臨床微生物學實驗手冊

臨床微生物學實驗手冊

刖百

臨床微生物學實驗須知

-實驗規(guī)則

臨床微生物學實驗的對象大多為致病性微生物，工作中經(jīng)常使用電源和易燃物品，為了

防止發(fā)生實驗室感染與火災、燒傷、觸電等意外事故外，必須嚴格遵守下列規(guī)則。

1進實驗室應穿工作服，只帶必要的文具和講義等。

2實驗室內保持肅靜、整潔，禁止飲食、吸煙和開玩笑。實驗時嚴肅認真、集中精力完成

實驗操作，操作過程中，不應談話，不旁視，養(yǎng)成在室內手不觸及口腔、頭發(fā)及身體的習慣,

長頭發(fā)者消將頭發(fā)向后扎緊或戴工作帽，以防頭發(fā)被污染或燒焦。

3發(fā)生操作事故，工作環(huán)境被帶菌材料污染，立即報告教師進行處理。

4實驗用過的帶菌材料（如吸管、玻片等）必須立即放在指定的消毒缸內，不得放置實驗臺

上。待消毒或廢棄物品放在指定地點。實驗室內任何物品不得帶出室外。

5實驗完畢時，必須整理清潔實驗臺和實驗室，關好水、電、門窗等。

6離室前應用肥皂和水洗手，并用消毒劑擦手。

二實驗課的基本要求

1實驗前必須認真做好預習，教師將檢查預習情況。

2實驗時嚴格遵守實驗規(guī)則，認真做好每個實驗。

3實驗后必須按本人所得實驗結果如實寫出實驗報告，并通過復習有關理論知識，對自己

的實驗結果作出分析和解釋。

4實驗課是本門課程的重要內容，教師將根據(jù)實驗課表現(xiàn)，實驗結果、實驗報告及實驗考

核評定成績，并作為總成績的重要組成部分。

第一章臨床細菌學基本技術

第一節(jié)普通光學顯微鏡

顯微鏡的光學原理、使用方法和保養(yǎng)詳見有關教材。

第二節(jié)形態(tài)學檢查技術

1.2.1不染色細菌標本的檢查法

不染色的細菌標本的鏡檢，雖可觀察細菌的大小、形態(tài)，但主要用于觀察細菌的動力。

（-）懸滴法

【操作方法】

I取凹玻片，于凹窩內周圍涂凡士林（可漿糊）少許。

2在蓋玻片中央放一接種環(huán)細菌的肉湯培養(yǎng)物。

3將凹玻片反轉，使凹窩對準蓋玻片中央并蓋于其上，然后翻轉玻片，以小鏡子或接種環(huán)

柄輕加壓力，使蓋玻片與凹窩邊緣沾緊。如無凹玻片時，亦可在載玻片之適當位置上加凡士

林，其中墊以其他物體，然后使蓋玻片重疊于玻片之上.

4將制好的懸滴標本置于顯微鏡載物臺中央，先以低倍鏡找到懸滴的邊緣以后，將集光器

下降縮小光圈，再換高倍鏡觀察。

【結果】有鞭毛的細菌為真正運動，無鞭毛的細菌則為布朗運動。

【用途】用以觀察的形態(tài)及動力。

（二）懸滴法

【操作方法】

1用接種環(huán)取菌液（或將少許固體培養(yǎng)物懸于一滴生理鹽水中）2-3環(huán)。置于載玻片中央。

2用鏡子夾好蓋玻片、覆蓋開菌液上，在放置時，先將蓋玻片一邊接觸菌液，緩緩放一，

以不產(chǎn)生氣泡為泡佳。

3先以低倍鏡找好位置，再以高倍鏡觀察。

【結果】與懸滴法相同。

【用途】用以觀察細菌的形態(tài)及運動，本法較懸滴法簡單，但標本容易干涸，不易長時間觀

察。

1.2.2細菌染色的基本步驟

1涂片

1.1于潔凈無油脂載玻片中央加一滴生理鹽水。

1.2用經(jīng)火滅菌的接種環(huán)挑取標本少許，放在生理鹽水滴內研勻涂成菲薄的菌膜，若為液

體標本，直接挑取少許涂抹即可。

1.3若為多標本而行用一染色時，可事先用蠟筆在玻片上劃為數(shù)格，并于玻片的背面標明

標本編號。

2干燥一般在室溫中待其自然干燥，若須加速干燥，可在火焰上方的熱空氣中加溫干燥,

但切勿緊靠火焰，以防標本烤枯，不堪檢視。

3固定固定的目的主要使細菌的細胞質凝固，殺死細菌，使菌體與玻片粘附得較牢，以

及改變菌體對梁料的通透性，通常用加熱法，即將涂片迅速通過火焰2-3次，以玻片反面觸

及皮膚，熱而不燙為度。

4染色將涂片置染色架上，滴加染液以覆蓋標本為度。

5媒染主要是增強菌體與染液間的作用力，其方法有用熱、金屬鹽、碘等。

6脫色目的在于測知染料與被染物之間結合的牢固程度，起鑒別鑒別細菌的作用，將脫

色劑(例如酒精和酸等)滴加于經(jīng)過染色的標本上，作用一定時間后除去脫色劑。

7復染目的在于使己脫色的菌體重新染色與前染液顏色呈明顯對比之顏色。

8染色標本的保存與卦片法，觀察細菌染色標本均用油浸鏡。如需要保存標本，可于觀察

后，拭鏡紙沾二甲苯輕輕將鏡油擦去即可，若長期保留，最好于標本中央滴一滴加拿大樹膠,

上覆蓋一潔凈載蓋片。待其自然干燥后，保存于玻片盒內，可多年不變色。

1.2.3革蘭氏染色法

【染色液】

1結晶紫溶液稱取結晶紫4-8g,溶于95%酒精100ml中，制成飽和液，再取飽和液20ml

與10g/L的草酸鏤溶液80ml混合即成。

2盧戈氏碘液先溶碘化鉀2g于10ml蒸鐳水中，再加碘1g,待碘全部溶解后，加蒸儲水

200ml即成。

3脫色劑

(1)95%酒精

(2)丙酮乙醇溶液(95%乙醇70ml加丙酮30ml)。此兩種脫色劑均可應用，但混合脫色劑比

單用95%酒精好，易于掌握，反應準確。

4復染液

(1)稀釋石炭酸復紅液：取萋-尼二氏抗酸染色液中的石炭酸復紅液(堿性復紅酒精飽和液

10ml與5%石炭酸90ml混合)10ml加入蒸儲水90ml即成。

（2）沙黃溶液（25g/L的沙黃乙醇溶液10ml加蒸儲水90ml）?

【操作方法】

1將結晶紫染液滴加在已固定的涂片上，染Imin后水洗。

2加盧戈氏碘液適量，染Imin后水洗。

3用95%酒精脫色，搖動玻片至紫色不再為酒精脫落為止（根據(jù)涂片上之厚薄約需0.5-lmin）

后水洗

4用稀釋石炭酸復紅染30s至Imin。

5用水沖洗，待干，鏡檢。

【結果】革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。

【注意事項】

新配制的染液應先用已知的革蘭氏陽性菌和陰性菌（通常用金黃色葡萄球菌與大腸桿菌的

16小時培養(yǎng)物）進行對照試驗。以檢查染色液的質量是否適用。

結晶紫與草酸鏤溶液混合后不能保存太久。如有沉淀出現(xiàn)，應重新配制使用。

第三節(jié)高壓蒸汽滅菌技術

高壓蒸汽滅菌法是細菌室對實驗室材料進行滅菌的主要手段。主要設備是蒸汽高壓鍋。

有臥式和立式兩類。此外還有手提式小型高壓鍋，使用比較方便。

高壓滅菌的原理是利用增加鍋內蒸汽的壓力而提高蒸汽溫度，達到全部殺滅微生物的作

用。壓力與溫度的關系見表1—3—1

壓力

溫度（℃）

公斤/CM磅

0.355108

0.7010116

1.0515121

1.4020127

表1—3—1壓力與溫度的關系

現(xiàn)在最常用的培養(yǎng)基滅菌條件是15磅15分鐘,時間過長有可能破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。

含糖的生化培養(yǎng)基的滅菌條件是10磅15分鐘，或用流動蒸汽法滅菌。器皿的滅菌可以15

磅20分鐘。高壓滅菌操作方法如下：

欲滅菌物品放入鍋內，關閉鍋門，擰緊螺絲。確認己經(jīng)密閉，可進行下一步操作。

打開排氣閥。

開蒸汽開關，向鍋內送蒸汽或電源，使產(chǎn)生蒸汽。

觀察排氣閥的排氣情況，待排出的氣體由冷空氣變?yōu)檎羝瑴囟葹?05℃時，可關

閉排氣閥。

高壓滅菌時須注意，必須待鍋內冷氣完全排出后才可關閉排氣閥加壓，不然達不到滅菌

效果。有數(shù)據(jù)表明，在15磅含有40%空氣的溫度約為105℃。由此可見，如果鍋內殘留有

冷空氣，即使壓力達到15磅，溫度也達不到121℃,不能殺滅微生物。

觀察壓力表升至15磅時，開始記住。

壓力達到15磅后，可調節(jié)進氣閥，減少進氣量。維持壓力穩(wěn)定在15（1公斤/cm?）磅。

電加熱時，可以斷和接通電源、維持壓力。持續(xù)15分鐘，至少不能超過30分鐘，否則營養(yǎng)

物破壞。

關掉進氣閥門或切斷電源，讓鍋內物品自然冷卻，不可馬上打開排氣閥，以免發(fā)生意外。

待鍋內壓力降為零時，才可以打開鍋門，取出物品。滅菌培養(yǎng)基時，必須及時打開鍋蓋,

不然培養(yǎng)基的顏色回變深。

第四節(jié)培養(yǎng)基制備技術

傳統(tǒng)的制備培養(yǎng)基方法是在實驗室內由自己配制。但現(xiàn)在越來越多的實驗室使用成品干

燥培養(yǎng)基。由于成品培養(yǎng)基由生產(chǎn)廠統(tǒng)一購制原料生產(chǎn)。如果有較好的產(chǎn)品質量保證，質量

是可靠的。使用干燥培養(yǎng)基有不少優(yōu)點，但使用時還有些技術問題應當注意。

1）溶化配制的培養(yǎng)基必須在玻璃器中進行。如用銅、鐵器器皿，會影響細菌生長。一般

先將需要的蒸播水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養(yǎng)基干粉，放入水中，靜置10-

20分鐘。除瓊脂外，一般成分均可自然溶解。注意不可先加干粉后加水，這不利于溶解。

攪拌或振蕩器皿后或延長放置時間以促進溶解。只有不得已（或需要）的情況下加熱溶解。

但加熱時間不宜過長。溫度不宜過高。因高熱對瓊脂及某些營養(yǎng)成分有破壞作用。

2）調節(jié)pH：商品干燥培養(yǎng)基一般已校正PH用時須再驗證。常用的分離培養(yǎng)基PH為7.2

-7.4o高壓滅菌前，可用PH計校正。由于高壓滅菌可影響PH,所以驗證PH還應在高壓

滅菌后進行。最簡便的方法是用精密PH試紙插入起傾制好的瓊脂平板或分裝試管的液體培

養(yǎng)基中，判斷是否符合要求。

3）分裝：液體培養(yǎng)基一般在滅菌前分裝，分裝是應注意每管的分裝量不應高于試管的2/3。

在滅菌后，還要加入成分的液體培養(yǎng)基及半固體培養(yǎng)基，要在高壓滅菌后分裝。

瓊脂平板是在培養(yǎng)基高壓滅菌之后制備，應等培養(yǎng)基冷至50—60℃再傾平板，否則水

蒸汽多。加入培養(yǎng)基中的血液如果保存在冰箱，用前應提前取出。暖至室溫后，再加到培養(yǎng)

基中。

一般倒在玻璃平皿中的瓊脂平板在無菌室中放置3-4小時或過夜，平皿內的水蒸汽會

自然蒸發(fā)。如果用塑料平皿，因密閉較嚴，須在35℃培養(yǎng)基中烘烤30—60分鐘。方法是將

平板放入卵箱，正面向下。以防細菌落入而污染。卵箱門不要關嚴。應留一點縫隙，使水蒸

氣排到箱外。用這種烤法要定時檢查。以免烤干。瓊脂平板放4℃冰箱保存。

4）質量檢查

（1）無菌試驗：可將制好的培養(yǎng)基在35℃卵育過夜，判定是否滅菌合格。另一種簡便的方

法是制作的平板在無菌室放置室溫（20℃—30℃）過夜。一方面可使水蒸氣干，另一方面可

以判斷是否有污染。

（2）效果檢驗：按不同的培養(yǎng)基要求接種相應的菌株。觀察細菌的發(fā)育、菌落形態(tài)、色素溶

血等特征，判斷培養(yǎng)基是否符合要求。

5）保存：液體培養(yǎng)基如無特殊要求可在室溫中保存，兩周內用完。過于干燥的地區(qū)應縮短

保存期。瓊脂平板須在4℃保存，一般不超過4天。如用塑料袋密封，保存期可延長，但至

多兩周。

保存的培養(yǎng)基是否能用，須視培養(yǎng)基中水份蒸發(fā)程度及有無污染而定。

第五節(jié)指示劑的配置技術

指示劑一般是加在培養(yǎng)基中，來指示細菌代謝后培養(yǎng)基PH的變化。常用指示劑如見表

1—5—1。

指示劑PH范圍酸色一堿色

甲基紅4.2—6.2紅一黃

澳甲酚紫5.2—6.8黃一紫

溪麝香草酚蘭6.0—7.6黃一蘭

酚紅6.8—8.7黃一紅

中性紅6.8—8.0紅一黃

表1-5-1常用指示劑的變色性

配置指示劑用的溶劑有兩種：乙醇和蒸儲水。兩種溶液各有不同用途，使用時應注意.

指示劑的乙醇溶液多用于培養(yǎng)基的PH滴定。由于指示劑在乙醇中溶解度較大，所以在

需制備高濃度溶液時用乙醇作為溶劑。制備生化反應培養(yǎng)基，要慎用乙醇做溶劑。因為某些

細菌可以利用乙醇進行代謝，產(chǎn)生酸性反應。如果用乙醇液的指示劑制備發(fā)酵培養(yǎng)基，將會

影響試驗結果的可靠性。所以，制備生化培養(yǎng)基以水溶液為佳

指示劑的水溶液往往不易完全溶解，實際上是混懸液。此液可用來制備培養(yǎng)基，但應注

意在取液前，必須充分搖勻，以保證取量正確。

每種指示劑的具體配制濃度見各有關部分。

配制指示劑的一般步驟：

1.稱一定量指示劑化學品。

2.放入研缽中，加入少量溶劑研磨。

3.吸取溶解的研磨液，置試劑瓶中。

4.加入溶劑，繼續(xù)研磨。

5.如此反復，至所有指示劑均磨細并成為溶液。

6.加溶劑補足定量。

第六節(jié)接種和移種技術

接種和移種是細菌實驗工作中最基礎最常用的操作技術。正確掌握這項技術可以保證細

菌傳代的成功和防止自然環(huán)境的污染，獲得純培養(yǎng)物。

(1)左手的操作要點：左手負責持瓊脂平板、試管、燒瓶等物品。操作中，左手盡量減少

移動，否則，不利于保持物品的無菌狀態(tài)。要點如下：

①、左手持物品時，不應隨時移動。最好固定在一個空間方位上，這可避免因移動使空氣中

的細菌進入器皿

②、左手所持的試管、平皿、燒瓶應盡量避免使其入口向上。持平皿時，可以讓瓊脂平板的

表面與地面盡量垂直。持燒瓶和試管也可傾斜，使瓶口表面與地面垂直。當從平板上挑菌落

時，每次取菌完畢應立即扣回蓋上。只有需再取菌時，左手才可將平皿持起。

(2)、右手的操作要點：右手持接種工具取菌并劃種。右手的小指負責打開試管或燒瓶的塞

子，并持在手中。此時應注意塞子始終向下，并不觸及任何物品。待從試管中取菌或接種完

畢，立即塞上塞子。

在每次取菌或接種前及操作后，均須燒灼接種器具。燒灼時，接種環(huán)指向地面，由環(huán)或

針頭開始過火焰，并逐漸移向整個環(huán)和針。燒紅為止。稍待片刻冷卻后，可使用或放回。

接種環(huán)在使用時，應先在氧化焰中燒紅銀絲。再平持，使金屬柄在火焰中通過3次滅菌。

如直接將接種環(huán)在氧化焰中燒灼，環(huán)上細菌或標本可因受高熱爆烈四濺。做結核菌實驗時，

接種環(huán)應采用煮沸滅菌。即使用后的接種環(huán)也應直接放入沸水中，煮沸滅菌。因結核菌體本

身易爆烈濺出，近年來有電熱接種環(huán)滅菌。滅菌時細菌不致四濺。

(3)、移種或接種的基本步驟

1右手持接種工具，在火焰上燒灼滅菌。

2左手持起標本盒或原代培養(yǎng)物的平皿試管等。

3用工具挑取適量標本或細菌。挑臨床標本時，應注意選擇真實反映感染情況的餓部分，

如痰液需挑膿塊，避開口水；痢疾糞便挑取膿血部分等。從原代培養(yǎng)物上挑菌，用于分純做

生化反應的，應挑取單個菌落；用于分離的，應挑取多種菌混合生長區(qū)域的；用于藥敏試驗

的，應多取幾個菌落。從液體中取菌，只需將環(huán)在培養(yǎng)液中蘸取一滿環(huán)即可。

4接種到新的培養(yǎng)基上。如接種到平板上，可按目的用分區(qū)劃線或區(qū)域涂布的接種法。接

種到液體中時，可將接種環(huán)挑出的菌落在試管有液體的管壁上研磨，細菌可轉入液體中。做

穿刺接種時，可垂直刺入高層瓊脂中，并沿線取出，須注意不要一直穿刺到管底。

5接種后，在火焰上燒灼接種用具，放回原處。

第七節(jié)分離和純化技術

分離和純化是細菌學實驗技術中兩個不同的概念。分離是指從原始材料（臨床標本）或

多種細菌的混合培養(yǎng)物中將各種細菌彼此獨立地分離開，以得到純凈的單一菌落。純化是對

單一菌落進行大量擴增，以得到大量的純培養(yǎng)物。因為兩種概念的目的不同，得到的產(chǎn)物也

不同。

做分離時，一般須用一只完整的瓊脂平板。劃平板多采用分區(qū)劃線法，在一只平板中可

劃4?5區(qū)。劃法有兩種。從含菌數(shù)較少的臨床標本中分離細菌時，可用接種環(huán)取一標本涂

布在平板邊緣，然后從此區(qū)開始密劃線至1/3平板，為第一區(qū)，環(huán)上的標本應全部涂在此區(qū)

內。接下來以第一區(qū)的一角為起點，密劃線至1/3平板為第二區(qū)。此區(qū)的部分劃線須與第一

區(qū)的部分劃線重合，這樣，第一區(qū)劃線上的部分被按此法劃第二區(qū)。須注意，第三區(qū)的劃線

只能接觸第二區(qū)的劃線。而不能觸及第一區(qū)，否則達不到進一步稀釋的目的。還可以劃第四

區(qū)乃至第五區(qū)。分區(qū)劃線的效果及幾個區(qū)合適是以最后出現(xiàn)單個菌落為依據(jù)。

另外一種方法與前述的基本相同，用與由混合細菌培養(yǎng)物的分離。用接種環(huán)挑取混合培

養(yǎng)物。在平板邊緣密涂。然后用火焰燒灼接種環(huán)，使無菌。以密涂區(qū)域為起點，做分區(qū)劃線。

但僅第一劃線接觸涂在細菌的區(qū)域。劃完第一區(qū)后，燒接種環(huán)使無菌。然后再劃第二區(qū)，燒

接種環(huán)，再劃第三區(qū)，依此類推，做法如圖1-7-1所示。

圖1-7-1平板分區(qū)劃線（左）及培養(yǎng)后菌落示意圖

純化是指欲獲得大量純培養(yǎng)物的方法，造作比較簡單，所用平板大小可根據(jù)需要的菌量

而定。

如需要大量的純培養(yǎng)物，用接種環(huán)挑單個菌落，在平板上密涂劃線，經(jīng)過孵育即得到大

量純培養(yǎng)物。如果需要的純培養(yǎng)量不大，僅是為了作生化反應等，可采用另一種方法.即用

一接種針頂部彎一段成約30°角，彎部長約5mm..做純化操作時，用針在菌落上蘸幾下，

然后在瓊脂平板上劃一豎線，使針上的細菌接種在培養(yǎng)基上.接著用接種針的彎部沿劃線做

垂直方向的密涂，由于用長約5mm一段接種針涂菌，對平板的利用程度高，劃線液方便，

見圖如此，一只平板可純化6?8株細菌。

純化不應使用選擇平板。

第八節(jié)細菌血清學試驗

1.8.1玻片法凝集試驗

本法系用已知免疫備血清（診斷血清）。在玻片上直接與細菌培養(yǎng)物或菌懸液混合，在電

解質存在下，若有相應細菌，則出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊或顆粒。這是鑒定細菌最常用的方法。

【方法】

1取一潔凈載玻片，用蠟筆劃分二等分。

2取1：5或1:10免疫血清（市售診斷血清已作稀釋，用前不必再稀釋）1接種環(huán)置于玻

片的左端。在右端放1接種環(huán)生理鹽水（陰性對照用）。

3用接種環(huán)取待鑒定菌培養(yǎng)物，分別于免疫血清及鹽水混勻。反復傾倒玻片，約1-3

分鐘后觀察結果。

【結果判定】

陰性：試驗一側及對照一側均勻混濁。

陽性：試驗一側明顯凝集，對照一側均勻混濁。

自凝：試驗一側及對照一側皆凝集。

【應用】本法簡單易行且特異性強。主要用于鑒定菌種及菌型，如沙門氏菌、志賀氏菌、

布魯氏菌、致病性大腸埃希氏菌、霍亂弧菌，腦膜炎奈瑟氏菌，肺炎鏈球菌和鏈球菌等的鑒

定。

【注意事項】

1、有些細菌表面常有一層表面抗原、如傷寒沙門氏菌的vl抗原及志賀氏菌屬的k抗原等。

它能阻抑菌體抗原與免疫血清的凝集。而導致錯誤的判定。此時應將菌懸液于100C中煮沸

1小時、以破壞其表面抗原，然后再作試驗。若為傷寒沙門氏菌，亦可用抗Vi免疫血清直

接檢測。

2、每作一次鑒定，至少須從一個平板上挑選3?5個以上的S型菌落作試驗，以免遺漏。

3、霍亂弧菌易出現(xiàn)自凝，故應改用0.3%鹽水稀釋免疫血清作試驗及對照；鏈球菌不易制成

均勻懸液，可改用無鹽肉湯及在室溫培養(yǎng)以制成均勻細菌懸液。

4、試驗后的細菌仍有感染性，故在判定后及時放入消毒缸內。

1.8.2傷寒和副傷寒血清學檢查

傷寒和副傷寒的經(jīng)典血清學檢查法為肥達氏反應（試管法）。目前，己可采用微量凝集試驗。

【原理】

用標準傷寒、副傷寒菌液與稀釋的待測血清反應，根據(jù)凝集效價判定待測血清中有無抗傷

寒或抗副傷寒桿菌抗體。與傳統(tǒng)肥達氏反應不同，此試驗在微量血凝反應板上操作。

【試劑】

取傷寒0、H和副傷寒甲、乙、丙診斷菌液（70億菌/ml）,分別用生理鹽水稀釋成10億菌

/ml。為便于觀察，每10ml此種稀釋菌液中加入石炭酸復紅（抗酸染色用染液）10ul,或加

20.0g/L美藍溶液50ul。

【操作】

1、于血凝反應板孔內稀釋待測血清，用每滴25ul的校準滴管滴加生理鹽水9滴于孔內，

再加待測血清1滴混勻（I：10稀釋）。

2、于8X12孔V型孔血凝反應板上操作，每份待檢血清用5排孔，分別標以0、H、甲、

乙、丙。每排自第二孔開始每孔注加生理鹽水25uL至第8孔。

3、吸取1：10稀釋待測血清。分別滴入各排第1、2孔中各1滴（25ul）。用稀釋棒從第2

孔開始作雙倍連續(xù)稀釋到第7孔，第8孔不加血清，留作菌液對照。

每批試驗可用傷寒、副傷寒診斷血清作陽性對照，同法稀釋。

4、各排分別滴入相應的染色菌液,每孔1滴(25ul)o此時各孔液體總量為50uh1~7孔血

清最終稀釋度為1：20T：1280。

5、于混勻器上混勻1分鐘，血凝反應板加蓋，37c6小時后觀察結果。

【結果判斷】

陽性結果表現(xiàn)為液體澄清，有紅色或藍色細顆粒，均勻平攤于整個孔底。陰性表現(xiàn)為藍

或紅色菌體集中一點，沉積于孔底，與菌液對照相同。以出現(xiàn)50%(2+)凝集的血清最大

稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為待檢血清滴度。

【參考值】

與傳統(tǒng)肥達氏反應相同，即O凝集價>80,H凝集價>160才有診斷價值。如雙份血清

效價有4倍以上增長更有意義。

1.8.3鏈球菌感染的血清學檢查

A族溶血性鏈球菌(A鏈)在生長過程中可產(chǎn)生多種毒素和酶；如鏈球菌溶血素O(S

LO)、脫氧核糖酸酶、鏈激酶、透明質酸酶等。檢測血清中的相應抗體，有利于A族溶血

性鏈球菌感染的診斷。其中，以抗鏈球菌溶血素O(AS0)應用最廣泛。常規(guī)應用的Todd

氏溶血法已沿用多年，但操作較繁瑣。此處介紹較簡便的膠乳凝集法

【原理】

被測血清中如有ASO膠乳試劑反應時，可引起后者凝集。如預先用25結合單位/ml溶血

素中和，不出現(xiàn)凝集者說明血清中的ASO<250單位。仍出現(xiàn)凝集者，說ASO>250單位。

【試劑】

1、ASO膠乳試劑：將竣化聚苯乙烯膠乳與純化SLO用炭化而亞胺交聯(lián)。離心洗滌后，用

PH.7.6磷酸鹽緩沖液配成1%懸液，加1.0g/LNaN3防腐.此試劑有商品供應.

2、2.5結合單位/mlSLO：用生理鹽水將液體SLO稀釋到2.5結合單位/ml(標定方法按常用

Todd氏溶血法，滴度為250單位的被測血清。1：50稀釋后，與等容積2.5結合單位/mlSLO

混合，其ASO恰被中和)。

【操作】

1、被測血清用生理鹽水1：50稀釋后56C30分鐘滅活。

2、于方格涂黑玻璃板上滴加滅活的稀釋待測血清1滴。再滴加2.5結合單位/mlSLOl滴，

搖動玻片2?3分鐘，使血清與SLO充分混勻。

3、滴加ASO膠乳試劑1滴。輕輕搖動玻片8分鐘。

【結果判斷】

無凝集者為陰性；有明顯凝集者為陽性。陽性血清應復試，將中和用的溶血素O改為

5.0結合單位/ml,再按上法檢測，如結果仍為陽性則報告為強陽性。

第二章細菌鑒定工作必須遵循的原則

從事細菌鑒定的工作者應該掌握并及時更新細菌學分類知識。常規(guī)鑒定工作應該抓住細

菌的主要特征，通過較簡單的實驗步驟達到正確鑒定目的。

細菌鑒定工作的基本原則核方法

1基本原則

（-）必須用純的細菌培養(yǎng)物作鑒定。因為不同的細菌生化反應的結果相差較大，而反應

結果是以陽性或陰性表示的。一旦用混合菌做生化反應，結果不可分析。如：大腸桿菌與肺

炎克雷伯氏菌混合，IMViC的結果可均呈陽性，而實際上存在這樣的生物種模式。用純培

養(yǎng)物做鑒定，在使用編碼鑒定系列時更為重要。

盡可能用一外菌落接種全部生化反應培養(yǎng)基。如果不夠，應考慮采用純化的方法。由一

個菌落得到大量培養(yǎng)物。

（二）鑒定試驗的選擇：測定細菌特征的實驗方法很多，臨床細菌實驗工作的目的是準確檢

出病原菌，并根據(jù)細菌的主要特征給予正確鑒定。因此，并不是做的實驗越多越好，根據(jù)鑒

定目的選擇適當?shù)脑囼烅椖?，既能完成鑒定，試驗項目又盡可能少，一般須考慮以下幾個問

題。

I）選擇有價值的試驗：鑒別兩種細菌選擇的試驗應該其一為陽性，另一為陰性，且陽性和

陰性的概率大于90%。否則，試驗無鑒別價值。

2）選擇快速簡便的試驗.

因為是常規(guī)實驗室，選擇的方法應快速方便，如鞭毛染色、氧化酶、凝固酶等應為首

選方法。鑒定一個細菌如果有幾種特異的方法，選其中一或兩種便可，多選無價值。如鑒

定B群鏈球菌有CAMP、黃色素、馬尿酸鈉三個試驗，一般用CAMP就可以了。常規(guī)試驗

選用復合培養(yǎng)基很方便，如三糖鐵、MIU等，一個試驗可觀察幾種試驗結果，節(jié)省人力物

力。

3）測定細菌的一種生物特性可能有幾種不同方法。應該了解所用方法的敏感性，否則

會導致錯誤的鑒定。如H2S試驗、醋酸鉛試紙法最靈敏。此法陽性的菌株，三糖鐵上不一

定陽性。另外，一個重要的注意點是糖分解力測定試驗，不同的菌類用的基礎培養(yǎng)基不同。

腸桿菌科用Ewing的方法，非發(fā)酵菌用Hugh-Leifson的方法，葡萄球菌用Jame的方法，而

念珠菌的培養(yǎng)基中含糖量為2%,如果各種菌混合用同一配方，鑒定結果將出現(xiàn)錯誤。

2分析方法

鑒定是將一個未知菌株按其生物學特征，經(jīng)過與所有已知的菌種進行比較后劃歸到一

個己知菌種的分析過程。在這個過程中，應該從分類單位的高級到低級按次序進行。即按門、

綱、目、科、屬、種的次序。臨床細菌鑒定是從科開始的，以下按屬、種做鑒定。為了使

這樣一個分析過程顯易可見，常以雙歧索引來表示。以下是將臨床上常見菌分到科（群）水平

的雙歧索引以供參考。

革蘭氏染色

十—

球菌桿菌球菌桿菌

觸酶動力DNA酶發(fā)酵

+——+——+一+——

卡拉氧化酶

葡鏈李棒,,奈非

+

萄斯狀發(fā)

9!瑟氏弧普

球球特菌酵

菌菌屬二菌菌田菌

漢,,菌

科菌屬等菌屬科群

科

臨床常見菌的初步分群

臨床上常見細菌用革蘭氏染色、鏡下觀察、OF試驗、觸酶和氧化酶試驗就可以初步

分科，經(jīng)過這樣的區(qū)分后，再按科內各個屬和種的鑒別方法鑒定到種。

第三章葡萄球菌屬常規(guī)鑒定

第一節(jié)鑒定過程

葡萄球菌的鑒定過程分為兩個主要步驟：首先須與其它的革蘭氏陽性球菌鑒別，然后在

作屬內的鑒定。

（一）與其它革蘭氏陽性球菌鑒別

臨床標本中可以見到的革蘭氏陽性球菌，除葡萄球菌屬外，還有鏈球菌屬和微球菌屬。

所以，在菌屬內菌種鑒定之前，首先與這兩屬細菌鑒別。

I、與鏈球菌鑒別：葡萄球菌與鏈球菌的區(qū)別，可通過鏡下形態(tài)觸酶試驗。在鏡下，葡萄

球菌以單、雙、葡萄狀排列。菌體呈圓形。而鏈球菌以成單、雙、鏈狀排列，菌體形態(tài)為橢

圓形。兩個菌屬的主要區(qū)別是葡萄球菌觸酶試驗陽性，鏈球菌則陰性。

2、與微球菌的鑒別：微球菌科有3個屬：葡萄球菌屬、微球菌屬、動球菌屬。動球菌屬

與人類關系不大，勿需與此鑒別。主要應與微球菌鑒別，兩者的區(qū)別詳見表3-1。實驗室常

用的鑒別依據(jù)是形態(tài)和發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸。在鏡下，葡萄球菌以葡萄狀排列為主，菌體較小,

微球菌以四聯(lián)排列為主，且菌體較大，葡萄球菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸試驗陽性，微球菌陰性。

項目葡萄球菌微球菌

形態(tài)以葡萄狀為主以四聯(lián)排列為主

發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸+——

溶葡萄球菌素+—

分解甘油（含0.4ug/ml的紅霉素）+一

表3-1葡萄球菌與微球菌的鑒別

（二）葡萄球菌三個種的鑒別

雖然目前葡萄球菌的種不少，但現(xiàn)今臨床鑒定一般要求鑒定到3個種：金黃色葡萄球

菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌。三者的區(qū)別一般可用簡便的血漿凝固酶試驗以及新生霉

素敏感性試驗。首先用凝固酶試驗將其分為凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性的葡

萄球菌，然后用新生霉素敏感區(qū)分。新生霉素敏感的為表皮葡萄球菌。新生霉素耐藥的可初

步定為腐生葡萄球菌。也可用其他的特性來區(qū)別三者。詳見表3-2。

試驗金黃色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌

血漿凝固酶+——

甘露醇發(fā)酵+——

新生霉素敏感性SS—

A蛋白+——R

表3-2葡萄球菌三個種的鑒別

（三）葡萄球菌常規(guī)鑒定流程

革蘭氏陽性球菌

觸酶

微球菌科鏈球菌屬

葡萄糖發(fā)酵

+—

葡萄球菌屬微球菌屬

凝固酶玻片法

金黃色葡萄球菌__________凝固酶試管法___________

--

金黃色葡萄球菌新生霉素敏感試驗

SR

表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌

第二節(jié)試驗方法

（一）過氧化氫酶（觸酶）試驗

【目的】：

主要用于細菌屬間的鑒別：微球菌和葡萄球菌屬（+）,而鏈球菌屬（一）。

【原理】：

2H202----A2H202+02

【試劑】

3%H2O2溶液，置棕色瓶內于4寸陰暗處保存。

【方法】：

用接種針挑取孵育18-24小時單個菌落，置于潔凈的載玻片上，用滴管在玻片的細菌上

加一滴3%2H202。1分鐘內產(chǎn)生大量氣泡為陽性，不產(chǎn)生氣泡為陰性。玻片在試驗后放在消

毒劑中處理。

【質控】：

陽性對照：金黃色葡萄球菌

陰性對照：鏈球菌

【注意事項】：

1從血平板上挑取菌落做試驗時，不能將血瓊脂帶到玻片上，因紅細胞含有過氧化氫酶會

引起假陽性。

2操作順序（先菌后H2O2）不能顛倒，否則會出現(xiàn)假陽性。

3濃H2O2（30%）是一種強腐蝕性溶液，萬一沾到皮膚上，要立即用70%乙醇（不能用水）沖

洗以中和它的作用。

（二）葡萄球菌氧化發(fā)酵試驗（S-OF）

【目的】：

S-OF培養(yǎng)基按葡萄球菌和微球菌分類小組所推薦的方法制備，用于檢測過氧化氫的

陽性球菌發(fā)酵葡萄糖的能力。S-OF用于鑒別葡萄球菌與微球菌。

【原理】：

S-OF培養(yǎng)基是為了克服采用Hugh和LelfssonOF試驗培養(yǎng)基檢測葡萄球菌發(fā)酵葡萄

糖所遇到的問題而設計的。與OF培養(yǎng)基比較，S-OF培養(yǎng)基營養(yǎng)更高，并且采用不同的

PH指示劑，因而增強了某些種的葡萄球菌產(chǎn)生輕微PH變化的檢出能力。在S-OF培養(yǎng)基,

葡萄球菌發(fā)酵葡萄糖，而微球菌或氧化或不分解葡萄糖。

【培養(yǎng)基】：

1、1.6%漠甲酚紫：漠甲酚紫800mg,0.01M的氫氧化鈉14.8ml,加水至50ml。

2、培養(yǎng)基的成分及制備

胰蛋白陳10g

酵母膏1g

溪甲酚紫1.6%2.5ml

瓊脂3.5g

蒸播水980ml

PH7.0

121℃滅菌15分鐘，待冷卻至50℃時。加入過濾除菌50%葡萄糖20ml分裝試管2—3ml

備用。

【方法】：

用接種針挑取部分菌落于S-OF管穿刺接種4次，穿刺深度約為瓊脂表面下1cm,每

種待檢菌接種兩管，接種后一管加液體石蠟約1cm高，1管不加。35℃培養(yǎng)。每天觀察是否

產(chǎn)酸，連續(xù)觀察4天，然后在第七天作出最后判斷。

【結果判斷】：

發(fā)酵：兩管均變黃

氧化：開放管變黃，石蠟封閉管仍為紫色

不分解：兩管均為紫色

【質控】：

金黃色葡萄球菌一一發(fā)酵

藤黃微球菌一一不分解

（三）血漿凝固酶試驗

【目的】

用于鑒別金黃色葡萄球菌于其它葡萄球菌。

【原理】

金黃色葡萄球菌產(chǎn)生兩種形式的凝固酶，即結合凝固酶和游離凝固酶。結合凝固酶和細

菌細胞壁結合，不存在于濾過培養(yǎng)液中，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，產(chǎn)生纖維蛋白凝

塊。玻片法可檢出此酶。游離凝固酶為胞外酶，為菌細胞所分泌，因而存在于濾過的培養(yǎng)基

液中為試管法所檢出。于結合凝固酶不同，有游離凝固酶首先作用于血漿中的餓凝固酶因子

（CRF）形成凝固酶一一凝固酶反應因子復合物，然后該復合物作用于纖維蛋白原，產(chǎn)生不

溶性的纖維蛋白凝塊。玻片法簡便快述。用于實驗室常規(guī)篩選。試管法準確可靠。玻片法陰

性或可疑（遲緩）陽性或自凝時，應用試管法進一步確定。

【試劑】

兔血漿：從家兔心臟采血，以EDTA抗凝離心后吸取血漿，分裝每管0.5mL凍存?zhèn)溆谩?/p>

【方法】：

1、玻片法

取一滴生理鹽稅于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于鹽水中，制成濃的菌懸

液，若出現(xiàn)自凝現(xiàn)象則采用試管法。若無自凝發(fā)生，則加一環(huán)血漿混入，立即觀察結果，出

現(xiàn)明顯凝塊的為陽性，否則為陰性。陰性或遲緩反應（20?30秒）應以試管法加以證實。

2、試管法

用生理鹽水將血漿1：4稀釋，取0.5ML,然后挑取3-5個菌落于稀釋血漿中，制成濃

懸液，置37℃水浴，在最初4小時內每30分鐘觀察一次。凝固者為陽性，陰性結果則于室

溫孵育過夜，以便檢出緩慢產(chǎn)生或量少的凝固酶。

【質控】

金黃色葡萄球菌一一陽性

表皮葡萄球菌一一陰性

【注意事項】

1、試管法檢查凝塊形成時，不要振動或搖動試管，因為凝固初期的凝塊易破壞，即使

繼續(xù)孵育亦不再形成凝塊。這可引起可疑或假陰性結果.

2、不能使用含鹽的抑制培養(yǎng)基上的生長物做實驗。例如甘露醇含鹽瓊脂培養(yǎng)基。

（四）新生霉素敏感實驗

【目的】

用于腐生葡萄球菌與凝固酶陰性的其它葡萄球菌的推測性鑒別。

【原理】

腐生葡萄球菌能在含有新生霉素的培養(yǎng)基上生長，經(jīng)過適當?shù)慕臃N和培養(yǎng)后，在含5ug

的新生霉素紙片周圍形成的抑菌圈在15mm或以下，表現(xiàn)為耐藥，據(jù)此將實驗菌鑒定為腐

生葡萄球菌，特別是待鑒定菌來自尿培養(yǎng)時。雖然孔氏葡萄球菌，木糖葡萄球菌，賽氏葡萄

球菌也對新生霉素耐藥，但這些菌種很少自尿液中分離出。

【試劑】

新生霉素紙片（商品供應），每片含藥5ug。

【方法】

用棉簽蘸取實驗菌菌液并接種于半塊藥敏或血平板上。待菌液干后，在接種區(qū)域的中央

貼上含5ug/片的新生霉素紙片。35℃培養(yǎng)13-24小時后，根據(jù)抑菌圈大小作出判斷。耐藥

----抑菌圈W15mm,敏感----13mm.

【質控】

應用以下菌種檢查每批紙片，是否符合預期結果。

腐生葡萄球菌一一耐藥

表皮葡萄球菌一一敏感

第四章鏈球菌屬常規(guī)鑒定

第一節(jié)鑒定過程

鏈球菌屬的鑒定分兩個主要步驟，首先與其它革蘭氏陽性球菌鑒別，然后再作菌屬內鑒定。

（一）與其它革蘭氏陽性球菌鑒別

臨床標本中，常見的革蘭氏陽性球菌除鏈球菌外，有葡萄球菌和微球菌、鏈球菌與后兩

類菌的鑒別可依據(jù)其形態(tài)的特點和觸的反應。鏈球菌再鏡下其形態(tài)排列以成雙或成鏈狀為

主，觸酶試驗陽性。葡萄球菌也可成雙排列，但是與鏈球菌不同，成雙的葡萄球菌大小相等、

圓形、而成雙的鏈球菌是橢圓的或是桿菌樣的。

（二）鏈球菌的屬內鑒定

1、初步分群：雖然本屬內包括的菌種數(shù)量很多，如果以幾個主要的生物學特征先分成

幾群，然后在群內再進一步區(qū)分，鑒定到種使會簡化鑒定過程。最簡便的方法是根據(jù)溶血

性及膽汁七葉甘試驗把鏈球菌初步初為三群。

1群乙型溶血鏈球菌群，再血平板上呈溶血

2群膽汁七葉甘試驗陽性菌群。

3群其它草綠色鏈球菌，血平板上溶血或不溶血，膽汁七葉甘試驗陰性。

2、乙型溶血鏈球菌的鑒定：溶血鏈球菌可用血清學反應結合生理生化反應進行鑒定,

但由于試劑的缺乏，常規(guī)實驗室難以進行血清學鑒定。而生理生化方法僅用幾個簡單的試驗

也可初步鑒定，因此是目前大多數(shù)常規(guī)實驗室采用的方法。這一類菌以A、B、C,F、G群

與臨床有關，應予鑒定。

A、B、G、D群一般可用桿菌肽，CAMP、膽汁七葉甘、七葉甘等幾個試驗初步鑒定,

詳見表4-1。

表4-1A、B、G、D群鏈球菌的鑒別

試驗A群B群G群D群

桿菌肽+———

CAMP—+——

七葉甘——++

膽汁七葉甘————+

黃色素—+——

SXT———+—

F、C群的鑒定目前除了血清學以外，尚無理想的生化方法。

3、膽汁七葉甘陽性鏈球菌的鑒定：本群所包括的菌種除鳥鏈球菌抗原屬Q(mào)群外，其

它均為D群，共有五種。膽汁七葉甘試驗是將這五種細菌與其它草綠色鏈球菌區(qū)別的最好

方法。這五種細菌還可分成兩類，即腸球菌和非腸球菌。由于腸球菌對青霉素的敏感性與非

腸球菌不同，腸球菌是耐藥的，非腸球菌是敏感的，故D群鏈球菌引起的心內膜炎的治療

用藥就有所不同，應予以區(qū)別。臨床實驗室可根據(jù)情況將D群鏈球菌鑒定到種或只鑒定到

亞群。6.5%NACL試驗是鑒別腸球菌和非腸球菌較好的試驗。

4、其它草綠色鏈球菌的鑒定：一般說來非溶血鏈球菌都屬這一類，如肺炎鏈球菌、

血鏈球菌、唾液鏈球菌等

肺炎鏈球菌與其它草綠色鏈球菌的鑒別,可根據(jù)Optochin敏感試驗以及膽汁溶菌試驗.

（三）鏈球菌屬常規(guī)鑒定流程

第二節(jié)試驗方法

（-）溶血性檢查：

溶血性檢查是鏈球菌鑒定過程中非常重要的一步。

【培養(yǎng)基】

羊血平板。

【方法】

將菌接種于羊血平板上，用接種針在已接種的血平板上刺數(shù)次，使細菌接種到瓊脂深處。

35℃培養(yǎng)過夜。

【結果判斷】

a一溶血：在血平板上，菌落周圍的紅細胞被部分破壞，呈現(xiàn)一個不清晰的環(huán)，菌落

周圍的培養(yǎng)基帶綠色或褐色。

P一溶血：在血平板上，菌落周圍紅細胞完全溶解，呈現(xiàn)一個無色透明環(huán)。

不溶血（丫一溶血）：菌落周圍無明顯紅細胞溶解，因而無溶血環(huán)。

【注意事項】

1、血瓊脂基礎應采用胰化大豆肉湯，心浸液，Todd—Hewitt肉湯或示蛋白陳。上述培養(yǎng)基

不但提供了鏈球菌必需的營養(yǎng)成分，而且不含可發(fā)酵的糖類（這些糖可影響0—溶血性鏈球

菌的溶血性）。

2、血液的種類與濃度對溶血性亦有影響。腸球菌在馬、兔或人血瓊脂上可產(chǎn)生p—溶血；

而在綿羊血瓊脂上則為a—溶血。血液的濃度一般采用5%。培養(yǎng)基的厚度為4mm為宜。

3、氣體條件可影響溶血性。A群。一溶血性鏈球菌可以產(chǎn)生兩種溶血素。溶血素0對氧敏

感，溶血素S對氧穩(wěn)定。大多數(shù)A群p—溶血性鏈球菌產(chǎn)生溶血素S。膽少數(shù)分離株僅產(chǎn)生

溶血素O。因此在有氧條件下就不表現(xiàn)『溶血。厭氧培養(yǎng)，傾注培養(yǎng)，或在初次分離平板

接種后進行穿刺。這些方法均可降低氧分壓有利于檢出僅產(chǎn)生溶血素S的菌株

（二）桿菌肽敏感試驗

【目的】

該試驗用于A群B—溶血性鏈球菌的推測鑒定。

【原理】

桿菌肽是一種革蘭氏陽性菌所產(chǎn)生的一種抗生素。P—溶血性鏈球菌對該藥物的敏感性

不同，A群敏感，而其它群溶血性鏈球菌為耐藥。

【試劑】

0.04u桿菌肽紙片、羊血平板

【方法】

將0—溶血性鏈球菌的純培養(yǎng)物接種于半塊羊血平板，然后在接種區(qū)貼上含0.04u的桿

菌肽紙片。35℃培養(yǎng)18-24小時，在紙片周圍有抑菌圈（不論大?。┘唇忉尀樵摼舾?。

【質控】

A群p—溶血性鏈球菌——敏感

B群0—溶血性鏈球菌——耐藥

【注意事項】

1、該試驗只適用于0—溶血性鏈球菌。因為許a—溶血性鏈球菌也對桿菌肽敏感。

2、桿菌肽紙片含藥量應為0.04U,而不應采用抗生素敏感試驗的紙片。

（三）CAMP試驗

【目的】

CAMP試驗用于B群鏈球菌的推測鑒定.

【原理】

CAMP因子是由B群鏈球菌所產(chǎn)生的一種可擴散的、熱穩(wěn)定的胞外蛋白質。CAMP因

子與葡萄球菌產(chǎn)生的0—溶血素協(xié)同作用，使綿羊（或牛）的紅細胞快速溶血。但對人、馬

或兔紅細胞則無此作用。

【材料】

1、產(chǎn)生「溶血素的金黃色葡萄球菌。

2、綿羊血平板。

【方法】

將產(chǎn)生B—溶血素的金黃色葡萄球菌接種于羊血平板中央一條長直線。將實驗菌和對照

菌沿著與金黃色葡萄球菌垂直的方向接種，長約2-3cm。注意勿接觸金黃色葡萄球菌接種物。

二者間隔約3cm。35℃孵育過夜。

【結果判定】

在實驗菌和金葡菌接種線之間有一加強溶血區(qū)，可表現(xiàn)為箭頭狀、半月形或火焰形。此

即CAMP試驗陽性。

【質控】

B群鏈球菌一一陽性

A群鏈球菌一一陰性

【注意事項】

1、血液基礎應采用胰化大豆肉湯。血液應采用綿羊血。

2、所采用的金葡菌應能產(chǎn)生p—溶血素。

3、接種前羊血平板應使冷凝水干燥，否則接種物易于擴散或混合。

4、應在大氣或燭缸中孵育。不應在厭氧條件下孵育。有些A群鏈球菌株在燭缸培養(yǎng)可表現(xiàn)

為CAMP陽性。若做厭氧培養(yǎng)。則有更多的A鏈表現(xiàn)為CAMP陽性。

5、經(jīng)適當?shù)姆跤髴⒓从^察并記錄結果。置室溫時經(jīng)過B—溶血素作用的綿羊紅細胞會

發(fā)生冷熱溶血，就難判斷CAMP試驗結果。

（四）黃色素產(chǎn)生試驗

【目的】

用于B群鏈球菌的推測性鑒定。

【原理】

在含淀粉和血清的培養(yǎng)基上，B群鏈球菌產(chǎn)生黃色素，而其它鏈球菌無此特征。該試驗

是B群鏈球菌數(shù)個推測性鑒定試驗中特異性最好的。

【培養(yǎng)基】

1、成分：

膠蛋白陳2.0g

酵母膏粉1.0g

淀粉2.0g

NACL0.2g

NAHCO30.2g

NAHPO4-12H2O0.1g

蒸福水100ml

2、制備：

①淀粉2.0g加蒸儲水50ml加熱溶解。

②余成分混合，溶于50ml蒸鐳水中。

①+②調pH7.4,加入0.2g瓊脂，115℃滅菌20分鐘冷卻至50℃,加1%血清（牛、羊、

馬血清均可）制成半固體。

【方法】

用接種針挑取分離的實驗菌落，于黃色素半固體培養(yǎng)基穿刺接種數(shù)次。35℃孵育24-48

小時。穿刺線出現(xiàn)黃色為陽性，否則為陰性。

【質控】

B群鏈球菌——穿刺線呈現(xiàn)黃色（陽性）

A群鏈球菌一一穿刺線不呈現(xiàn)黃色（陰性）

（五）膽汁七葉甘試驗

【目的】

膽汁七葉靈瓊脂用于鑒定D群鏈球菌。D群鏈球菌能耐受40%的膽汁（4%的膽鹽）并

且能將七葉靈水解成七葉素和葡萄糖。

【原理】

該培養(yǎng)基具有選擇性，只有耐受40%膽汁的那些細菌能夠生長，大多數(shù)革蘭氏陰性桿

菌、葡萄球菌、D群鏈球菌能在該培養(yǎng)基生長。D群鏈球菌水解七葉靈，所產(chǎn)生七葉素與枸

椽酸鐵形成褐黑色的產(chǎn)物。據(jù)此可將D群鏈球菌和其它鏈球菌區(qū)別。

【培養(yǎng)基】

1、成分

蛋白陳5g

牛肉膏3g

七葉甘1g

枸檬酸鐵1.5g

膽鹽40g

瓊脂15g

蒸儲水1000ml

2、制備：

①先將檸檬酸鐵在適量蒸懦水中加熱溶解。

②溶解膽鹽以外的其它成分。

③將①和②混合，調pH7.0,加入膽鹽、瓊脂粉、加熱溶解。

分裝試管。12JC15分鐘滅菌。斜置凝固成斜面。

【方法】

用吸管吸取已孵育24小時Todd-Hewitt肉湯純培養(yǎng)物2滴接種于斜面上。35℃培養(yǎng)。

可以定時檢查，若陽性可報告結果；陰性者需孵育72小時后最終判定結果。

【結果判定】

1、陽性：斜面的一半或大部分變?yōu)榘底厣胶谏?/p>

2、陰性：斜面不變黑；孵育72小時斜面變黑不到一半（+/—反應）。

有生長物時，并不表示七葉甘水解。僅表示膽汁濃度不能抑制除D群鏈球菌以外的細菌生

長。

【質控】

腸球菌一一生長，培養(yǎng)基變黑（陽性）

草綠色鏈球菌一一不生長（陰性）

（六）6.5%NaCl生長試驗

【目的】

用于鑒別腸球菌和D群腸球菌。

【原理】

6.5%Nacl肉湯含有大量蛋白陳和Nack能夠在6.5%Nacl肉湯生長是腸球菌的一個重要

特征。試驗時間以不含高鹽的肉湯作生長對照。如果在含鹽培養(yǎng)基不生長或生長很差，但在

不含鹽的培養(yǎng)基生長良好，則為陰性結果。

【培養(yǎng)基】

蛋白陳20g

牛肉膏粉10g

葡萄糖2g

NAHCO32g

NACL2g

Na2Hp04?12H2O1g

蒸儲水1000ml

溶解調pH7.8,取500ml分裝試管，余加6.3%NaCl分裝試管，115℃20分鐘滅菌，

備用。

【方法】

將實驗菌接種于兩管培養(yǎng)基，一管為含6.5%NaCI,另一管不含所加的鹽，35e孵育

24-72小時，觀察生長情況。

【質控】

腸球菌一一陽性

草綠色鏈球菌一一陰性

（七）Optochin敏感試驗

【目的】

該試驗用于肺炎鏈球菌的推測鑒定。

【原理】

對Optochin（奧普托辛為乙基氫化羥基奎林的商品名）敏感性被用于a-溶血性鏈球菌

和肺炎鏈球菌的鑒別。肺炎鏈球菌對Optochin敏