《熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范》

(滬蘇浙皖)

滬蘇浙皖地方計(jì)量技術(shù)規(guī)范

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范

CalibrationSpecificationfor

FluorescenceInstrumentsofChlorophylla

（報(bào)批稿）

202X—XX—XX發(fā)布202X—XX—XX實(shí)施

上海市市場監(jiān)督管理局

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

浙江省市場監(jiān)督管理局

安徽省市場監(jiān)督管理局

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

引言

本規(guī)范的編寫以JJF1001-2011《通用計(jì)量術(shù)語及定義》、JJF1071-2010《國家計(jì)

量校準(zhǔn)規(guī)范編寫規(guī)則》和JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》為基礎(chǔ)和依

據(jù)，主要參考了GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》和HJ897-2017

《水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法》的部分內(nèi)容。

本規(guī)范為首次發(fā)布。

II

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熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范

1范圍

本規(guī)范適用于測(cè)量范圍（0.2～200）μg/L的基于熒光法的葉綠素a測(cè)定儀的校

準(zhǔn)。

2引用文件

本規(guī)范引用了下列文件：

GB/T14581-1993水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ494-2009水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ897-2017水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法

HJ/T91-2002地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用

文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。

3概述

熒光法葉綠素a測(cè)定儀（以下簡稱儀器）基于葉綠素a的熒光誘導(dǎo)技術(shù)，通過

發(fā)射特定波長的光照射水體，激發(fā)水體中的葉綠素a產(chǎn)生特定波長的熒光，熒光強(qiáng)

度與葉綠素a的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，從而得到葉綠素a的濃度值。儀器一般

由光源、檢測(cè)器、指示器三部分組成，其原理示意圖如圖1所示。

光源檢測(cè)器指示器

圖1儀器原理示意圖

4計(jì)量特性

儀器的計(jì)量特性要求見表1。

表1計(jì)量特性要求

校準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)量特性要求

線性誤差±10%

重復(fù)性≤5%

穩(wěn)定性≤5%/h

1

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示值誤差±20%

以上計(jì)量特性要求僅供參考，不作為判定依據(jù)。

5校準(zhǔn)條件

5.1環(huán)境條件：

環(huán)境溫度：5℃～40℃。

電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5)Hz。

5.2測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備：

5.2.1羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：相對(duì)擴(kuò)展不確定度不大于3%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)溶液的

配置方法見附錄A。

5.2.2吸量管、容量瓶：A級(jí)。

5.2.3《HJ897-2017水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法》第4章及第5章中使用的

其它試劑及設(shè)備。

6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法

6.1線性誤差

在儀器常用測(cè)量范圍內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則設(shè)置5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)配制對(duì)應(yīng)不同葉

綠素a濃度的羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，如在（0.2～200）μg/L范圍，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)為0.2μg/L、

50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L。分別進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，用最小二乘法擬

合羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值和儀器的葉綠素a濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到

儀器的線性方程，見公式（1）。

yabx（1）

式中：

y——儀器測(cè)得的葉綠素a濃度值，μg/L；

a——截距；

b——斜率；

x——羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L。

2

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按公式（2）計(jì)算各測(cè)量點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，按照公式（3）計(jì)

算線性誤差（不包含最低濃度點(diǎn)），取結(jié)果絕對(duì)值最大值為儀器的線性誤差校準(zhǔn)結(jié)

果。

ya

xi（2）

ib

xxisi

xi100%（3）

xsi

式中：

yi——第i點(diǎn)的儀器測(cè)得葉綠素a濃度的平均值，μg/L；

xi——第i點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，μg/L；

xsi——第i點(diǎn)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；

xi——第i點(diǎn)的線性誤差，%。

6.2重復(fù)性

選用對(duì)應(yīng)葉綠素a濃度為20μg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)量7次。按公式（4）

和公式（5）分別計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，按公式（6）計(jì)算儀器重復(fù)性：

7

ci

c=i1（4）

7

7

2

()cci

s=i1（5）

71

s

s=100%（6）

rc

式中：

ci——儀器第i次測(cè)得值，μg/L；

c——7次測(cè)量值的平均值，μg/L；

s——單次測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，μg/L，

sr——儀器重復(fù)性，%。

6.3穩(wěn)定性

3

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選用對(duì)應(yīng)葉綠素a濃度為20μg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。記錄初始測(cè)量

值c0，之后每隔10min測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定1h，記錄儀器測(cè)量值ci，按公式（7）

計(jì)算儀器穩(wěn)定性：

cc

S=100%i0max（7）

c0

式中：

S——儀器穩(wěn)定性，%；

——每10min測(cè)得值，μg/L；

——初始測(cè)量值，μg/L。

6.4示值誤差

選取葉綠素a濃度值在儀器量值測(cè)量范圍內(nèi)的水樣，分成2份，作為儀器的校

準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液。取其中1份試樣，依據(jù)附錄B中的分光光度法測(cè)量試樣中的葉綠素a濃

度值。再取另外1份試樣，用儀器進(jìn)行重復(fù)測(cè)量3次，計(jì)算出3次測(cè)量值的平均值。

按公式（8）計(jì)算儀器示值誤差c。

r

ccs

cr=100%（8）

cs

式中：

——示值誤差，%；

c——儀器3次測(cè)量值的平均值，μg/L；

cs——分光光度法測(cè)得的葉綠素a濃度值，μg/L。

7校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)

經(jīng)校準(zhǔn)后的儀器，出具校準(zhǔn)證書，校準(zhǔn)證書應(yīng)符合JJF1071-2010中5.12的要求，

校準(zhǔn)原始記錄格式參見附錄C，校準(zhǔn)證書（內(nèi)頁）格式參見附錄D。

8復(fù)校時(shí)間間隔

由于復(fù)校時(shí)間間隔是由儀器的使用者、使用情況以及儀器本身質(zhì)量等諸因素所

決定的，因此，送校單位可根據(jù)實(shí)際使用情況自主決定復(fù)校時(shí)間間隔。

建議復(fù)校時(shí)間間隔一般不超過1年。如果儀器更換重要部件、維修或?qū)x器性

4

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能有懷疑時(shí)，應(yīng)隨時(shí)校準(zhǔn)。

5

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附錄A

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法

警告：羅丹明B被列入可能致癌/誘導(dǎo)有機(jī)體突變的物質(zhì)，操作過程中必須戴手套。

A.1羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

相對(duì)擴(kuò)展不確定度不大于3%（k=2）。

A.2羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

采用儀器說明書中的方法計(jì)算校準(zhǔn)所需羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（20℃下），

并依據(jù)所用羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度，配制校準(zhǔn)用羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液。例如，根據(jù)

某企業(yè)說明書，在20℃時(shí)20μg/L的葉綠素a所對(duì)應(yīng)的羅丹明B濃度為290μg/L。

用10mL單標(biāo)線吸量管準(zhǔn)確移取1mg/mL的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于1000mL單標(biāo)

線容量瓶中，用試驗(yàn)用空白水稀釋至刻度，定容并搖勻，得到1000mL濃度為10mg/L

的羅丹明B儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液。再用分度吸量管移取29mL羅丹明B儲(chǔ)備溶液置于

1000mL單標(biāo)線容量瓶中，即可配制成290μg/L羅丹明B稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液。

A.3羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的保存與使用

按上述步驟配制的羅丹明B儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液需在（0～4）℃下避光保存，防止分

解。羅丹明B稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液必須在配制后的24h內(nèi)使用。

A.4廢液處理

實(shí)驗(yàn)室過程中產(chǎn)生的廢液，應(yīng)集中收集，并做好相應(yīng)的標(biāo)識(shí)，委托有資質(zhì)的單

位處理。

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附錄B

葉綠素a參考測(cè)定方法（分光光度法）

B.1方法原理

將一定量樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻類細(xì)胞，用丙酮溶液提取葉綠

素，離心分離后分別于750nm、664nm、647nm和630nm波長處測(cè)定提取液吸光

度，根據(jù)公式計(jì)算水中葉綠素a的濃度。

B.2試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為新制備

的去離子水或蒸餾水。

B.2.1丙酮（CH3COCH3）。

B.2.2碳酸鎂（MgCO3）。

B.2.3丙酮溶液：9+1。在900mL丙酮（4.1）中加入100mL實(shí)驗(yàn)用水。

B.2.4碳酸鎂懸濁液。稱取1.0g碳酸鎂（4.2），加入100mL實(shí)驗(yàn)用水，攪拌成懸

濁液（使用前充分搖勻）。

B.2.5玻璃纖維濾膜：直徑47mm，孔徑為0.45μm～0.7μm。

B.3儀器和設(shè)備

B.3.1采樣瓶：1L或500mL具磨口塞的棕色玻璃瓶。

B.3.2過濾裝置：配真空泵和玻璃砂芯過濾裝置。

B.3.3研磨裝置：玻璃研缽或其他組織研磨器。

B.3.4離心機(jī)：相對(duì)離心力可達(dá)到1000×g（轉(zhuǎn)速3000r/min～4000r/min）。

B.3.5玻璃刻度離心管：15mL，旋蓋材質(zhì)不與丙酮反應(yīng)。

B.3.6可見分光光度計(jì)：配10mm石英比色皿。

B.3.7針式濾器：0.45μm聚四氟乙烯有機(jī)相針式濾器。

B.4樣品

B.4.1樣品采集

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行樣品的采集。樣品的采

集一般使用有機(jī)玻璃采水器或其他適當(dāng)?shù)牟蓸悠鞑杉嫦?.5m樣品，湖泊、水

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庫根據(jù)需要可進(jìn)行分層采樣或混合采樣，采樣體積為1L或500mL。如果樣品中含

沉降性固體（如泥沙等），應(yīng)將樣品搖勻后倒入2L量筒，避光靜置30min，取水

面下5cm樣品，轉(zhuǎn)移至采樣瓶（5.1）。在每升樣品中加入1mL碳酸鎂懸濁液

（4.4），以防止酸化引起色素溶解。注：如果水深不足0.5m，在水深1/2處采集樣

品，但不得混入水面漂浮物。

B.4.2樣品保存

樣品采集后應(yīng)在0℃～4℃避光保存、運(yùn)輸，24h內(nèi)運(yùn)送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室過濾

（若樣品24h內(nèi)不能送達(dá)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)現(xiàn)場過濾，濾膜避光冷凍運(yùn)輸），樣品濾

膜于-20℃避光保存，14d內(nèi)分析完畢。

注：樣品采集后，如條件允許，宜盡快分析完畢。

B.4.3試樣的制備

B.4.3.1過濾

在過濾裝置（5.2）上裝好玻璃纖維濾膜（4.5）。根據(jù)水體的營養(yǎng)狀態(tài)確定取樣

體積，見表1，用量筒量取一定體積的混勻樣品，進(jìn)行過濾，最后用少量蒸餾水沖

洗濾器壁。過濾時(shí)負(fù)壓不超過50kPa，在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾，用鑷

子將濾膜取出，將有樣品的一面對(duì)折，用濾紙吸干濾膜水分。

注：僅當(dāng)富營養(yǎng)化水體的樣品無法通過玻璃纖維濾膜時(shí)，可采用離心法濃縮樣

品，但轉(zhuǎn)移過程中應(yīng)保證提取效率，避免葉綠素a的損失及水分對(duì)丙酮溶液濃度的

影響。

表B.1參考過濾樣品體積

營養(yǎng)狀態(tài)富營養(yǎng)中營養(yǎng)貧營養(yǎng)

過濾體積（mL）100～200500～1000

B.4.3.2研磨

將樣品濾膜放置于研磨裝置（5.3）中，加入3mL～4mL丙酮溶液（4.3），研

磨至糊狀。補(bǔ)加3mL～4mL丙酮溶液（4.3），繼續(xù)研磨，并重復(fù)1～2次，保證充

分研磨5min以上。將完全破碎后的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至玻璃刻度離心管（5.5）中，

用丙酮溶液（4.3）沖洗研缽及研磨杵，一并轉(zhuǎn)入離心管中，定容至10mL。

注：葉綠素對(duì)光及酸性物質(zhì)敏感，實(shí)驗(yàn)室光線應(yīng)盡量微弱，能進(jìn)行分析操作即

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可，所有器皿不能用酸浸泡或洗滌。

B.4.3.3浸泡提取

將離心管中的研磨提取液充分振蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4℃避光浸泡

提取2h以上，不超過24h。在浸泡過程中要顛倒搖勻2～3次。

B.4.3.4離心

將離心管放入離心機(jī)（5.4），以相對(duì)離心1000×g（轉(zhuǎn)速3000r/min～4000r/min）

離心10min。然后用針式濾器（5.7）過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液（試樣）

待測(cè)。

B.4.4空白試樣的制備

用實(shí)驗(yàn)用水按照與試樣的制備（6.3）相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣的制備。

B.5分析步驟

B.5.1試樣測(cè)定

將試樣移至比色皿中，以丙酮溶液（4.3）為參比溶液，于波長750nm、664

nm、647nm、630nm處測(cè)量吸光度。750nm波長處的吸光度應(yīng)小于0.005，否則需

重新用針式濾器（5.7）過濾后測(cè)定。

B.5.2空白試驗(yàn)

按照與試樣測(cè)定（7.1）相同的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白試樣（6.4）的測(cè)定。

B.6結(jié)果計(jì)算

試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度（mg/L），按照公式（B.1）進(jìn)行計(jì)算：

1=11.85A664A7501.54A647A7500.08A630A750（B.1）

式中：1——試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；

A664——試樣在664nm波長下的吸光度值；

A647——試樣在647nm波長下的吸光度值；

A630——試樣在630nm波長下的吸光度值；

A750——試樣在750nm波長下的吸光度值。

樣品中葉綠素a的質(zhì)量濃度（μg/L），按照公式（B.2）進(jìn)行計(jì)算：

V

=11（B.2）

V

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式中：——樣品中葉綠素a的質(zhì)量濃度，μg/L；

1——試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；

V1——試樣的定容體積，mL；

V——取樣體積，L。

10

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附錄C

熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)記錄參考格式

儀器名稱證書編號(hào)

單位名稱制造廠家

規(guī)格型號(hào)出廠編號(hào)

測(cè)量范圍校準(zhǔn)依據(jù)

校準(zhǔn)日期校準(zhǔn)地點(diǎn)

環(huán)境溫度相對(duì)濕度

校準(zhǔn)人員核驗(yàn)人員

1.線性誤差

葉綠素a羅丹明B儀器測(cè)量值（μg/L）線性方程計(jì)算線性擴(kuò)展不確定度

標(biāo)準(zhǔn)濃度值標(biāo)準(zhǔn)濃度值羅丹明B濃度誤差U（k=2）

（μg/L）（μg/L）123平均值值（μg/L）（%）（%）

//

截距斜率

2.重復(fù)性

標(biāo)準(zhǔn)值測(cè)量值（μg/L）重復(fù)性

（μg/L）1234567平均值（%）

20

3.穩(wěn)定性

標(biāo)準(zhǔn)值（μg/L）20穩(wěn)定性

測(cè)量時(shí)間（min）0102030405060（%）

測(cè)量值（μg/L）

4.示值誤差

不同波長下分光光度法示值誤差

儀器測(cè)量值（μg/L）

的吸光度值測(cè)量值（μg/L）（%）

A6641

A6472

A6303

A750平均值

11

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附錄D

熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)證書內(nèi)頁參考格式

1.測(cè)量范圍：

2.線性誤差：

擴(kuò)展不確定度U（k=2）：

3.重復(fù)性：

4.穩(wěn)定性：

5.示值誤差：

分光光度法測(cè)量值（μg/L）儀器測(cè)量值（μg/L）示值誤差（%）

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附錄E

熒光法葉綠素a測(cè)定儀線性誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例

E.1概述

E.1.1被校對(duì)象：熒光法葉綠素a測(cè)定儀。

E.1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和校準(zhǔn)設(shè)備

E.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

E.1.2.2校準(zhǔn)設(shè)備：溫度計(jì)、吸量管、容量瓶。

E.1.3校準(zhǔn)方法：在儀器常用測(cè)量范圍（0.2～200）μg/L內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則

設(shè)置0.2μg/L、50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L等5個(gè)葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，

配制羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，用最小二乘法擬合羅丹明B

標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值和儀器的葉綠素a濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到儀器的線性

方程，按照方程計(jì)算出的羅丹明B濃度值與羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值進(jìn)行比較（不

包含最低濃度值），得到線性誤差。

E.1.4校準(zhǔn)環(huán)境條件：

環(huán)境溫度：5℃～40℃。

電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5)Hz。

E.2測(cè)量模型

xxisi

xi100%

xsi

式中：

xi——第i點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，μg/L；

xsi——第i點(diǎn)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；

xi——第i點(diǎn)的線性誤差，%。

E.3不確定度傳播率

各不確定度分量彼此獨(dú)立且不相關(guān)，

22222

[uc(xi)]c(xi)u(xi)c(xsi)u(xsi)

13

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

式中：

1x

，i

cxi=cxsi=-2

xsixsi

E.4標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評(píng)定

E.4.1線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值引入的不確定度分量ux()i

對(duì)5個(gè)濃度的羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各測(cè)量3次（n=3），共計(jì)15次（N=15），

測(cè)得的葉綠素a濃度示值及線性計(jì)算數(shù)據(jù)見表E.1。

表E.1羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性測(cè)量結(jié)果

葉綠素a羅丹明B儀器測(cè)量值（μg/L）線性方程計(jì)算線性

標(biāo)準(zhǔn)濃度值標(biāo)準(zhǔn)濃度值羅丹明B濃度值誤差

（μg/L）（μg/L）123平均值（μg/L）（%）

0.230.220.210.170.20//

5071552.0252.0351.9852.01717.09+0.29

1001430103.43103.49103.43103.451427.59-0.17

1502140155.65155.73155.63155.672148.860.41

2002860206.94206.90207.04206.962857.29-0.09

截距0.0925斜率0.0724

得到擬合直線的線性方程為：

yabxx=0.0925+0.0724

擬合直線的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

N

yiabxsi

si10.3407μg/L

yx/N2

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)濃度值的平均值為：xsi1429.60μg/L

以50μg/L的葉綠素a濃度點(diǎn)為例，線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值為：

xi717.09μg/L，線性誤差為：xi=0.29%。

則線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值引入的不確定度分量為：

2

xx2

syx/11isi0.340711717.091429.60

uxμg/L=3.0472μg/L

ibnNN20.072431515289659.6

xxsisi

i1

E.4.2由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度分量uc()

s

14

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

E.4.2.1有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身引入的不確定度分量uc()

rels1

由有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的證書可知，羅丹明B的濃度為1.003mg/mL，

Ukrel3%2。則由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定度為：

U3%

uc()=rel1.5%

rels1k2

E.4.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋過程引入的不確定度分量uc()

rels2

稀釋過程引入的不確定度來源主要考慮吸量管和單標(biāo)線容量瓶體積校準(zhǔn)的不確

定度和溫度對(duì)體積的影響。

依據(jù)儀器說明書，以配制對(duì)應(yīng)葉綠素a濃度為50μg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液為

例，需經(jīng)兩次稀釋，第一次稀釋用到10mL單標(biāo)線吸量管和1000mL單標(biāo)線容量瓶，

第二次稀釋需要50mL分度吸量管（吸取36mL）和500mL單標(biāo)線容量瓶。

a）玻璃量器體積校準(zhǔn)引入的不確定度分量

10mL單標(biāo)線吸量管的最大允許誤差為±0.020mL，1000mL單標(biāo)線容量瓶的最大

允許誤差為±0.40mL，50mL分度吸量管（吸取36mL）的最大允許誤差為±0.10mL，

500mL單標(biāo)線容量瓶的最大允許誤差為±0.25mL。可以認(rèn)為均勻分布，則由吸量管

或單標(biāo)線容量瓶體積校準(zhǔn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

0.020

u=100%=0.12%

1rel103

0.40

u=100%=0.023%

2rel10003

0.10

u=100%=0.16%

3rel363

0.25

u=100%=0.029%

4rel5003

b）稀釋過程中溫度變化引入的不確定度分量

在移液及定容過程中由于實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±2）℃之間變動(dòng)，引入的不確定度

通過溫度變化范圍與體積膨脹系數(shù)確定，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，因此

-4

產(chǎn)生的體積變化率為±（2×2.1×10），引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u5rel=0.024%。

15

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

因此，葉綠素a濃度為50μg/L時(shí)：

22222

urel(cs)2=u1rel+u2relu3relu4relu5rel

=(0.12%)2+(0.023%)2(0.16%)2+(0.029%)2+(0.024%)2=0.20%

22

u(cs)=urel(cs)css=urel(cs)1+urel(cs)2c

=(1.5%)22+(0.20%)715μg/L=10.8223μg/L

E.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

以上各不確定度分量彼此獨(dú)立且不相關(guān)，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

葉綠素a濃度為50μg/L時(shí)：

11-1

cxi===0.001399(μg/L)，

xsi715μg/L

xi717.09μg/L-1

cxsi=-2==0.001403(2μg/L)

xsi(715μg/L)

2222

uc(xi)c(xi)u(xi)c(xsi)u(xsi)

-1222-12

=0.001399(μg/L)（3.0472μg/L）0.001403(μg/L)（10.8223μg/L）=1.6%

同理，葉綠素a濃度為100μg/L時(shí)：uxc()i1.6%

葉綠素a濃度為150μg/L時(shí)：uxc()i1.5%

葉綠素a濃度為200μg/L時(shí)：ux()1.5%

ci

E.6擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度為：

葉綠素a濃度為50μg/L時(shí)：Ukuc(xi)21.6%=3.2%（k=2）

葉綠素a濃度為100μg/L時(shí)：Ukuc(xi)21.6%=3.2%（）

葉綠素a濃度為150μg/L時(shí)：Ukuc(xi)21.5%=3.0%（）

葉綠素a濃度為200μg/L時(shí)：Uku(x)21.5%=3.0%（）

ci

16

202X

-

XXXX

（滬蘇浙皖）

JJF

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

目錄

引言·····················································································II

1范圍·······················································································1

2引用文件·················································································1

3概述·······················································································1

4計(jì)量特性·················································································1

5校準(zhǔn)條件·················································································2

5.1環(huán)境條件···············································································2

5.2測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備································································2

6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法··································································2

6.1線性誤差···············································································2

6.2重復(fù)性··················································································3

6.3穩(wěn)定性··················································································3

6.4示值誤差···············································································4

7校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)···········································································4

8復(fù)校時(shí)間間隔···········································································4

附錄A標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法·······························································6

附錄B葉綠素a參考測(cè)定方法（分光光度法）·····································7

附錄C熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)記錄參考格式································11

附錄D熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)證書內(nèi)頁參考格式·························11

附錄E熒光法葉綠素a測(cè)定儀線性誤差測(cè)量不確定度評(píng)定示例··············13

I

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

熒光法葉綠素a測(cè)定儀校準(zhǔn)規(guī)范

1范圍

本規(guī)范適用于測(cè)量范圍（0.2～200）μg/L的基于熒光法的葉綠素a測(cè)定儀的校

準(zhǔn)。

2引用文件

本規(guī)范引用了下列文件：

GB/T14581-1993水質(zhì)湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ494-2009水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)

HJ897-2017水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法

HJ/T91-2002地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用

文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。

3概述

熒光法葉綠素a測(cè)定儀（以下簡稱儀器）基于葉綠素a的熒光誘導(dǎo)技術(shù)，通過

發(fā)射特定波長的光照射水體，激發(fā)水體中的葉綠素a產(chǎn)生特定波長的熒光，熒光強(qiáng)

度與葉綠素a的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，從而得到葉綠素a的濃度值。儀器一般

由光源、檢測(cè)器、指示器三部分組成，其原理示意圖如圖1所示。

光源檢測(cè)器指示器

圖1儀器原理示意圖

4計(jì)量特性

儀器的計(jì)量特性要求見表1。

表1計(jì)量特性要求

校準(zhǔn)項(xiàng)目計(jì)量特性要求

線性誤差±10%

重復(fù)性≤5%

穩(wěn)定性≤5%/h

1

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

示值誤差±20%

以上計(jì)量特性要求僅供參考，不作為判定依據(jù)。

5校準(zhǔn)條件

5.1環(huán)境條件：

環(huán)境溫度：5℃～40℃。

電源電壓及頻率：AC(220±22)V，(50±0.5)Hz。

5.2測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備：

5.2.1羅丹明B有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：相對(duì)擴(kuò)展不確定度不大于3%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)溶液的

配置方法見附錄A。

5.2.2吸量管、容量瓶：A級(jí)。

5.2.3《HJ897-2017水質(zhì)葉綠素a的測(cè)定分光光度法》第4章及第5章中使用的

其它試劑及設(shè)備。

6校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法

6.1線性誤差

在儀器常用測(cè)量范圍內(nèi)，按照均勻取點(diǎn)的原則設(shè)置5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)配制對(duì)應(yīng)不同葉

綠素a濃度的羅丹明B系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，如在（0.2～200）μg/L范圍，標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)為0.2μg/L、

50μg/L、100μg/L、150μg/L、200μg/L。分別進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，用最小二乘法擬

合羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值和儀器的葉綠素a濃度示值平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到

儀器的線性方程，見公式（1）。

yabx（1）

式中：

y——儀器測(cè)得的葉綠素a濃度值，μg/L；

a——截距；

b——斜率；

x——羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L。

2

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

按公式（2）計(jì)算各測(cè)量點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，按照公式（3）計(jì)

算線性誤差（不包含最低濃度點(diǎn)），取結(jié)果絕對(duì)值最大值為儀器的線性誤差校準(zhǔn)結(jié)

果。

ya

xi（2）

ib

xxisi

xi100%（3）

xsi

式中：

yi——第i點(diǎn)的儀器測(cè)得葉綠素a濃度的平均值，μg/L；

xi——第i點(diǎn)線性方程計(jì)算的羅丹明B濃度值，μg/L；

xsi——第i點(diǎn)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，μg/L；

xi——第i點(diǎn)的線性誤差，%。

6.2重復(fù)性

選用對(duì)應(yīng)葉綠素a濃度為20μg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)量7次。按公式（4）

和公式（5）分別計(jì)算測(cè)量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，按公式（6）計(jì)算儀器重復(fù)性：

7

ci

c=i1（4）

7

7

2

()cci

s=i1（5）

71

s

s=100%（6）

rc

式中：

ci——儀器第i次測(cè)得值，μg/L；

c——7次測(cè)量值的平均值，μg/L；

s——單次測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，μg/L，

sr——儀器重復(fù)性，%。

6.3穩(wěn)定性

3

JJF（滬蘇浙皖）XXXX—202X

選用對(duì)應(yīng)葉綠素a濃度為20μg/L的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。記錄初始測(cè)量

值c0，之后每隔10min測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定1h，記錄儀器測(cè)量值ci，按公式（7）

計(jì)算儀器穩(wěn)定性：

cc

S=100%i0max（7）

c0

式中：

S——儀器穩(wěn)定性，%；

——每10min測(cè)得值，μg/L；