高通量測序技術(shù)的類型原理及應(yīng)用

高通量測序技術(shù)的類型原理及應(yīng)用主要內(nèi)容類型及原理2應(yīng)用341概述致謝第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天概述高通量測序技術(shù)(High-throughputsequencing)

又稱“下一代”測序技術(shù)”、深度測序

以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。

這使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天類型及原理

目前，所說的高通量測序技術(shù)主要是指454LifeSciences公司、ABI

公司和Illumina公司推出的第二代測序技術(shù)以及HelicosHeliscopeTM和PacificBiosciences

推出的單分子測序技術(shù)。第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2005年，454LifeSciences公司(現(xiàn)已被Roche公司收購)首先推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)，開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河。第二代測序技術(shù)第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天原理：酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)1.首先將PCR

擴增的單鏈DNA與引物雜交，并與DNA

聚合酶、ATP

硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物熒光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。第二代測序技術(shù)2.在每一輪測序反應(yīng)中只加入一種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸。第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天原理：酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)3.焦磷酸鹽被硫酸化酶轉(zhuǎn)化為ATP，ATP

就會促使氧合熒光素的合成并釋放可見光，CCD檢測后通過軟件轉(zhuǎn)化為一個峰值，峰值與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。第二代測序技術(shù)第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天此后，Illumina

公司和ABI公司相繼推出了Solexa和SOLiD(supportedoligoligationdetetion)測序技術(shù)。第二代測序技術(shù)第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

即生成新DNA

互補鏈時，要么加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物激發(fā)出熒光，要么直接加入被熒光標記的dNTP

或半簡并引物，在合成或連接生成互補鏈時釋放出熒光信號。通過捕獲光信號并轉(zhuǎn)化為一個測序峰值，獲得互補鏈序列信息。原理：與焦磷酸測序法的類似，核心思想都是邊合成邊測序(sequencingbysynthesis)。第二代測序技術(shù)第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第二代測序技術(shù)優(yōu)點：操作極為簡便：無需進行電泳；可以在芯片上進行高通量分析；大大節(jié)省了成本和時間。第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天Illumina公司目前擁有三種測序平臺，分別為HiSeq2000、HiSeq1000、GenomeAnalyzerIIx(/)；ABI公司則主要是SOLiD3

和SOLiD4兩個測序平臺。

從通量這個最直觀的數(shù)字看來，HiSeq2000領(lǐng)先于SOLiD4。

HiSeq2000測序平臺單次反應(yīng)可以讀取200G的數(shù)據(jù)，而SOLiD4

僅為100G

左右。第二代測序技術(shù)第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

就測序讀長來說，454

測序平臺讀長最長，目前已經(jīng)達到400nt。因此，454

平臺比較適合對未知基因組從頭測序，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時準確度不高。Solexa

測序讀長較454短，僅為100nt

左右，但測序通量高、價位低，適合基因組重測序等。SOLiD讀長也較短，但測序精度較高，特別適合SNP檢測等。第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天在第二代測序平臺不斷完善和廣泛應(yīng)用的同時，以對單分子DNA進行非PCR測序為主要特征的更新的測序技術(shù)也初顯端倪。2008年4月HelicoBioScience公司的Harris等在Science上報道了他們開發(fā)的基于全內(nèi)反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測序技術(shù)—單分子測序技術(shù)。單分子測序技術(shù)第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天基于全內(nèi)反射顯微鏡(totalInternalreflectionmicroscopy,TIRM)的測序技術(shù)原理：1.將待測DNA樣品隨機打斷成小片段，在每個小片段的末端加上poly-dA；2.將小片段DNA模板與固定在檢測芯片上的poly-dT引物進行雜交并精確定位，并逐一加入熒光標記的末端終止子；單分子測序技術(shù)第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3.洗滌、成像，切開熒光染料和抑制基團；4.洗滌、加帽，允許下一個核苷酸的摻入；5.這樣通過摻入、檢測和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實時讀取大量序列。第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天單分子實時技術(shù)(SMRT)單分子測序技術(shù)

該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶，在聚合反應(yīng)的同時就可以讀取測序產(chǎn)物。SMRT測序技術(shù)在測序速度、讀長和成本方面有著巨大的優(yōu)勢和潛力。第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天IonPGM測序技術(shù)原理

基于半導(dǎo)體芯片技術(shù)，在半導(dǎo)體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入ACGT，隨著每個堿基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到。單分子測序技術(shù)第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天主要優(yōu)點：大大節(jié)省了成本和時間主要缺點：測序儀的價格昂貴單分子測序技術(shù)第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

目前HelicoBioScience公司的HeliScope測序儀售價近百萬美元，這是一般實驗室和科研單位所不能承受的。LifeTechologies公司推出的IonPersonalGenomeMachine(PGMTM)測序儀價格僅為普通測序儀的1/10，而且研究人員能夠在2h內(nèi)獲取從10Mb到1Gb以上高精確度序列。單分子測序技術(shù)第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天大規(guī)模平行測序(massivelyparallelsignaturesequencing，MPSS)：它利用芯片進行測序，可以在數(shù)百萬個點上同時閱讀測序，把平行處理的思想用到極致。高通量測序技術(shù)的優(yōu)點成本低廉：利用高通量測序技術(shù)進行人類基因組測序，耗資不到傳統(tǒng)測序法的1%。第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天高通量測序技術(shù)的優(yōu)點高通量測序技術(shù)有完美的定量功能：這是因為樣品中某種DNA被測序的次數(shù)反映了樣品中這種DNA的豐度。這一點有望取代以前的基因表達芯片技術(shù)用于基因表達的研究。第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天高通量測序技術(shù)的應(yīng)用大規(guī)?；蚪M測序基因表達分析非編碼小分子RNA的鑒定轉(zhuǎn)錄因子靶基因的篩選DNA甲基化相關(guān)研究其他第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天全基因組測序

高通量測序技術(shù)在發(fā)展初期由于讀長較短，使其在對未知基因組從頭測序(denovoSequencing)的應(yīng)用受到限制，只能用于基因組重測序?；蚪M重測序是指對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進行差異性分析。第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天高通量RNA測序及其在轉(zhuǎn)錄組和基因表達調(diào)控上的應(yīng)用

最近科學(xué)家們將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組分析開發(fā)出了RNA測序技術(shù)(RNA-Seq)，該技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)檢測基因表達情況，進行差異基因篩選分析。

由于RNA-Seq技術(shù)具有通量高、可重復(fù)性高、檢測范圍寬、定量準等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細菌、擬南芥、水稻和人類等生物轉(zhuǎn)錄組的研究。第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

轉(zhuǎn)錄組研究是從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)。但是，多數(shù)研究人員感興趣的是某一特定的生物過程、發(fā)育階段或處理后的基因表達情況。

建立在高通量測序基礎(chǔ)上的數(shù)字化基因表達譜(digitalgeneexpressionprofiling)分析無需預(yù)先針對已知序列設(shè)計探針，即可對任何生物整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，因此應(yīng)用范圍更加廣泛。第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

高通量RNA

測序技術(shù)另一個廣泛應(yīng)用的領(lǐng)域是小RNA的研究。

小RNA在植物的生長、發(fā)育和外界脅迫應(yīng)答等方面具有重要功能。

但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基因芯片檢測小RNA非常困難。

高通量測序技術(shù)不但能夠克服這一難題，而且能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNA。目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)成功的應(yīng)用于擬南芥、水稻和小麥等生物小RNA的研究。第26頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

ChIP-Seq

技術(shù)及其在DNA和蛋白質(zhì)相互作用研究中的應(yīng)用

染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmuno-precipitation，ChIP)

技術(shù)是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA

之間相互作用的強有力工具，在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究中被廣泛應(yīng)用。第27頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

染色質(zhì)免疫共沉淀測序(chromatinimmuneprecipitationsequencing，ChIP-Seq)技術(shù)充

分結(jié)合了ChIP和高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢，能夠在全基因組范圍內(nèi)高效地研究目的蛋白的結(jié)合位點。第28頁,共34頁，2024年2月25日，星期天該技術(shù)的原理：1.通過ChIP技術(shù)利用抗體特異性地富集交聯(lián)的目的蛋白-DNA復(fù)合體；2.將得到的DNA片段進行高通量測序；3.將獲得的數(shù)百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白或轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。第29頁,共34頁，2024年2月25日，星期天基因組DNA甲基化分析DNA甲基化在維持細胞正常功能、遺傳印記和胚胎發(fā)育過程中起著極其重要的作用。

新一代高通量測序技術(shù)使得基因組整體水平高精度的甲基化檢測成為現(xiàn)實。

目前，高通量測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、水稻、蠶和人等生物DNA甲基化的研究，并取得了豐碩的成果。第30頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

目前，已經(jīng)建立了至少三種依賴于高通量測序的DNA甲基化分析技術(shù)：甲基化DNA免疫共沉淀測序(methylatedDNAimmunoprecipitationsequencing