高效液相色譜法新

高效液相色譜法新第10章高效液相色譜法13.1HPLC概述13.2HPLC分類與基本原理13.3各類高效液相色譜法13.4固定相13.5流動相13.6高效液相色譜儀13.7定性、定量分析方法13.8應(yīng)用與示例第2頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述1.基本概念與特點2.HPLC與經(jīng)典LC的比較3.HPLC儀器結(jié)構(gòu)第3頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述概念：高效液相色譜法是在20世紀60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液泵和高靈敏度在線檢測器，從而發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。特點：適范圍廣、分離性能好、分析速度快、流動相可選擇范圍寬、靈敏度高、操作自動化等。1.基本概念與特點2.HPLC與經(jīng)典LC的比較3.HPLC儀器結(jié)構(gòu)第4頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述HPLC與經(jīng)典LC的比較一覽表經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓高壓，40～50MPa填料顆粒大填料顆粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000塊/m分析速度慢分析速度快色譜柱只用一次色譜柱可重復(fù)多次使用不能在線檢測能在線檢測1.基本概念與特點2.HPLC與經(jīng)典LC的比較3.HPLC儀器結(jié)構(gòu)第5頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.1HPLC概述HPLC儀器結(jié)構(gòu)示意圖1.基本概念與特點2.HPLC與經(jīng)典LC的比較3.HPLC儀器結(jié)構(gòu)第6頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分類與基本原理化合物的極性、電荷、分子大小、旋光性四種主要性質(zhì)，化合物這些性質(zhì)的差異是引起高效液相色譜分離本質(zhì)性原因，對應(yīng)著分配色譜、離子交換色譜、空間排阻色譜、手性色譜等分離方法。1.方法分類2.基本原理第7頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.2方法分類與基本原理HPLC與GC在基本原理、概念和方法基本上相同，主要差別是流動相的性質(zhì)不同。因此，某些公式的表現(xiàn)形式或參數(shù)的含意有些差別。(1)HPLC中的vanDeemter方程表現(xiàn)形式：H=A+Cu1.方法分類2.基本原理第8頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分類與基本原理3145uHPLCGCH2圖10-2流動相的流速對GC與HPLC柱效影響對比(2)HPLC中渦流擴散和傳質(zhì)阻力對柱效的影響1.方法分類2.基本原理第9頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.2HPLC分類與基本原理(3)HPLC分離條件選擇①采用小顆粒、窄粒度分布的球形固定相、首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱；②采用低黏度流動相、低流速(1mL/min)；③柱溫保持在25-30℃為宜。1.方法分類2.基本原理第10頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法13.3.1液-固吸附色譜法13.3.2液-液分配色譜法13.3.3化學(xué)鍵合色譜法13.3.4其他色譜法第11頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法>>

13.3.1液-固吸附色譜法分離機理吸附色譜法是被分離的組分分子與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心，靠組分分子的吸附系數(shù)的差異而分離。在吸附色譜中，選擇使用條件使組分間的分配系數(shù)K產(chǎn)生差別，以達到分離的目的。由于表面積S不易測，而k=KS/Vm，因此常用k代替K來填料問題。第12頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法>>

13.3.1液-固吸附色譜法影響容量因子的因素以硅膠吸附劑為例(1)硅膠的活性硅膠必須保持干燥，遇水會失活，烘干可再生。使用硅膠柱進行色譜分離時，必須使用不含水的流動相。硅膠活性越大，k越大，tR越長。(2)溶劑的極性與硅膠吸附劑配套的流動相，是以烷烴為底劑加適當(dāng)極性調(diào)整劑，組成二元或多元溶劑系統(tǒng)。溶劑的極性越大，k越小，tR越短。(3)容量因子序組分的極性越大，在硅膠吸附劑表面的保留作用(親和力)就越強，k越大，tR越長。第13頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法>>

13.3.2液-液分配色譜法分離機理：分配色譜法是由于樣品組分溶入固定相與流動相達到“平衡”后分配系數(shù)的差別而分離。不同組分在固定相與流動相中的溶解度差別越大(K、k差別也大)分離效果越好。正相液-液色譜法：極性：流動相＜固定相。極性小的組分先出峰、極性大的組分后出峰。反相液-液色譜法：極性：流動相＞固定相。極性大的組分先出峰、極性小的組分后出峰。第14頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法將固定液的官能團鍵合在載體的表面就構(gòu)成了化學(xué)鍵合相，以此為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法(bondedphasechromatography，BPC)?；瘜W(xué)鍵合相既有分配作用，又有吸附作用，應(yīng)用廣泛硅膠內(nèi)部十八烷基硅烷鍵合相ODS硅膠表面硅膠內(nèi)部第15頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法離子對色譜法離子抑制色譜法第16頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法固定相：極性大的化學(xué)鍵合相，如氰基、氨基化學(xué)鍵合相；流動相：極性小的烷烴(正己烷)加適量極性調(diào)整劑構(gòu)成。分離機理主要靠范德華力(定向、誘導(dǎo))或氫鍵作用力的差別而分離。流動相的極性與容量因子的關(guān)系流動相極性增大，洗脫能力增加，k減小、tR減小。第17頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法反相鍵合相色譜法RBPC典型的RBPC：非極性鍵合固定相＋極性流動相組成。固定相：ODS；流動相：甲醇-水，乙腈-水。非典型RBPC：弱極性或中等極性鍵合相＋極性大于固定相的流動相組成。分離機理疏溶劑理論、雙保留理論、頂替吸附-液相相互作用模型等。流動相的極性與容量因子的關(guān)系流動相的極性增大，對組分的洗脫能力降低，k增大、tR增大；反之，k減小、tR減小。第18頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法離子對色譜法有正相、反相之分，常用反相的。反相離子對色譜法：由于離子型化合物在非極性固定相中的溶解度很小，幾乎沒有保留作用。為此，加入與其帶相反電荷的離子對試劑，生成不荷電的中性離子對，而中性離子對在非極性固定相中的溶解度大大增加，分配系數(shù)增大，分離效果明顯得到改善。這種方法被稱為反相離子對色譜法。實現(xiàn)方法：用ODS柱，在流動相甲醇-水或乙腈-水中加入0.003~0.01mol/L的RPIC試劑即可。離子對試劑PIC價格較貴分離堿類-烷基磺酸鹽；分離酸-四丁基季銨鹽。第19頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法離子對色譜法分離機理以分離堿類為例分配系數(shù)其K除與RHPLC有相同的影響規(guī)律外，還與PIC試劑的碳鏈長度有關(guān)，鏈增長K增大。第20頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法

13.3.3化學(xué)鍵合相色譜法離子抑制色譜法弱酸、弱堿組分容易解離，在非極性固定相中的溶解性很差，可通過調(diào)節(jié)流動相pH來抑制它們的解離，使之以分子的形式存在，從而增加它在固定相中的溶解度，增加保留作用，以達到分離目的。適用范圍pKa：3~7的弱酸，7~8的弱堿抑制劑乙酸、甲酸、氨水、磷酸鹽、乙酸鹽等。容量因子及其影響因素除與RHPLC有相同影響因素外，主要受流動相pH的影響。對于弱酸，流動相的pH＜pKa時，抑制解離，k增大、tR增大；流動相的pH＞pKa時，利于解離，k減小、tR減小。對于弱堿，情況相反。第21頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.3各類高效液相色譜法>>

13.3.5其他色譜法(閱讀)離子色譜法手性色譜法環(huán)糊精色譜法膠束色譜法親和色譜第22頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.4固定相13.4.1液-固色譜固定相13.4.2化學(xué)鍵合相13.4.3其他固定相第23頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.4固定相

13.4.1液-固色譜固定相硅膠：無定形全多孔硅膠、球形全多孔硅膠、堆積硅珠、灌注微粒硅膠、硅-碳雜化硅膠、硅聚合物薄膜型硅膠。高分子多孔微球：有機膠，由苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)而成。分離機理主要為吸附作用，兼有分配及空間排阻作用，其表面為芳烴官能團(非極性)，流動相為極性溶劑，相當(dāng)于反相洗脫。第24頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.4固定相>>

13.4.2化學(xué)鍵合相用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液的官能團鍵合在載體表面上，所形成的填料稱為化學(xué)鍵合相。優(yōu)點：使用過程不流失；化學(xué)性能穩(wěn)定(pH=2~8)；熱穩(wěn)定性好(＜70℃)；載樣量大；適于梯度洗脫。用于鍵合相的載體一般為硅膠，它具有分配作用及一定的吸附作用。吸附作用的大小視鍵合覆蓋率而定，完全覆蓋則稱為封尾，封尾鍵合相只有分配作用沒有吸附作用，強疏水性是其缺點。依據(jù)鍵合相官能團極性的大小，分為三類：非極性鍵合相、中等極性鍵合相和極性鍵合相。第25頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.4固定相>>

13.4.3其他固定相離子交換劑凝膠手性固定相親和色譜固定相第26頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相13.5.1分離方程式13.5.2Snyder溶劑分類13.5.3正相洗脫與反相洗脫13.5.4洗脫方式13.5.5溶劑系統(tǒng)選擇第27頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.1分離方程式在GC中，α與k主要分別受固定相性質(zhì)與柱溫的影響。在HPLC中，α主要受溶劑種類的影響；在溶劑的組成確定以后，k主要由溶劑的配比所左右。選擇溶劑系統(tǒng)是以獲得較大α與適宜k值，而使k與tR合乎要求為目的。HPLC對流動相的基本要求：不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；對樣品有適宜的溶解度，要求k在1~10范圍(2~8最佳)；黏度小；與檢測器相適應(yīng)。第28頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.2Snyder溶劑分類組分的分配系數(shù)，由樣品組分、溶劑、固定相三者的分子間作用力綜合作用所決定。Snyder選用了3個參考物以檢驗3種分子間作用力，測定、計算出溶劑的極性參數(shù)值，值大的溶劑極性大，洗脫能力大。表10-2參考物與被檢溶劑的作用力關(guān)系參考物被檢溶劑的作用力類型乙醇(質(zhì)子給予體)質(zhì)子受體作用力(Xe)二氧六環(huán)(質(zhì)子受體)質(zhì)子給予作用力(Xd)硝基甲烷(強偶極)強偶極作用力(Xn)第29頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.2Snyder溶劑分類表13-3常用溶劑的極性參數(shù)P’與分子間作用力溶劑P’XeXdXn苯2.70.230.320.45乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53正丙烷4.00.530.210.26四氫呋喃4.00.380.200.42氯仿4.10.250.410.33乙醇4.30.520.190.29乙酸乙酯4.40.340.230.43丙酮5.10.350.230.42甲醇5.10.480.220.31乙腈5.80.310.270.42乙酸6.00.390.310.30水10.20.370.370.25第30頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.3正相洗脫與反相洗脫正相洗脫：流動相的極性小于固定相的洗脫方式。正相洗脫溶劑一般為多元溶劑系統(tǒng)，洗脫能力以極性參數(shù)P’來表示。反相洗脫：在反相洗脫中，溶劑的洗脫能力用強度因子S來衡量。S值越大洗脫能力越強。水在正相色譜中洗脫能力最強，但在反相色譜中洗脫能力最弱，所以一般以水為底劑，再加甲醇、乙腈、四氫呋喃的某一種組成二元溶劑系統(tǒng)。表13-5反相洗脫溶劑的強度因子S值溶劑水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃S值03.03.23.43.53.64.24.5組別ⅧⅡⅥⅥⅥⅡⅡⅢ第31頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.4洗脫方式等度洗脫：恒定配比的溶劑系統(tǒng)的洗脫方式，是常用洗脫方式，方法簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生，對復(fù)雜樣品分離不理想。梯度洗脫：在一個分析周期內(nèi)，按一定程序不斷改變流動相濃度配比的洗脫方式，適合于對復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異很大的組分的分離。優(yōu)點：縮短分析周期、提高分離效果、改善峰形減小拖尾、增加檢測靈敏度等。第32頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.4洗脫方式Fig.4.

Chromatogramsofseparationofetherfunc-tionalizedimidazoliumionicliquids.(醚功能化的咪唑類離子液體的色譜分離)A.Isocraticelution(等度洗脫),mobilephase10%CH3CN/10

mMNaH2PO4/H3PO4,pH5.0.B.Gradientelution(梯度洗脫).Theconcentrationratioofacetonitriletobuffersolutionatthegradientchanged(乙腈梯度緩沖液的濃度比變化):0

min,0%,CH3CN；3–6

min,2%CH3CN；12–20

min,5%CH3CN；20–40

min,10%CH3CN。Column:AlltechMixed-ModeRP-C18/Cation100Acolumn(250

mm

×

4.6

mmI.D.,5

μm).Sampleconcentrationinmobilephase:0.5

mg·mL?1.1–[C2OHmim][Cl],2–[C6O2OHmim][Cl],3–[C3Omim][Cl],4–[C5O2mim][Cl],5–[C4Omim][Cl],6–[C2OAllymim][Cl],7–[C7O3mim][Cl],8–[C2OBzmim][Cl].第33頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.4洗脫方式比較GC的程序升溫和HPLC的梯度洗脫程序升溫：通過改變溫度來影響溶質(zhì)的K值，用于分離寬沸程的混合樣品。梯度洗脫：通過改變流動相的強度因子、pH值等來影響溶質(zhì)的K值，用于分離組分性質(zhì)(極性)差別較大的復(fù)雜樣品。第34頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.4洗脫方式問題：如何區(qū)分“正相洗脫/反相洗脫”與“等度洗脫/梯度洗脫”兩組概念？以流動相與固定相的相對極性大小來分類：流動相極性小于固定相極性的洗脫方式，稱為正相洗脫；流動相極性大于固定相極性的洗脫方式，稱為反相洗脫。以流動相本身的配比是否有變化來分類：流動相的溶劑配比恒定的洗脫方式，稱為等度洗脫；流動相的溶劑配比，在一個周期內(nèi)按一定程序不斷改變的洗脫方式，稱為梯度洗脫。第35頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.5流動相>>

13.5.4溶劑系統(tǒng)選擇溶劑選擇的一般原則首選溶劑多元溶劑選擇的組成溶劑系統(tǒng)對樣品的洗脫能力替代溶劑系統(tǒng)離子抑制色譜法第36頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.6高效液相色譜儀13.6.1輸液泵13.6.2進樣器與色譜柱13.6.3檢測器13.6.4超高效液相色譜儀HPLC儀組成部件：輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器及工作站等。第37頁,共47頁，2024年2月25日，星期天13.6高效液相色譜儀>>

13.6.1輸液泵輸液泵是實施流動相輸送任務(wù)的部件。按輸出液體情況，分為恒壓泵和恒流泵(螺旋泵/往復(fù)泵)。柱塞往復(fù)泵：圖示梯度洗脫裝置：按多元流動相加壓與混合順序，分為高壓梯度(加壓-混合-輸出)與低壓梯度(混合-加壓-輸出