基因克隆載體

關(guān)于基因克隆載體定義 基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的“運(yùn)載工具”。也稱DNA克隆載體。必備條件1、克隆位點(diǎn)(一個或多個)2、能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞:能自我復(fù)制，或整入染色體隨受體細(xì)胞DNA復(fù)制而復(fù)制。3、有選擇克隆子的標(biāo)記基因4、安全性(不含損害受體的基因,不任意轉(zhuǎn)入別的,尤其人的細(xì)胞)意義：基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。第2頁,共147頁，2024年2月25日，星期天按克隆載體的來源分： 質(zhì)粒～ 病毒或噬菌體～ 質(zhì)粒與病毒或噬菌體DNA組成的～ 質(zhì)粒與染色體DNA片段組成的～按應(yīng)用范圍分：表達(dá)型～啟動子探針型～

cDNA～按應(yīng)用對象分：原核生物～植物～動物～

分類第3頁,共147頁，2024年2月25日，星期天３.１質(zhì)粒克隆載體 定義：以質(zhì)粒DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫和cDNA基因文庫。一、質(zhì)粒適于載體構(gòu)建的性質(zhì)１、組成與構(gòu)型是染色體外裸露的雙鏈DNA分子（細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、綠藻）第4頁,共147頁，2024年2月25日，星期天構(gòu)型：l-DNAoc-DNAccc-DNA第5頁,共147頁，2024年2月25日，星期天２、分子大?。?100～102kb３、復(fù)制特點(diǎn)：在宿主細(xì)胞內(nèi)； 單向； 質(zhì)粒和宿主細(xì)胞雙重遺傳系統(tǒng)控制

第6頁,共147頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制(Replication)

質(zhì)粒的復(fù)制起始和拷貝數(shù)是由質(zhì)粒DNA序列控制的。質(zhì)粒分子中為質(zhì)粒復(fù)制所必需的最小區(qū)段稱為基本復(fù)制子，它由兩部分組成，一是復(fù)制原點(diǎn)(ori)，二是調(diào)節(jié)復(fù)制起始的基因（編碼蛋白質(zhì)或RNA)。第7頁,共147頁，2024年2月25日，星期天復(fù)制強(qiáng)度：拷貝數(shù)（細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒與染色體數(shù)量之比值）（１）每種質(zhì)粒在其宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)相對穩(wěn)定 嚴(yán)緊控制型：1~數(shù)個拷貝；大質(zhì)粒 松馳控制型：10個以上拷貝；小質(zhì)粒。經(jīng)氯霉素處理，宿主中質(zhì)粒大量擴(kuò)增（如ColE1拷貝數(shù)達(dá)3000個）。第8頁,共147頁，2024年2月25日，星期天４、質(zhì)粒的不親合性親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒 不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒５、質(zhì)粒遷移（１）接合質(zhì)粒：含tra基因→合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛）→質(zhì)粒DNA入受體細(xì)胞 含tra基因的質(zhì)粒稱為接合質(zhì)粒。如F、Ti等 不含tra基因的質(zhì)粒稱為非接合質(zhì)粒。如ColE1、pPbS等第9頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（２）遷移作用 不含tra基因而含bom（oriＴ）位點(diǎn)的質(zhì)粒，當(dāng)宿主細(xì)胞存在輔助質(zhì)粒mob基因產(chǎn)物時，即可打開oriＴ位點(diǎn)，非結(jié)合質(zhì)粒借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物而遷移入受體細(xì)胞。這種現(xiàn)象稱～質(zhì)粒的遷移作用第10頁,共147頁，2024年2月25日，星期天６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒。顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒：含有氨芐青霉素Ap、氯霉素Cm、卡那霉素Km、四環(huán)素Tc、鏈霉素Sm等藥物的抗性基因，可作為選擇標(biāo)記。

Col質(zhì)粒 Ｆ質(zhì)粒 降解質(zhì)粒 Ｔi質(zhì)粒隱蔽質(zhì)粒 藍(lán)藻內(nèi)源質(zhì)粒第11頁,共147頁，2024年2月25日，星期天二、理想質(zhì)粒載體的必備條件１、能進(jìn)行有效復(fù)制——復(fù)制起始位點(diǎn)（最好是多拷貝）２、克隆位點(diǎn)——組裝MCS連桿３、選擇標(biāo)記基因——抗性基因，LacZ’基因４、分子盡可能?。ㄞD(zhuǎn)化率高），＞15kb，轉(zhuǎn)化率↓↓５、組裝各種“元件”，如啟動子、終止子等第12頁,共147頁，2024年2月25日，星期天三、質(zhì)粒載體構(gòu)建過程：嚴(yán)密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)→構(gòu)建（切割、修飾和連接重組）構(gòu)建原則

1、選用合適的出發(fā)質(zhì)粒：含必備的元件，如ori、選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、啟動子和終止子

2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件

3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因

4、選用合適的啟動子

5、構(gòu)建過程力求簡單代表性實(shí)例。第13頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（一）pBR322及其衍生質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建Ⅰ、pBR322構(gòu)建質(zhì)粒載體命名法則 “pBR322” p：質(zhì)粒（plasmid) BR：兩位主要構(gòu)建者

322：實(shí)驗(yàn)編號

pSC101（最早用于DNA克隆的載體），嚴(yán)緊型

ColE1

松馳型，篩選系統(tǒng)復(fù)雜

第14頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共147頁，2024年2月25日，星期天構(gòu)建過程(出發(fā)質(zhì)粒：pMB1)第16頁,共147頁，2024年2月25日，星期天R1（沙門氏菌中分離）變異

R1drd19（含易位子Tn3Apr）

R1drd19Tn3pSF2124 ColE1pBR322的三個親本：pMB1、pSF2124、pSC101識別位點(diǎn)：

Apr基因區(qū)（3個）：PstⅠ、ScaⅠ、PvuⅠ Tcr基因區(qū)（7個）：BamHⅠ、ScalⅠ、EcoRⅤ、 SphⅠ、NheⅠ、NruⅠ、XmaⅢ Tcr啟動子區(qū)（2個）：ClaⅠ、HindⅢpBR322分子大小：4363bp第17頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共147頁，2024年2月25日，星期天3、優(yōu)點(diǎn)（1）較小的分子量

10kb以內(nèi)DNA分子純化過程中可避免斷裂，pBR322易于自身純化，且可克隆6kb左右的外源DNA（2）較高的拷貝數(shù) 經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)培后達(dá)1000～3000copys/cell（3）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇標(biāo)記。插入失活（圖解）第20頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共147頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ、pUC18/19質(zhì)粒載體與pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個DNA片段（lacZ`基因）替換Tcr基因；組裝了一個多克隆位點(diǎn)（MCS）連桿命名pUC——UniversityofCalifornia的科學(xué)家首先構(gòu)建。圖3-3。

pUC包括四個組成部分： （1）pBR322的復(fù)制起點(diǎn)(ori)

（2）Apr基因，但DNA序列發(fā)生變化，不再含原來限制性核酸內(nèi)切識別位點(diǎn)（3）lacZ`基因（4）在lacZ`基因內(nèi)部靠近5`端有一段MCS連桿第22頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共147頁，2024年2月25日，星期天4、pBR322衍生的質(zhì)粒

缺失bom位點(diǎn)→pBR325、pBR327，不具被動遷移作用 再移去HaeⅡ片段→pAT153

均更安全第24頁,共147頁，2024年2月25日，星期天LacZ`篩選機(jī)制：

含乳糖操縱子的啟動子、調(diào)節(jié)因子和

β-半乳糖苷酶的N端146殘基(α-肽)合成有活性的基因（lacZ`）的質(zhì)粒載體引入可編β-半乳糖苷酶碼C端部分殘基的宿主(與LacZ`互補(bǔ)的大腸桿菌)

在含IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和

X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）藍(lán)色菌落 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)在N端α-肽的編碼區(qū)插入MCS不影響lacZ`基因功能插入外源DNA滅活lacZ`基因白色菌落第25頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共147頁，2024年2月25日，星期天pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) （1）分子量更小、拷貝數(shù)更高 （2）免疫組化法一步實(shí)現(xiàn)篩選鑒定重組體，省時 （3）MCS區(qū)方便轉(zhuǎn)移外源DNA在不同載體系列中“穿梭”，使具有兩種不同粘末端的外源DNA

能直接克隆入pUC載體第27頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）藍(lán)藻質(zhì)粒克隆載體pPKE2的構(gòu)建 大腸桿菌質(zhì)粒不能轉(zhuǎn)化藍(lán)藻 藍(lán)藻內(nèi)的質(zhì)粒屬隱蔽質(zhì)粒即：大腸桿菌源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)+藍(lán)藻源質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)。

pPbs（1511bp）

pPbs ClaⅠ

重組

pPRS-1多次亞克隆pPKE-2 pBR322組裝CaMV35s啟動子、MCS、rbcS終止子、Kmr基因（圖3-5）↑構(gòu)建穿梭質(zhì)粒第28頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（三）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建

Ti質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌中引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤）的質(zhì)粒，故稱Tumorinducingplasmid（Ti質(zhì)粒）。雙鏈環(huán)狀DNA分子，200～250kb。

1、4個功能區(qū)：T-DNA區(qū)、Vir區(qū)、Con區(qū)、Ori區(qū)

（1）T-DNA區(qū)

Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的約25kb部分，即T-DNA（transferDNA)。左右邊界各有一個25bp正向重復(fù)序列（LTS和RTS）稱為邊界序列，為T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合所必需。只要保留T-DNA的邊界序列，中間序列被外源DNA片段替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中。這是Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。用野生型Ti質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉(zhuǎn)基因植物。第30頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（2）Vir區(qū) 位于T-DNA區(qū)上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，顯示致瘤性。（3）Con區(qū) 含有農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因（tra)，可受宿主產(chǎn)生的冠癭堿活化，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，也即接合轉(zhuǎn)移基因編碼區(qū)。（4）Ori區(qū) 復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。

Ti質(zhì)粒克隆載體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。第31頁,共147頁，2024年2月25日，星期天2、構(gòu)建途徑（1）取代型載體。用大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體取代Ti質(zhì)粒的全部或部分T-DNA序列而構(gòu)建。外源基因以同源交換而重組。

Onc-

Ti：T-DNA上的onc基因被取代而構(gòu)建。

Onc+

Ti：pBR322取代T-DNA的部分序列但保留onc基因而構(gòu)建。進(jìn)入植物細(xì)胞誘發(fā)冠癭瘤。第32頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（2）中間質(zhì)?？寺≥d體

T-DNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構(gòu)建。 共整合克隆載體系統(tǒng)（T-DNA同源序列、bom位點(diǎn)） 雙元克隆載體系統(tǒng)——微型Ti質(zhì)粒第33頁,共147頁，2024年2月25日，星期天3．2病毒（噬菌體）克隆載體病毒基本結(jié)構(gòu)：

DNA（或RNA）+外殼蛋白感染細(xì)菌的病毒，稱為噬菌體。分類（根據(jù)病毒與宿主的關(guān)系）： 溫和性病毒：

溶原性增殖→構(gòu)建病毒載體 烈性病毒：

溶菌性增殖→改造后第34頁,共147頁，2024年2月25日，星期天噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱，英文名叫做Bacteriophage（簡稱phage）。它的DNA分子除了復(fù)制起點(diǎn)之外，還有編碼外殼蛋白質(zhì)的基因。如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA。噬菌斑，即感染的細(xì)菌細(xì)胞被噬菌體裂解之后留下的空斑。

第35頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共147頁，2024年2月25日，星期天分離重組體噬菌體的基本過程首先是使用無菌消毒的金屬接種針，粘著少量的噬菌體顆粒，轉(zhuǎn)移到新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)基中，使其在感染的細(xì)胞內(nèi)大量地增殖。采用密度梯度離心法，便可非常容易地純化出噬菌體的顆粒。第38頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共147頁，2024年2月25日，星期天一、

λ噬菌體克隆載體λ噬菌體，一種大腸桿菌雙鏈RNA噬菌體。λ噬菌體的分子量為31×106dal，是一種中等大小的溫和噬菌體。第40頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體基因組的結(jié)構(gòu)

在λ噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的5′單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。注入到感染寄主細(xì)胞內(nèi)的λ噬菌體的線性DNA分子，會迅速地通過粘性末端之間的互補(bǔ)作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5′-P和3′-OH基團(tuán)封閉起來，并進(jìn)一步超盤旋化。這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點(diǎn)（略語cos，系英語cohesive-endsite的縮寫，即粘性末端位點(diǎn)之意）第41頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體克隆載體（一）λ噬菌體性質(zhì)λDNA+外殼蛋白1、λDNA(48.5kb)噬菌體中：線性宿主細(xì)胞：環(huán)狀(cos位點(diǎn))第42頁,共147頁，2024年2月25日，星期天迄今已經(jīng)定位的λ噬菌體的基因至少有61個，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動，我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的必要基因；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱這類基因?yàn)棣耸删w的非必要的基因（介于基因J和基因N之間）。第43頁,共147頁，2024年2月25日，星期天2、λ噬菌體基因組有基因50個以上 第44頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體DNA的復(fù)制在λ噬菌體感染的早期，環(huán)形的λDNA分子按θ形式從雙向進(jìn)行復(fù)制。到了感染的晚期，控制滾環(huán)復(fù)制機(jī)理的開關(guān)被啟動了，合成出了由一系列線性排列的長多連體分子。

第45頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)譯在溶菌周期，λ噬菌體DNA的轉(zhuǎn)錄是在三個時期，即早期、中期和晚期發(fā)生的。大體的情況是，早期基因轉(zhuǎn)錄確立起溶菌周期；中期基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)果導(dǎo)致DNA進(jìn)行復(fù)制和重組；晚期基因的轉(zhuǎn)錄最終使DNA被包裝為成熟的噬菌體顆粒。第46頁,共147頁，2024年2月25日，星期天3、限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn):56種4、λ噬菌體的生長途徑

溶菌生長途徑

溶原生長途徑→某種脅迫條件下→合成six

基因產(chǎn)物→λDNA脫離細(xì)菌染色體→溶菌第47頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）構(gòu)建依據(jù)1、λ噬菌體是一種溫和噬菌體2、能承載較大的外源DNA片段

λDNA頭部可包裝約36.4～51kb(自身的75%～105%)，且約有20kbλDNA可缺失（生長非必需）3、在λDNA上有多種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（三）構(gòu)建的基本策略與技術(shù)路線（P54）策略:

切去部分非必需區(qū)，刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，插入選擇性標(biāo)記基因，建立體外包裝系統(tǒng)。第48頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體載體的構(gòu)建及其主要類型插入型載體（insertionvectors），只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。替換型載體（rePlacementvectors），具有成對的克隆位點(diǎn)，在這兩個位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。第49頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共147頁，2024年2月25日，星期天在基因克隆中的二者的用途不盡相同。插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內(nèi)）的外源DNA片段的插入，廣泛應(yīng)用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA。第52頁,共147頁，2024年2月25日，星期天插入型載體外源的DNA克隆到插入型的λ載體分子上，會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。插入型的λ載體又可以分為免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活的（inactlvatlonofE．coliβ-galactosidase）兩種亞型。

第53頁,共147頁，2024年2月25日，星期天免疫功能失活的插入型載體在這類插入型載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入到這種位點(diǎn)上時，就會使載體所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破壞，而不能進(jìn)入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的λ重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。

第54頁,共147頁，2024年2月25日，星期天β-半乳糖苷酶失活的插入型載體它們的基因組中含有一個大腸桿菌的lac5區(qū)段，其中編碼著β半乳糖著酶基因lacZ。由這種載體感染的大腸桿菌lac-指示菌，涂布在補(bǔ)加有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍(lán)色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了β-半乳糖著酶基因lacZ的編碼序列，不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑。

第55頁,共147頁，2024年2月25日，星期天替換型載體替換型載體又叫做取代型載體（substitutionvector），是一類在λ噬菌體基礎(chǔ)上改建的、在其中央部分有一個可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。

第56頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λNM781便是其中的一個代表。在這個替換型載體中，可取代的EcoRI片段，編碼有一個supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因）,由于這種λNM781噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了，能在乳糖麥康基氏（MacConkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍(lán)色的噬菌斑。如果這個具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述這兩種指示培養(yǎng)基上都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。

第57頁,共147頁，2024年2月25日，星期天替換型載體克隆外源DNA的步驟應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化λ載體，除去基因組中可取代的DNA區(qū)段。將上述所得的人DNA臂同外源DNA片段連接。對重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體。

第58頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ重組體DNA分子的體外包裝λ重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用λDNA的體外包裝λ噬菌體DNA的包裝限制問題第59頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用用λ重組體DNA分子直接感染大腸桿菌，使之侵入寄主細(xì)胞內(nèi)。這種由寄主細(xì)胞捕獲裸露的噬菌體DNA的過程叫做轉(zhuǎn)染（transfection），它有別于以噬菌體顆粒為媒介的轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。λDNA的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過程。即便是使用未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的λDNA，其典型的轉(zhuǎn)染效率（即每微克λDNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目），也僅為105～106之間。體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了104～103左右。

第60頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λDNA的體外包裝λDNA的體外包裝作用，在離體條件下，將重組體DNA包入噬菌體等病毒顆粒中的過程，以形成有功能的病毒載體。根據(jù)體外互補(bǔ)作用研究發(fā)現(xiàn)，λ噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進(jìn)行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。這就是噬菌體體外包裝所依據(jù)的基本原理。第61頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第62頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體DNA的包裝限制問題λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力是有一定限度的。上限不得超過其正常野生型DNA總量的5％左右，而低限又不得少于正常野生型DNA總量的75％。按野生型λDNA分子長度為48kb計(jì)算，λ噬菌體的包裝上限是51kb。編碼必要基因的DNA區(qū)段占28kb，因此λ載體克隆外源DNA的理論極限值應(yīng)是23kb。第63頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（四）λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用 建立cDNA基因文庫克隆外源目的基因第64頁,共147頁，2024年2月25日，星期天二、cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體）（一）構(gòu)建策略

由質(zhì)粒和含cos位點(diǎn)的λDNA片段組裝成的載體，即cosmid第65頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）cosmid的特征1、環(huán)形雙鏈DNA分子,≤36.4kb,一般＜10kb2、具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制3、含有一個cos位點(diǎn)A蛋白

cos末端→體外包裝成為噬菌體，但不含λ噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會產(chǎn)生子代噬菌體 4、cosmid較小，可承載更大的外源DNA

若cosmid為6.5kb，則可承載44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。因此，cosmid克隆廣泛用于構(gòu)建基因組文庫。第66頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共147頁，2024年2月25日，星期天“柯斯克隆”（cosmidcloning）應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫做“柯斯克隆”（cosmidcloning）這種技術(shù)的理論依據(jù)是，在線性λ噬菌體DNΑ分子的每一端，都具有一段彼此互補(bǔ)的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端（cos位點(diǎn)）。在λ噬菌體的正常生命周期中，會產(chǎn)生出由數(shù)百個λDNA拷貝組成的多連體分子。在此種分子中，前后兩個λDNA基因組之間都是通過cos位點(diǎn)連接起來的。第68頁,共147頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體具有的一種位點(diǎn)特異的切割體系（site-specificcuttingsystem），叫做末端酶（terminase）或Ter體系，能識別兩個相距適宜的cos位點(diǎn)，將多連體分子切割成λ單位長度的片段，并將它們包裝到λ噬菌體頭部中去。只有在被作用的λDNA分子具有兩個cos位點(diǎn)，而且它們之間的距離保持在38～54kb的條件下，Ter體系才能對它們發(fā)生作用。

第69頁,共147頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用柯斯質(zhì)粒作載體進(jìn)行基因克隆的一般程序?qū)⑼庠碊NA片段與柯斯質(zhì)粒線性DNA分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。由此形成的連接產(chǎn)物群體中，有一定比例的分子是兩端各有一個cos位點(diǎn)的長度為40kb左右的真核DNA片段，而且這兩個cos位點(diǎn)在取向上是一樣的，可作為λ噬菌體Ter功能的一種適用底物。當(dāng)加入λ噬菌體的包裝連接物時，它能把這些分子包裝進(jìn)λ噬菌體的頭部，可以用來感染大腸桿菌。第70頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第71頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（三）使用cosmid載體的基本程序 利用cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 利用cosmid的λ噬菌體性質(zhì)→轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細(xì)胞（下圖）第72頁,共147頁，2024年2月25日，星期天三、M13噬菌體克隆載體（一）M13DNA

絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈DNA分子（“+”鏈DNA） 大?。?.4kb

結(jié)構(gòu)：10個區(qū)基因間隔區(qū)（IS區(qū)）

含復(fù)制起始位點(diǎn)及可插入外源DNA的位點(diǎn)第73頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）M13DNA復(fù)制和M13噬菌體增殖

M13DNA“+”鏈進(jìn)入雄性大腸桿菌→合成“-”鏈→產(chǎn)生雙鏈M13DNA（復(fù)制型DNA或RF-DNA）→按環(huán)狀雙鏈DNA方式復(fù)制，同時以“+”鏈DNA為模板轉(zhuǎn)錄包裝蛋白→RF-DNA達(dá)200拷貝時，單鏈DNA特異結(jié)合蛋白與“+”鏈結(jié)合而阻斷合成“-”鏈→結(jié)果只能以“-”鏈為模板合成“+”鏈→“+”鏈DNA被包裝蛋白包裝成新的M13噬菌體→擠出受體細(xì)胞→宿主細(xì)胞不被溶菌。第74頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第75頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

M13DNA復(fù)制特征：以雙鏈DNA為中間媒介 培養(yǎng)物→高速離心→上清中含噬菌體顆?！?”鏈DNA

沉淀菌體→破碎后，可提取RF-DNA（三）M13噬菌體克隆載體的構(gòu)建策略和途徑 策略：在RF-DNA的IS區(qū)插入選擇標(biāo)記基因，并組裝合適ＭＣＳ。

RF-DNA上有10個BsuI位點(diǎn)→部分酶切→獲得全長線形RF-DNA,與含LacZ`標(biāo)記的HindⅢ酶切片段進(jìn)行平末端連接→M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點(diǎn),可在LacZ`區(qū)插入ＭＣＳ連桿構(gòu)建成對M13載體，保證外源DNA兩條鏈都能隨“+”鏈一起復(fù)制包裝。第76頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（四）M13克隆載體的優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：1、以雙鏈環(huán)形DNA為中間媒介復(fù)制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作2、制備的M13DNA單、雙鏈都能轉(zhuǎn)化大腸桿菌，直接轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞3、單鏈DNA不受包裝限制，可包裝M13DNA分子6倍的DNA分子4、可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA插入的單鏈DNA分子 主要用途：克隆、分離單鏈外源DNA片段 獲得的“+”鏈可直接用于DNA測序第77頁,共147頁，2024年2月25日，星期天四、CaMV克隆載體 花椰菜花葉病病毒（CaMV）環(huán)狀雙鏈DNA分子（一）CaMV

DNA分子 大?。?kb

結(jié)構(gòu)：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負(fù)鏈有一缺口，正鏈有兩缺口。進(jìn)入植物細(xì)胞后單鏈部分被酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀DNA分子。第78頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第79頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）CaMV基因區(qū)8個閱讀框（ORF）和3個間隔區(qū)（IR1～3）

IR1－ORFVI與ORFVII之間

IR2－ORFVII與ORFI之間

IR3－ORFV與ORFVI之間

IR1和IR3區(qū)各有一個啟動子結(jié)構(gòu)，分別啟動同方向轉(zhuǎn)錄35SRNA和19SRNA，而兩者的終止子都在IR1區(qū)。

35S啟動子——組成型強(qiáng)啟動子。組裝了35S啟動子的外源基因可在植物細(xì)胞高效表達(dá)，在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)也有效表達(dá)。第80頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（三）CaMV的增殖和感染

1、增殖途徑：

CaMV顆?！料x→病毒DNA進(jìn)入植物細(xì)胞核→ 轉(zhuǎn)錄19SRNA→翻譯

35SRNA翻譯反轉(zhuǎn)錄“-”鏈DNA→復(fù)制出“+”鏈2、CaMV-DNA可轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞 在ORFII和ORFVII區(qū)插入外源DNA后仍能轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞包裝成新的CaMV顆粒第81頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（四）構(gòu)建CaMV克隆載體的基本策略和途徑

策略

CaMV-DNA能侵入植物細(xì)胞而將目的基因?qū)?，并且清除CaMV對植物的致病性基因途徑1、構(gòu)建互補(bǔ)克隆載體:組裝(目的基因+標(biāo)記基因)而無感染能力+兩種基因和感染能力都無→彼此獲得對方產(chǎn)物→感染能力2、構(gòu)建置換型克隆載體置換的外源基因較小3、構(gòu)建混合型克隆載體

CaMV-DNA→合適的限制性酶切→組入Ti的T-DNA區(qū)→完成構(gòu)建4、構(gòu)建CaMV-融合基因克隆載體系統(tǒng) 將35S啟動子與目的基因融合，高效表達(dá)目的基因。第82頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第83頁,共147頁，2024年2月25日，星期天五、煙草花葉病毒（TMV）克隆載體 單鏈正義RNA，6395bp特點(diǎn)：復(fù)制量和外殼蛋白表達(dá)量高，寄主范圍廣，能在整株植物上快速擴(kuò)散TMV載體構(gòu)建策略有四種基本形式（圖3-20）第84頁,共147頁，2024年2月25日，星期天六、SV40克隆載體——哺乳動物基因克隆載體 （猿猴空泡病毒40）（一）SV40基因組雙鏈閉環(huán)DNA：5243bp酶切位點(diǎn)：早期轉(zhuǎn)錄區(qū)：BamHⅠ、BstⅠ、TapⅠ識別序列晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)：AccⅠ、NaeⅠ、HaeⅡ、HpaⅡ、EcoRⅠ、BanⅠ、EcoRⅤ、AflⅡ轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)：BglⅠ、SfiⅠ都只有一個識別序列第85頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒載體實(shí)驗(yàn)證明，一些具有DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有DNA階段的真核生物的病毒，經(jīng)過改建之后，都可以發(fā)展成為用于轉(zhuǎn)移動物基因的分子載體。第86頁,共147頁，2024年2月25日，星期天動物病毒特點(diǎn)

動物病毒含有能夠被真核細(xì)胞識別的有效的啟動子。

有許多種動物病毒，在其感染周期中都能夠持續(xù)地復(fù)制，使其基因組拷貝數(shù)達(dá)到相當(dāng)高的水平。有些動物病毒具有控制自己復(fù)制的順式元件和反式作用因子。有些動物病毒，在它們的復(fù)制過程中能高效穩(wěn)定地整合到寄主核基因組上。病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識別細(xì)胞接受器(acceptor)。用病毒外殼蛋白質(zhì)包裝重組質(zhì)粒DNA形成的假病毒顆粒(pseudovirions)，即構(gòu)成了一種高效的轉(zhuǎn)化體系。第87頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒的基本生物學(xué)特性

猿猴空泡病毒40(Simianvacuolatingvirus40,SV40)是迄今為止研究得最為詳盡的乳多空病毒(Papovaviruses)之一。SV40病毒的基因組是一種環(huán)形雙鏈的DNA，其大小僅有5243bp，很適于基因操作。第88頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒的生命周期

根據(jù)SV40病毒感染作用的不同效應(yīng)，可將其寄主細(xì)胞分成三種不同的類型。SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴細(xì)胞之后，便產(chǎn)生感染性的病毒顆粒，并使寄主細(xì)胞裂解。我們稱這種感染效應(yīng)為裂解感染(lyticinfection)，而猿猴細(xì)胞則叫做受納細(xì)胞(permissivecell)。但如果感染的是嚙齒動物(通常是倉鼠和小鼠)的細(xì)胞，就不會產(chǎn)生感染性顆粒，此時病毒基因組整合到寄生細(xì)胞的染色體上，于是細(xì)胞便被轉(zhuǎn)化，也就是說發(fā)生了癌變。我們稱這種嚙齒動物細(xì)胞為SV40病毒的非受納細(xì)胞(non-permissivecell)。人體細(xì)胞是SV40的半受納細(xì)胞(semi-permissivecell)，因?yàn)橥琒V40病毒接觸的人體細(xì)胞中，只有1%～2%會產(chǎn)生出感染性的病毒。第89頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒對猿猴細(xì)胞的裂解感染可分成三個不同的時相

在感染了寄主細(xì)胞之后，有一段長達(dá)8～12小時的潛伏期，在這個期間，病毒顆粒脫去蛋白質(zhì)外殼，同時DNA逐漸地轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞核內(nèi)；緊接著4小時為早期時相，此時發(fā)生早期mRNA和早期蛋白質(zhì)的合成，并出現(xiàn)病毒誘導(dǎo)寄主細(xì)胞DNA合成的激發(fā)作用；在這以后的36小時稱為晚期時相。進(jìn)行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白質(zhì)的合成，并在高潮時發(fā)生病毒顆粒組裝。大約在感染的第三天，細(xì)胞裂解，平均每個細(xì)胞可釋放出105個的病毒顆粒。第90頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒的基礎(chǔ)分子生物學(xué)

SV40病毒是一種小型的20面體的蛋白質(zhì)顆粒，由三種病毒外殼蛋白質(zhì)Vp1、Vp2和Vp3構(gòu)成，中間包裝著一條環(huán)形的病毒基因組DNA。同其它病毒不同，SV40DNA是同除了H1之外的所有寄主細(xì)胞組蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相結(jié)合。這些組蛋白使病毒DNA分子緊縮成真核染色質(zhì)所特有的念珠狀核小體，這種結(jié)構(gòu)特稱為微型染色體(minichromosome)。感染之后的SV40基因組，輸送到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。SV40病毒基因組表達(dá)的時間順序是相當(dāng)嚴(yán)格的,據(jù)此可將其區(qū)分為早期表達(dá)區(qū)和晚期表達(dá)區(qū)第91頁,共147頁，2024年2月25日，星期天圍繞在SV40DNA復(fù)制起點(diǎn)周圍約400bp的DNA區(qū)段，是十分引人注意的?，F(xiàn)在已經(jīng)弄清緊挨這個起點(diǎn)的DNA序列，是調(diào)節(jié)早期和晚期初級轉(zhuǎn)錄本合成的控制信號。早期轉(zhuǎn)錄本的合成，就是由位于這個區(qū)段內(nèi)的由一對72核苷酸序列串聯(lián)而成的強(qiáng)化因子序列激活的。

第92頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒基因組表達(dá)的一個重要特點(diǎn)是，它的RNA剪輯模式非常復(fù)雜。通過不同的剪輯途徑，早期初級轉(zhuǎn)錄本加工成2種不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初級轉(zhuǎn)錄本加工成3種不同的早期mRNA)；而晚期的初級轉(zhuǎn)錄本加工成3種不同的晚期mRNA。這2種早期mRNA分別編碼大T抗原的小t抗原(即腫瘤蛋白質(zhì)或抗原)。晚期轉(zhuǎn)錄本按照其特定的沉降系數(shù)，可區(qū)分為16S、18S和19S三種mRNA，它們分別編碼Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白質(zhì)。Vp1編碼區(qū)同Vp2和Vp3的編碼區(qū)是以不同的轉(zhuǎn)譯結(jié)構(gòu)形式彼此交疊的第93頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第94頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒的增強(qiáng)子序列在SV40病毒基因組中存在著一個增強(qiáng)子序列。其長度為72bp，以串聯(lián)重復(fù)的形式位于基因組DNA復(fù)制起點(diǎn)的附近，它的主要功能是促進(jìn)病毒DNA發(fā)生有效的早期轉(zhuǎn)錄，而且具有一般增強(qiáng)子所共有的基本特性。

第95頁,共147頁，2024年2月25日，星期天外源的基因可以融合在SV40DNA的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)段內(nèi)，而SV40的增強(qiáng)子又能夠有效地激活SV40早期轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄活性。因此顯而易見，SV40增強(qiáng)子在哺乳動物的基因操作中是相當(dāng)有用的。此外，SV40增強(qiáng)子還可以增強(qiáng)由細(xì)胞啟動子啟動的基因轉(zhuǎn)錄作用。第96頁,共147頁，2024年2月25日，星期天SV40病毒載體

野生型的SV40病毒顆粒的包裝范圍相當(dāng)嚴(yán)格，超過其基因組大小(5.2kb)的重組DNA就不能夠被包裝為成熟的病毒顆粒。而且，SV40還存在著寄主細(xì)胞的局限性，它只能在受納細(xì)胞中增殖，并最終導(dǎo)致寄主細(xì)胞的死亡，這樣就不能作長期的培養(yǎng)使用。因此，野生型的SV40病毒必須經(jīng)過改造之后，才能發(fā)展成為基因克隆的有用載體。第97頁,共147頁，2024年2月25日，星期天取代型的重組病毒載體(recombinantvirusvector)

重組的病毒-質(zhì)粒載體(recombinantviralplasmidvector)

第98頁,共147頁，2024年2月25日，星期天取代型的重組病毒載體(recombinantvirusvector)

在這種類型的載體中，外源DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因組上。由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的，因此形成的重組體DNA能夠在哺乳動物的受納細(xì)胞中增殖，并被包裝成病毒顆粒。但為了補(bǔ)充這段被取代的病毒基因組DNA的功能，必須使用一種與之互補(bǔ)的輔助病毒。

第99頁,共147頁，2024年2月25日，星期天晚期區(qū)段取代載體

實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)觀察到，缺失了整個晚期區(qū)段功能的SV40病毒，同可互補(bǔ)這段功能的一種溫度敏感(ts)的輔助病毒混合感染時，仍然能夠增殖。因此，可以通過取代晚期區(qū)段的途徑構(gòu)建SV40病毒載體。最常用的輔助病毒是tsA突變體，它合成一種溫度敏感的T抗原。第100頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第101頁,共147頁，2024年2月25日，星期天早期區(qū)段取代載體

按照同樣的道理，也可以構(gòu)建出早期區(qū)段取代載體(earlyregionreplacementvector)。當(dāng)SV40病毒的早期區(qū)段被取代后，就失去了T抗原的功能，因此，早期區(qū)段取代載體必須使用具有互補(bǔ)功能的輔助病毒。1981年Y.Gluzman發(fā)現(xiàn)了一種特殊的COS細(xì)胞系，能夠有效地互補(bǔ)T抗原，從而大大地方便了早期區(qū)段取代載體的使用，被認(rèn)為是SV40載體發(fā)展歷程中的一個重要的突破。第102頁,共147頁，2024年2月25日，星期天但由于晚期啟動子在感染周期中能較長時間地保持活性，又具有較強(qiáng)的表達(dá)能力，因此相比之下，早期區(qū)段取代載體具有更為廣泛的用途。鑒于病毒基因組的復(fù)制拷貝數(shù)可高達(dá)數(shù)十萬份，因此晚期啟動子十分有效。這類載體可用來生產(chǎn)大量的蛋白質(zhì)。第103頁,共147頁，2024年2月25日，星期天重組的病毒-質(zhì)粒載體

在這類載體中，病毒基因組部分只保留下維持在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制所必須的有關(guān)序列，但它融合上了一個細(xì)菌質(zhì)粒，因而還能夠在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和增殖。不過這種重組體分子沒有被包裝成病毒顆粒，不會出現(xiàn)裂解感染的情況，它實(shí)際上是一種類似于質(zhì)粒的DNA分子載體。第104頁,共147頁，2024年2月25日，星期天含有完整早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)的病毒-質(zhì)粒載體

SV40和多瘤病毒(polyomavirus)的基因組能夠在寄主細(xì)胞中快速地復(fù)制，并達(dá)到相當(dāng)高的拷貝數(shù)。利用這種能力，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展出了一類特殊的病毒載體。這類病毒載體，實(shí)質(zhì)上是由病毒的早期區(qū)段和復(fù)制起點(diǎn)同大腸桿菌的質(zhì)粒分子重組而成的，所以又叫做病毒-質(zhì)粒載體(viral-plasmidvector)。由于它們既可在大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制，也能在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制，根據(jù)這種特性，在有的文獻(xiàn)中有時也稱之為穿梭載體。第105頁,共147頁，2024年2月25日，星期天第106頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）SV40-DNA復(fù)制與增殖 猿猴細(xì)胞——受納細(xì)胞 嚙齒動物（小鼠、倉鼠）——非受納細(xì)胞；細(xì)胞癌變 人：1～2%細(xì)胞產(chǎn)生病毒顆粒，不會插入染色體，相對安全（三）構(gòu)建策略和途徑 包裝嚴(yán)格，不能包裝大于SV40-DNA的分子，只能構(gòu)建取代型載體或SV40-DNA與質(zhì)粒DNA的重組型載體1、取代型 被取代的DNA序列不能超過SV40-DNA的30%

（1）晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：需輔助載體共同轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 （2）早期轉(zhuǎn)錄區(qū)取代型：輔助細(xì)胞系 （將SV40早期轉(zhuǎn)錄區(qū)DNA序列整合到敏感細(xì)胞基因組上）第107頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

2、病毒-質(zhì)粒重組克隆載體：質(zhì)粒載體的衍生物

（1）病毒-質(zhì)粒重組克隆載體（穿梭質(zhì)粒）：含SV40完整早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和DNA復(fù)制起始點(diǎn)，及質(zhì)粒DNA的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇性標(biāo)記 （2）微型病毒復(fù)制子質(zhì)粒載體：只含SV40復(fù)制起始點(diǎn)七、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體：一類RNA病毒（一）勞斯肉瘤病毒的生物學(xué)特性第108頁,共147頁，2024年2月25日，星期天RSV：含兩條相同的38SRNA（右圖）;與宿主細(xì)胞提供的tRNATrp結(jié)合處：PBS+ve、PBS-veRSV的復(fù)制與增殖：（右圖）接上長末端重復(fù)序列（LTR）策略：RNA病毒不能直接構(gòu)建，必須從感染動物細(xì)胞中分離出原病毒DNA，按不同需求刪去部分序列，組入選擇標(biāo)記、目的基因、調(diào)控元件，再克隆入質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，才可獲重組載體。（二）構(gòu)建RSV載體的策略和途徑第109頁,共147頁，2024年2月25日，星期天1、反轉(zhuǎn)錄病毒-質(zhì)粒載體 關(guān)鍵步驟：體外刪去原病毒的gag、pol、env等序列，保留5’和3’LTR序列以及PBS+ve、PBS-ve和psi（包裝）位點(diǎn)，插入合適的選擇標(biāo)記如neo、gpt等。(如圖)需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒↓Gag、Env蛋白↓識別包裝位點(diǎn)psi↓將重組的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝成新的病毒顆粒新病毒能合成各種所需的蛋白質(zhì)。第110頁,共147頁，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：更高的轉(zhuǎn)化效率，基因轉(zhuǎn)移成功率100%改進(jìn)：鑒于危險(xiǎn)性，已建立了不需輔助反轉(zhuǎn)錄病毒的克隆載體系統(tǒng)。將缺失psi位點(diǎn)的原病毒DNA轉(zhuǎn)化動物受體細(xì)胞，獲得全部包裝蛋白質(zhì)，即輔助細(xì)胞。2、廣宿主反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體組入能感染多種動物細(xì)胞的env基因3、反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)克隆載體可插入6kb的外源基因。若剪短原病毒DNA，則可承載20kb第111頁,共147頁，2024年2月25日，星期天八、腺病毒克隆載體（一）腺病毒的一般生物學(xué)特性

Ad：無囊膜的20面體，含一個線形雙鏈DNA分子，約36kb。

Ad-DNA兩端具有逆向末端重復(fù)序列（IRT），5`端共價結(jié)合一種5.5kD的蛋白質(zhì)（TP），進(jìn)入宿主細(xì)胞后Ad-DNA自行環(huán)化。第112頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）腺病毒載體構(gòu)建特點(diǎn)：易感染性、宿主范圍廣、毒性低（安全）、可容納的外源基因大、不整合入宿主染色體DNA。

基因轉(zhuǎn)移中最有前途的克隆載體之一人類腺病毒有51個血清型，常用的是Ad5和Ad2型。進(jìn)入宿主細(xì)胞后以復(fù)制為界分早晚兩個基因表達(dá)時期。早期基因(E1～E４)編碼調(diào)節(jié)因子，晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白。野生型腺病毒容納最大外源DNA為2kb。理論上，除基因組兩端約500bp的順式結(jié)構(gòu)和包裝必需結(jié)構(gòu)外，其他結(jié)構(gòu)均可被替換成外源DNA。策略：構(gòu)建一個含MCS和篩選標(biāo)志的質(zhì)粒（有病毒基因組某端早期序列）將一表達(dá)盒（啟動子—外源基因—PolyA）插入E1、E3區(qū)或E4至右IRT之間穿梭質(zhì)粒；再構(gòu)建含非必須區(qū)基因缺失的環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒，在菌體復(fù)制；穿梭質(zhì)粒+環(huán)狀腺病毒質(zhì)粒同源重組重組載體。第113頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

例：重組Ad-hFVⅢ構(gòu)建（如圖）第114頁,共147頁，2024年2月25日，星期天改進(jìn)：構(gòu)建能在野生型Ad感染的各種靶細(xì)胞內(nèi)選擇性復(fù)制的Ad載體。（三）Ad克隆載體的應(yīng)用1、基因治療癌癥（1）導(dǎo)入腫瘤抑制基因和反義癌基因（2）導(dǎo)入前體藥物轉(zhuǎn)換酶基因——病毒引導(dǎo)的前體藥物治療（3）導(dǎo)入核酶基因，降低癌基因的表達(dá)水平2、表達(dá)真核基因3、研究疫苗第115頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

九、痘苗病毒克隆載體（一）生物學(xué)性質(zhì) 線形雙鏈DNA分子，180～200kb，編碼200多種蛋白（二）構(gòu)建方法：痘苗病毒的基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，尚無質(zhì)粒型的痘苗病毒克隆載體，因此必須采用同源重組方法構(gòu)建第116頁,共147頁，2024年2月25日，星期天痘苗病毒克隆載體特點(diǎn)：

1）表達(dá)產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的活性和理化性質(zhì)相近

2）外源目的基因和載體的免疫原性均較好

3）外源基因的插入量大

4）宿主細(xì)胞廣泛

5）表達(dá)產(chǎn)物可翻譯后修飾，無需佐劑，純化簡單，產(chǎn)物穩(wěn)定，易于保存運(yùn)輸十、桿狀病毒克隆載體自學(xué)要點(diǎn)：基因組特性，同源重組方式，陽性克隆檢測，表達(dá)特點(diǎn)。第117頁,共147頁，2024年2月25日，星期天思考題1、名詞解釋：Cos位點(diǎn)、受納細(xì)胞、非受納細(xì)胞2、構(gòu)建λ噬菌體載體的策略及其技術(shù)路線。3、試從cosmid克隆載體的構(gòu)建策略上說明其特征。4、簡述病毒的溶原性和溶菌性增殖途徑。5、M13噬菌體載體有何優(yōu)點(diǎn)和用途？6、簡述腺病毒克隆載體的策略及其主要用途。7、痘苗病毒克隆載體有何特點(diǎn)？為什么要用同源重組方式構(gòu)建？8、如何構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒載體？舉例說明。第118頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

3．3 染色體定位整合克隆載體質(zhì)粒與病毒克隆載體的不足：1、轉(zhuǎn)基因生物中游離的外源DNA分子能多拷貝復(fù)制，但易丟失，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性2、隨機(jī)插入染色體的外源DNA片段能穩(wěn)定維持，但因插入的位點(diǎn)不確定，可能干擾受體細(xì)胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致有害突變，造成選育轉(zhuǎn)基因生物不可知性，增加難度基因整合平臺系統(tǒng)——基因定位同源重組(基因打靶)

整合平臺：即受體細(xì)胞基因組上給定的DNA區(qū)域，是外源DNA 定位整合的位置 定位整合克隆載體：除一般質(zhì)?？寺≥d體必備的元件外，還 含有一個或兩個與整合平臺DNA區(qū)域核酸序列同源的

DNA片段（長度最好＞1kb）第119頁,共147頁，2024年2月25日，星期天

一、定位整合克隆載體的幾種模式（一）內(nèi)源平臺雙交換置換克隆載體第120頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（二）外源平臺雙交換置換克隆載體第121頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（三）內(nèi)源平臺雙交換插入克隆載體第122頁,共147頁，2024年2月25日，星期天（四）內(nèi)源平臺單交換插入克隆載體第123頁,共147頁，2024年2月25日，星期天二、定位整合效率與受體細(xì)胞的種屬和同源DNA片段的長短有關(guān)整合效率偏低，有待改進(jìn)第124頁,共147頁，2024年2月25日，星期天三、定位整合克隆載體受體生物：原核生物藍(lán)細(xì)菌、高等植物（擬南芥、水稻等）的原生質(zhì)體、動物鼠的胚胎干細(xì)胞、人的細(xì)胞整合平臺：內(nèi)源isiAB、cpcB2A2、hprt、rDNA

外源hptΔ、aphⅡ（一）藍(lán)藻染色體定位整合克隆載體1、絲狀藍(lán)藻Calothrixsp.PCC7601獲得含藻藍(lán)蛋白基因cpcB2A2的DNA片段，以之為同源序列，構(gòu)建～ 第125頁,共147頁，2024年2月25日，星期天2、從其cpc2操縱子中擴(kuò)贈出cpc2啟動區(qū)（約0.6kb）、同源DNA片段L（約1.2kb）