)合物減少，不能與啟動(dòng)子結(jié)合，故轉(zhuǎn)錄不得進(jìn)行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過(guò)酶-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶酶過(guò)去稱葡萄糖效應(yīng)本節(jié)目錄第49頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天++++轉(zhuǎn)錄無(wú)葡萄糖，cAMP濃度高時(shí)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄有葡萄糖，cAMP濃度低時(shí)不促進(jìn)轉(zhuǎn)錄ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正調(diào)控第50頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天乳糖操縱子的啟動(dòng)基因內(nèi)，除RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外，還有一個(gè)稱為cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)。cAMP是環(huán)腺苷酸，CAP是降解物基因活化蛋白（又稱cAMP受體蛋白，CRP）當(dāng)CAP與cAMP結(jié)合后，就會(huì)被活化。cAMP-CAP復(fù)合物又會(huì)激活啟動(dòng)基因，使RNA聚合酶與啟動(dòng)基因結(jié)合。乳糖和葡萄糖同時(shí)存在時(shí)，因?yàn)榉纸馄咸烟堑拿割悓儆诮M成酶，能迅速地將葡萄糖降解成某種中間產(chǎn)物，既會(huì)阻止ATP環(huán)化形成cAMP，同時(shí)，又會(huì)促進(jìn)cAMP分解AMP，從而降低cAMP的濃度，繼而阻遏了乳糖降解有關(guān)的誘導(dǎo)酶合成。第51頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、打破酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制限制及提高酶產(chǎn)量的方法1、通過(guò)條件控制提高酶產(chǎn)量（1）添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物包括：酶的作用底物一些難以代謝的底物類似物酶催化的產(chǎn)物誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)同一種酶有多種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和阻遏之間沒(méi)有絕對(duì)的界限，其關(guān)鍵在于濃度第52頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）降低阻遏物的濃度產(chǎn)物阻遏作用：由酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝阻遏作用：有葡萄糖和其他容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過(guò)分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)引起的阻遏作用。第53頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天為了減少或者解除分解代謝阻遏作用，應(yīng)當(dāng)控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源濃度。常采取的措施如下：盡量不用葡萄糖等容易被利用的碳源，而采用其他較難利用的碳源。采取補(bǔ)料流加以及分次流加碳源的方法，將碳源的濃度控制在較低的水平。添加一定的cAMP第54頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)于受產(chǎn)物阻遏作用的酶（酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔茫?，可以通過(guò)以下措施降低尾產(chǎn)物積累，解除阻遏，從而提高酶合成的產(chǎn)量。在培養(yǎng)基中添加尾產(chǎn)物類似物，避免尾產(chǎn)物大量生成。采用尾產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵生產(chǎn)酶。通過(guò)外加該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，人為控制其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處于亞適量狀態(tài)，避免它對(duì)酶合成造成阻遏。直接去尾產(chǎn)物法。在培養(yǎng)基中添加阻止尾產(chǎn)物形成的抑制劑，以減少阻遏物的積累。第55頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、通過(guò)基因突變和基因重組提高酶產(chǎn)量通過(guò)基因工程提高酶產(chǎn)量的途徑：使誘導(dǎo)型菌株變成組成型菌株使阻遏型菌株變?yōu)槿プ瓒粜途辏棺瓒粜途辏?。通過(guò)基因工程的手段增加細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)。第56頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天誘變的方法：物理化學(xué)物理和化學(xué)的結(jié)合第57頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌株篩檢（1）組成型突變株篩選將誘變后的產(chǎn)酶菌株在低誘導(dǎo)力的誘導(dǎo)物為主要碳源或氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并同時(shí)限制誘導(dǎo)物濃度在一定水平，或同時(shí)加入誘導(dǎo)抑制劑，在此條件下增值的為組成型突變株。另外，將誘變后的產(chǎn)酶菌株在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)，重復(fù)交替培養(yǎng)可獲得突變株。第58頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）抗分解代謝產(chǎn)物阻遏型突變株篩檢以被阻遏物的酶的底物為唯一氮源，如產(chǎn)氣氣桿菌誘變后在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，連續(xù)轉(zhuǎn)移多代，便得到產(chǎn)組氨酸酶的抗葡萄糖效應(yīng)的變異株。變異后的產(chǎn)酶菌在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。（3）抗尾產(chǎn)物阻遏變異株篩檢可在誘變后的菌株培養(yǎng)基上加入結(jié)構(gòu)上與尾產(chǎn)物類似的毒性抗代謝劑。第59頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、其他提高酶產(chǎn)量的方法（1）添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過(guò)性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性劑（如‘新潔而滅’等）是消毒劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。第60頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1～20倍；添加聚乙烯醇（Polyvinylalcohol）可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒(méi)有規(guī)律可循，要通過(guò)試驗(yàn)確定所添加的產(chǎn)酶促進(jìn)劑的種類和濃度。第61頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)一、酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長(zhǎng)，其生長(zhǎng)過(guò)程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長(zhǎng)期、平衡期和衰退期等4個(gè)階段第62頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第63頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天通過(guò)分析比較細(xì)胞生長(zhǎng)與酶產(chǎn)生的關(guān)系,可以把酶生物合成的模式分為4種類型：同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型第64頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、同步合成型

同步合成型：酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長(zhǎng)速度緊密聯(lián)系，又稱為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶，其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始；在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長(zhǎng)期時(shí)，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶的合成隨著停止。第65頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度第66頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒(méi)食子酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在單寧或沒(méi)食子酸的誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶。同步合成酶生物合成調(diào)節(jié)的特點(diǎn)：酶的生物合成可以誘導(dǎo)，但是不受分解代謝物的阻遏作用和產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔?。該類型酶?duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定，其壽命一般只有幾十分鐘，在細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)平衡期后，新的ｍRNA不再生成,在原有的mRNA很快被降解后，酶的生物合成隨即停止。第67頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、延續(xù)合成型酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開(kāi)始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。屬于該類型的酶可以是組成酶，也可以是誘導(dǎo)酶。例如：在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶的生物合成。

第68頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖的果膠為誘導(dǎo)物第69頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天該類酶在細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到平衡期以后，新的mRNA不再生成，但仍可以延續(xù)合成，說(shuō)明這些酶所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在平衡器以后相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)仍然可以通過(guò)翻譯合成其所對(duì)應(yīng)的酶。當(dāng)延續(xù)合成型酶的生物合成可以受到分解代謝物阻遏時(shí)，在培養(yǎng)基中若沒(méi)有阻遏物，則呈現(xiàn)延續(xù)合成型，而在培養(yǎng)基中存在阻遏物時(shí)，便成為滯后合成型。第70頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、中期合成型

中期合成型是同步合成類型中的一種特殊形式。合成特點(diǎn)：該類型的酶在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開(kāi)始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨著停止。代謝調(diào)節(jié)特點(diǎn)：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒糇饔没蚍纸獯x物阻遏作用。第71頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天

枯草桿菌堿性磷酸酶的生物合成模式屬于中期合成型。這是由于該酶的合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)機(jī)磷酸的反饋?zhàn)瓒?，而磷又是?xì)胞生長(zhǎng)所必不可缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷的存在。這樣，在細(xì)胞生長(zhǎng)的開(kāi)始階段,培養(yǎng)基中的磷阻遏堿性磷酸酶的合成，只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間，培養(yǎng)基中的磷幾乎被細(xì)胞用完（低于0.01mmol/L）以后，該酶才開(kāi)始大量生成。又由于堿性磷酸酶所對(duì)應(yīng)的mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30min左右，所以當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的生物合成隨著停止。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第72頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、滯后合成型

此類型酶是在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間或者進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始其生物合成并大量積累。又稱為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。屬于滯后合成型的酶，之所以要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至進(jìn)入平衡期以后才開(kāi)始合成，主要原因是由于受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開(kāi)始大量合成。若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶的合成可以轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。第73頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，為了提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期，最理想的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型。因?yàn)閷儆谘永m(xù)合成型的酶，在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞一開(kāi)始生長(zhǎng)就有酶產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶還可以繼續(xù)合成一段較長(zhǎng)的時(shí)間。第74頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天該類型酶所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性很好，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后的相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶的生物合成。第75頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA穩(wěn)定性好的，可以在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，繼續(xù)合成其所對(duì)應(yīng)的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，就隨著細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期而停止酶的生物合成；不受培養(yǎng)基中存在的某些物質(zhì)阻遏的，可以伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)而開(kāi)始酶的合成；受到培養(yǎng)基中某些物質(zhì)阻遏的，則要在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間甚至在平衡期后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。第76頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)于其他合成模式的酶，可通過(guò)下列措施來(lái)改變其合成模型，使其接近延續(xù)合成型：菌種選育工藝參數(shù)的優(yōu)化控制發(fā)酵代謝調(diào)節(jié)第77頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天其中對(duì)于同步合成型的酶，要盡量提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對(duì)于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開(kāi)始；而對(duì)于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開(kāi)始時(shí)間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時(shí)間。第78頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、酶生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及外界環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度影響的規(guī)律。1950年，法國(guó)的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程：rx=rx為細(xì)胞生長(zhǎng)速率，X為細(xì)胞濃度，μ為生長(zhǎng)速率假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì)，而不存在其他生長(zhǎng)限制因素時(shí)，μ為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。μm是指限制性底物濃度過(guò)量時(shí)的比生長(zhǎng)速率，即當(dāng)S＞＞Ks時(shí)，μ=

μm；KS

為莫諾德常數(shù)，是指比生長(zhǎng)速率達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率一半時(shí)的限制性基質(zhì)濃度。第79頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)于游離細(xì)胞連續(xù)全混流生物培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程為：

D為稀釋倍數(shù)，指單位時(shí)間內(nèi)劉家的培養(yǎng)液與發(fā)酵容器中培養(yǎng)液體積之比，一般以h-1，稀釋D的大小在0與μm之間。第80頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)稀釋率小于比生長(zhǎng)速率，即D<μ時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率為正值，表明發(fā)酵罐中細(xì)胞濃度不斷增加，隨著細(xì)胞濃度增加，限制性基質(zhì)的濃度相對(duì)降低，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)速率μ減少，在比生長(zhǎng)速率降低到與稀釋率相等的時(shí)候，重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)稀釋率等于比生長(zhǎng)速率，即D=μ，細(xì)胞生長(zhǎng)速率為0，即在一定體積的培養(yǎng)液中，單位時(shí)間內(nèi)流出的細(xì)胞與新增值的細(xì)胞數(shù)相同，培養(yǎng)液中細(xì)胞濃度保持恒定不變，此時(shí)的培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)。第81頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天③當(dāng)稀釋率等于比生長(zhǎng)速率，即D>μ，細(xì)胞生長(zhǎng)速率為負(fù)值，在一定體積的培養(yǎng)液中的濃度不斷被稀釋而逐漸降低，隨著細(xì)胞濃度降低，限制性基質(zhì)的相對(duì)濃度相對(duì)升高，使比生長(zhǎng)速率μ增大，在比生長(zhǎng)速率升到與稀釋率相同時(shí)，重新建立新的平衡，達(dá)到穩(wěn)態(tài)。④而當(dāng)稀釋率大于最大比生長(zhǎng)速率，及D>μm，細(xì)胞濃度趨向于0，無(wú)法建立穩(wěn)態(tài)。第82頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對(duì)產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的研究可以從整個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)著眼，研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素，這稱為宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或這稱為非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。也可以從細(xì)胞內(nèi)部著眼，研究細(xì)胞中酶合成速率及其影響因素，這謂之微觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)或稱為結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)。第83頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天宏觀產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)的研究表明，產(chǎn)酶速率與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞濃度及細(xì)胞產(chǎn)酶模式有關(guān)。產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)模型或產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程可以表示為：α是與生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，以每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)表示，U/g；β為非生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)酶速率，以小時(shí)每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)來(lái)表示，U/（h.g)；E為酶濃度，以每升發(fā)酵液中所含的酶單位數(shù)表示，U/L；t為時(shí)間，h第84頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天對(duì)于同步生長(zhǎng)型，其產(chǎn)酶速率與生長(zhǎng)直接相關(guān)，其非生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率β=0，產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：生產(chǎn)上可通過(guò)獲得高的比生長(zhǎng)速率來(lái)提高產(chǎn)物合成速度。第85頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天中期合成期的酶，其合成模式是一種特殊的生長(zhǎng)偶聯(lián)型，當(dāng)培養(yǎng)液中有阻遏物存在時(shí)，生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，即無(wú)酶產(chǎn)生，在細(xì)胞生長(zhǎng)，阻遏物被細(xì)胞利用完后阻遏作用解除，酶才開(kāi)始合成，此階段，產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程與同步合成型相同。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml第86頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天滯后合成型為非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，生長(zhǎng)偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0，產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：對(duì)于這類非生長(zhǎng)偶聯(lián)型產(chǎn)酶來(lái)說(shuō)，應(yīng)當(dāng)充分注意菌體在生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的營(yíng)養(yǎng)要求的差別，可適當(dāng)配用快速利用和緩慢利用的營(yíng)養(yǎng)物的比例，分別滿足不同時(shí)期菌體細(xì)胞的需要。第87頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天延續(xù)合成型酶，在生長(zhǎng)期和平衡期都可以產(chǎn)酶，其產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：第88頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)1、固定化細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

在適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，固定在載體上的細(xì)胞能以一定的速度生長(zhǎng)。隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，有一些細(xì)胞脫落到培養(yǎng)液中，而成為游離細(xì)胞，它們也在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。固定化細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中，包括兩部分細(xì)胞：固定在載體上的細(xì)胞、游離細(xì)胞。第89頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第90頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度（X）和比生長(zhǎng)速率（μ）成正比，即：根據(jù)莫諾德方程，，固定化細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程可以表示為：μmg、μmf分別代表固定在載體上的細(xì)胞和游離細(xì)胞的最大生長(zhǎng)速率Kmg、Kmf分別代表固定在載體上的細(xì)胞和游離細(xì)胞的莫諾德常數(shù)。第91頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)固定化細(xì)胞產(chǎn)酶速率由固定化細(xì)胞產(chǎn)酶速率和游離細(xì)胞產(chǎn)酶速率組成，即：延續(xù)合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程：

αμ+β為游離細(xì)胞比產(chǎn)酶速率；γ為固定在載體上細(xì)胞的產(chǎn)酶速率第92頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天同步合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：中期合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程為：當(dāng)有阻遏物時(shí)，dE/dt=0當(dāng)培養(yǎng)基中阻遏物被消耗完后，第93頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天滯后合成型固定化細(xì)胞產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程：第94頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、固定化細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)第95頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

細(xì)胞種類植物細(xì)胞微生物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞大小/um20-3001-1010-100倍增時(shí)間/h>120.3-6>15營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜簡(jiǎn)單復(fù)雜光照要求大多數(shù)要光照不要求不要求對(duì)剪切力敏感大多數(shù)不敏感敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機(jī)酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶疫苗、激素、抗體、酶第96頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天從表中可見(jiàn)其差異，主要有幾點(diǎn)：動(dòng)植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多。動(dòng)植物細(xì)胞對(duì)剪切力敏感，其中動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，更為敏感。動(dòng)植物細(xì)胞生長(zhǎng)速率與代謝速率低、生長(zhǎng)倍增時(shí)間和發(fā)酵周期均長(zhǎng)。動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求比微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞復(fù)雜，往往要求有血清或其他代用品。生產(chǎn)的主要產(chǎn)物各不相同。第97頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)有其缺點(diǎn)：動(dòng)植物細(xì)對(duì)剪切力敏感，要求特殊生物反應(yīng)器和培養(yǎng)方法。動(dòng)植物細(xì)胞對(duì)防止雜菌污染的技術(shù)要求高；動(dòng)物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)要求苛刻。第98頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)酶1、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點(diǎn)從天然植物中提取的方式的缺點(diǎn)：天然植物的產(chǎn)量低許多野生植物趨于瀕?；驕缃^引種馴化困難受自然環(huán)境和耕地的影響，栽培中產(chǎn)量和質(zhì)量難以控制第99頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)率高產(chǎn)品質(zhì)量高生產(chǎn)周期短可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)和探索新的合成路徑，以獲得新的有用物質(zhì)第100頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性：細(xì)胞個(gè)大，抗剪切力低生長(zhǎng)速度慢，為防止培養(yǎng)過(guò)程中染菌，需加抗生素細(xì)胞易聚集成團(tuán)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)且產(chǎn)量低細(xì)胞培養(yǎng)需氧，而培養(yǎng)液黏度大，且不能強(qiáng)力通風(fēng)攪拌第101頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天產(chǎn)酶植物細(xì)胞酶種類胡蘿卜細(xì)胞糖苷酶紫苜蓿細(xì)胞β-半乳糖苷酶假挪威槭細(xì)胞漆酶甜菜細(xì)胞、大豆細(xì)胞過(guò)氧化物酶利馬豆細(xì)胞β-葡萄糖苷酶甜菜細(xì)胞酸性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞堿性轉(zhuǎn)化酶甜菜細(xì)胞糖化酶花生細(xì)胞、大豆細(xì)胞苯丙氨酸裂合酶番木瓜細(xì)胞木瓜蛋白酶大蒜細(xì)胞超氧化物歧化酶菠蘿細(xì)胞菠蘿蛋白酶劍麻細(xì)胞劍麻蛋白酶番木瓜細(xì)胞木瓜凝乳蛋白酶第102頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第103頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第104頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第105頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、植物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝過(guò)程細(xì)胞培養(yǎng)的一般工藝：材料的選擇和消毒

細(xì)胞的獲得

細(xì)胞培養(yǎng)

產(chǎn)物分離純化產(chǎn)品第106頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）材料的選擇與消毒無(wú)病蟲(chóng)害，生長(zhǎng)力旺盛，生長(zhǎng)有規(guī)則的植株，從產(chǎn)生次級(jí)代謝物的組織部位中切取部分組織。取0.5-1cm的片段或小塊消毒、漂洗。消毒劑：70-75%酒精、5%次氯酸鈉、10%的漂白粉、0.1%升汞等。第107頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）植物細(xì)胞的獲取

①直接分離法：機(jī)械法：將外植體材料輕輕搗碎或用勻漿器破碎，然后用紗布或金屬濾網(wǎng)過(guò)濾，并離心分離細(xì)胞。酶解法：用果膠酶、纖維素酶等處理外殖體后分離有代謝活性的細(xì)胞。（須用甘露醇等進(jìn)行滲透壓保護(hù)）第108頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天②愈傷組織誘導(dǎo)法愈傷組織能迅速增殖的無(wú)特定結(jié)構(gòu)和功能的簿壁細(xì)胞團(tuán)?？捎赏庵丑w培養(yǎng)1-3周而形成。過(guò)程：含一定量的生長(zhǎng)素和分裂素的液體培養(yǎng)基中加入0.7—0.8的瓊脂，制成半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、滅菌、外植體植入、25C培養(yǎng)、長(zhǎng)出愈傷組織后分散繼代培養(yǎng)。分散細(xì)胞可用小細(xì)胞團(tuán)移入液體培養(yǎng)液中，加玻璃珠，振蕩培養(yǎng)，然后用適當(dāng)孔徑的不誘鋼篩網(wǎng)過(guò)濾。第109頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天③原生質(zhì)體再生法：原生質(zhì)體可用植物單細(xì)胞、愈傷組織和植物的組織器官制備。常用的有纖維素酶和果膠酶的混合物。滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、蔗糖、葡萄糖、鹽類、山梨醇原生質(zhì)體分離后，在一定條件下培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁成單細(xì)胞懸浮液。單細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞系第110頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第111頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天第112頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：能提供大量均勻的細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞增殖的速度比愈傷組織快，適合大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式：分批培養(yǎng)法半連續(xù)培養(yǎng)法連續(xù)培養(yǎng)法（4）分離純化第113頁(yè),共129頁(yè)，2024年2月25