儀器分析學(xué)生實(shí)驗(yàn)NBS熒光素CTAC化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定尿素的含量省公開(kāi)課一等獎(jiǎng)全國(guó)示范課微課金獎(jiǎng)

《儀器分析》學(xué)生試驗(yàn)課件

NBS-熒光素-CTAC化學(xué)發(fā)光體系

測(cè)定尿素含量化學(xué)化工學(xué)院環(huán)境科學(xué)教研室方盧秋年秋期1/27目錄一、概述二．試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)意義和要求三、試驗(yàn)原理1.試驗(yàn)裝置示意圖2.化學(xué)發(fā)光原理四、儀器藥品1．主要儀器2．主要藥品及貯備液配制五、試驗(yàn)內(nèi)容及操作步驟1.試驗(yàn)主要內(nèi)容2.試驗(yàn)操作步驟六、數(shù)據(jù)處理七、思索題2/27一、概述1.化學(xué)發(fā)光及化學(xué)發(fā)光分析化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence）又稱為冷光（ColdLight），是在沒(méi)有任何光、熱或電場(chǎng)等激發(fā)情況下，由化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生光輻射。生命系統(tǒng)中化學(xué)發(fā)光，稱為生物發(fā)光（Bioluminescence），它不依賴于有機(jī)體對(duì)光吸收，而是一個(gè)特殊類型化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光分析（ChemiluminescenceAnalysis）就是利用化學(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象進(jìn)行分析方法。是近30多年來(lái)發(fā)展起來(lái)一個(gè)新型、高靈敏度痕量分析方法。在痕量分析、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)、食品安全等領(lǐng)域得到愈來(lái)愈廣泛應(yīng)用。3/27生物化學(xué)發(fā)光圖4/272.化學(xué)發(fā)光分析基本原理化學(xué)發(fā)光是吸收化學(xué)反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生化學(xué)能，使反應(yīng)產(chǎn)物分子或者其它物質(zhì)分子被激發(fā)而發(fā)射光輻射。任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)都應(yīng)包含化學(xué)激發(fā)和發(fā)光兩個(gè)步驟，必須滿足以下條件：（1）化學(xué)反應(yīng)必須提供足夠激發(fā)能，激發(fā)能主要起源于反應(yīng)焓。（2）要有有利化學(xué)反應(yīng)歷程，使化學(xué)反應(yīng)能量最少能被一個(gè)物質(zhì)所接收并生成激發(fā)態(tài)。（3）激發(fā)態(tài)能釋放光子或能夠轉(zhuǎn)移它能量給另一個(gè)分子，而使該分子激發(fā)，然后以輻射光子形式回到基態(tài)?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)效率

cl，又稱化學(xué)發(fā)光總量子產(chǎn)率，決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子化學(xué)激發(fā)效率

ce和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射效率

em。定義為：

cl=發(fā)射光子分子數(shù)/參加反應(yīng)分子數(shù)=

ce

em5/273.化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型3.1直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子。A+B

C*+DC*

C+h

式中A或B是被測(cè)物，經(jīng)過(guò)反應(yīng)生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，當(dāng)C*躍遷回基態(tài)時(shí)，輻射光子。6/27間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。A+B

C*+DC*+F

F*+EF*

F+h

式中C*為能量給予體，而F為能量接收體3.2氣相化學(xué)發(fā)光、液相和固相化學(xué)發(fā)光按反應(yīng)體系狀態(tài)分類，如化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行稱為氣相化學(xué)發(fā)光；在液相或固相中進(jìn)行稱為液相或固相化學(xué)發(fā)光；在兩個(gè)不一樣相中進(jìn)行則稱為異相化學(xué)發(fā)光。（1）氣相化學(xué)發(fā)光主要有O3、NO、S化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。（2）液相化學(xué)發(fā)光用于這類化學(xué)發(fā)光分析發(fā)光物質(zhì)有魯米諾、光澤精等。7/273.3化學(xué)發(fā)光、生物化學(xué)發(fā)光和電致化學(xué)發(fā)光分析法依據(jù)供能反應(yīng)特點(diǎn)，可將化學(xué)發(fā)光分析法分為：1）普通化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為普通化學(xué)反應(yīng)；簡(jiǎn)稱CL)；2）生物化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為生物化學(xué)反應(yīng)；簡(jiǎn)稱BCL)；3）電致化學(xué)發(fā)光分析法(供能反應(yīng)為電化學(xué)反應(yīng)，簡(jiǎn)稱ECL)等。8/273.4直接測(cè)定、偶合反應(yīng)、時(shí)間分辯和酶免疫化學(xué)發(fā)光分析法依據(jù)測(cè)定方法不一樣又可分為：1)直接測(cè)定

CL分析法；2)偶合反應(yīng)CL分析法(經(jīng)過(guò)反應(yīng)偶合，測(cè)定體系中某一組份)；3)時(shí)間分辨CL分析法(即利用多組份對(duì)同一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)影響時(shí)間差實(shí)現(xiàn)多組份測(cè)定)；4)酶免疫CL分析法等。9/274.化學(xué)發(fā)光測(cè)量裝置化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)量?jī)x器主要包含樣品室、光檢測(cè)器、放大器和信號(hào)輸出裝置?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在樣品室中進(jìn)行，樣品和試劑混合方式有不連續(xù)取樣體系，加樣是間歇。將試劑先加到光電倍增管前面反應(yīng)池內(nèi)，然后用進(jìn)樣器加入分析物。另一個(gè)方法是連續(xù)流動(dòng)體系，反應(yīng)試劑和分析物是定時(shí)在樣品池中匯合反應(yīng)，且在載流推進(jìn)下向前移動(dòng)，被檢測(cè)光信號(hào)只是整個(gè)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線一部分，以峰高進(jìn)行定量測(cè)量。按照進(jìn)樣方式，可將化學(xué)發(fā)光分析儀分為分離取樣式和流動(dòng)注射式兩類。10/27BPCL型微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x

11/27IFFM-D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀12/275.流動(dòng)注射分析介紹流動(dòng)注射分析是70年代中期誕生并快速發(fā)展起來(lái)溶液自動(dòng)在線處理及測(cè)定當(dāng)代分析技術(shù)。流動(dòng)注射分析方法主要有：流動(dòng)注射分光光度法、流動(dòng)注射原子光譜法、流動(dòng)注射電化學(xué)分析法、流動(dòng)注射酶分析法、流動(dòng)注射熒光及化學(xué)發(fā)光法、流動(dòng)注射免疫分析法、流動(dòng)注射在線分離濃集、在線消解等操作方法和技術(shù)。13/27流動(dòng)注射法含有以下優(yōu)點(diǎn)①測(cè)量在動(dòng)態(tài)條件下進(jìn)行，反應(yīng)條件和分析操作能自動(dòng)保持一致，結(jié)果重現(xiàn)性好;②耗樣量少、分析速度快，尤其適合于大批量樣品分析；③不但易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)分析，且可方便地用于比色、離子電極、原子吸收分析。14/276.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀介紹IFFM-E型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀是國(guó)內(nèi)最早推出全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)分析系統(tǒng)。儀器集成了高精度雙蠕動(dòng)泵數(shù)控寬調(diào)速流動(dòng)注射進(jìn)樣系統(tǒng)，多功效超微弱化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器及功效強(qiáng)大化學(xué)發(fā)光檢測(cè)與數(shù)據(jù)采集及化學(xué)分析動(dòng)力學(xué)譜圖分析軟件?？蛇M(jìn)行靜態(tài)注射化學(xué)發(fā)光分析、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光等分析。15/277.尿素及其分析方法尿素，又稱為脲，其作用與山梨醇基本相同，為滲透性利尿藥。臨床用于腦水腫、顱內(nèi)壓增高、青光眼，燒傷、創(chuàng)傷和術(shù)后尿少癥，外用可治療一些皮膚病。尿液和血清尿素氮測(cè)定，對(duì)急性腎功效衰竭，尤其是尿毒癥診療有特殊價(jià)值，其增高程度與病情嚴(yán)重性成正比，對(duì)判斷病情和預(yù)后估價(jià)有主要作用。建立快速、準(zhǔn)確、靈敏尿素測(cè)定方法，在藥品分析、臨床治療、醫(yī)學(xué)診療等方面有主要意義。測(cè)定尿素方法主要有：生物傳感器法，紫外/可見(jiàn)法，HPLC法等。16/27在堿性條件下，熒光素作為能量轉(zhuǎn)移劑，NBS氧化尿素產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）對(duì)該體系含有強(qiáng)烈增敏作用，據(jù)此建立NBS-熒光素-CTAC流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定尿素分析方法。含有更寬線性范圍和更低檢出限。測(cè)定線性范圍為：3×10-5～7×10-8g/mL，方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.6%(5×10-8g/mL，n=11）,檢出限（3σ）為3.0×10-9g/mL。本法可用于人體尿液中尿素含量測(cè)定。17/27二．試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)意義和要求1.鞏固化學(xué)發(fā)光分析法理論知識(shí)。2.了解流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀結(jié)構(gòu)，掌握儀器操作、化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)原理。3.掌握化學(xué)發(fā)光試驗(yàn)條件優(yōu)化操作步驟，建立流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法。18/27三、試驗(yàn)原理1.試驗(yàn)裝置示意圖P1,P2.蠕動(dòng)泵；V.八通閥；F.流通池；PMT.光電倍增管；HV.負(fù)高壓；PC.計(jì)算機(jī)控制化學(xué)發(fā)光分析儀。A.樣品，B.NBS，C.熒光素＋NaOH＋CTAC溶液。19/272.化學(xué)發(fā)光原理堿性條件下，NBS氧化性來(lái)自其水解產(chǎn)物HBrO，其氧化特征類似于HBrO，但較HBrO穩(wěn)定。尿素分子中含有還原性胺基（-NH2），可被HBrO氧化，產(chǎn)生化學(xué)能激發(fā)共存熒光素，從而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光?？赡芊磻?yīng)機(jī)理以下：NBS＋H2O→NHS＋HBrO即尿素＋HBrO＋OH-→產(chǎn)物*產(chǎn)物*＋熒光素→熒光素*＋產(chǎn)物熒光素*→熒光素＋hν20/27四、儀器藥品1．主要儀器IFFM－D型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁電子科技有限企業(yè)生產(chǎn)）；離心機(jī)（0－4000r/min，常州國(guó)華電器有限企業(yè)生產(chǎn)）；電子分析天平（EL104，梅特勒-托利多（上海）有限企業(yè)）。2．主要藥品及貯備液配制21/27五、試驗(yàn)內(nèi)容及操作步驟1.試驗(yàn)主要內(nèi)容1.1樣品稀釋酸堿性選擇試驗(yàn)鹽酸、硫酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉，水稀釋作對(duì)照，濃度為0.05mol/L。1.2熒光物質(zhì)種類選擇試驗(yàn)羅丹明-6G、熒光素鈉、熒光素、二氯熒光素，水稀釋作對(duì)照，濃度為8×10-5mol/L。1.3熒光物質(zhì)濃度選擇試驗(yàn)熒光素濃度在1×10-6～8×10-4mol/L范圍內(nèi)選擇。1.4反應(yīng)介質(zhì)種類選擇試驗(yàn)氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸氫鈉，水稀釋作對(duì)照，濃度為0.05mol/L。22/271.5反應(yīng)介質(zhì)濃度選擇試驗(yàn)考查熒光素中氫氧化鈉在0.03-0.50mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度影響。1.6表面活性劑種類選擇試驗(yàn)十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、吐溫80、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC），水稀釋作對(duì)照，濃度為3×10-3mol/L。1.7表面活性劑濃度選擇試驗(yàn)考查CTAC物質(zhì)量濃度在5×10-4～7×10-3mol/L范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度影響。1.8NBS濃度選擇試驗(yàn)試驗(yàn)考查NBS物質(zhì)量濃度在0.008～0.03mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光體系影響。23/272.試驗(yàn)操作步驟2.1化學(xué)發(fā)光儀使用A．連接好蠕動(dòng)泵、化學(xué)發(fā)光儀主機(jī)、分離式檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)主機(jī)及打印機(jī)電源線、信號(hào)線和聚四氟乙烯管路系統(tǒng)，仔細(xì)檢驗(yàn)管線連接無(wú)誤。B．打開(kāi)總電源開(kāi)關(guān)，開(kāi)啟化學(xué)發(fā)光儀主機(jī)電源、打印機(jī)電源、蠕動(dòng)泵電源，再按下計(jì)算機(jī)電源開(kāi)啟電腦，點(diǎn)擊IFFM分析系統(tǒng)，開(kāi)啟分析應(yīng)用軟化程序，進(jìn)入主界面。C．編輯或者打開(kāi)參數(shù)文件。D．所配制各種溶液插入聚四氟乙烯管。E．點(diǎn)擊開(kāi)啟測(cè)量按鈕，儀器開(kāi)始測(cè)量過(guò)程，依據(jù)需要調(diào)整測(cè)量時(shí)間、主副泵轉(zhuǎn)速，依據(jù)信號(hào)大小調(diào)整負(fù)高壓及增益。F．測(cè)量完成，用蒸餾水洗滌各流路，洗滌時(shí)間不少于5分鐘，抽干5分鐘，松開(kāi)蠕動(dòng)泵。G．保留用戶文件，關(guān)閉應(yīng)用程序。運(yùn)行計(jì)算機(jī)系統(tǒng)退出程序，關(guān)閉各儀器電源，最終關(guān)閉總電源開(kāi)關(guān)。24/272.2樣品處理取健康人體新鮮尿液50mL，用移液管移取10.0mL，以3500