分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記簡(jiǎn)介

主要內(nèi)容分子標(biāo)記相關(guān)概念分子標(biāo)記的類(lèi)型與發(fā)展幾種分子標(biāo)記的應(yīng)用一

分子標(biāo)記相關(guān)概念

所謂分子標(biāo)記是根據(jù)基因組DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來(lái)的可直接反映生物個(gè)體在DNA水平上的差異的一類(lèi)新型的遺傳標(biāo)記,它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記之后最為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)。1.廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。分子標(biāo)記的概念有廣義和狹義之分2.狹義的分子標(biāo)記概念只是指DNA標(biāo)記

能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。通常所說(shuō)的分子標(biāo)記是指以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。

分子標(biāo)記技術(shù)本質(zhì)上都是以檢測(cè)生物個(gè)體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來(lái)反映基因組之間的差異。

1

分子標(biāo)記發(fā)展簡(jiǎn)史

1.1869年，瑞士醫(yī)生Miescher就開(kāi)始了

核酸的研究。2.1930年提出兩種核酸(RNA和DNA)的概

念。3.1953年Waston和Crick提出了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及其半保留復(fù)制模型之后，對(duì)基因的DNA序列及其表達(dá)和調(diào)控等方面的研究取得了很大進(jìn)展。4.20世紀(jì)60年代中期,從細(xì)胞中分離基因的工作拉開(kāi)了基因工程的序幕。5.60年代末和70年代初,主要致力于研究基因的體外分離技術(shù)。6.1980年Bostern將生物個(gè)體之間DNA序列的差異作為標(biāo)記用于遺傳作圖，從此開(kāi)創(chuàng)了在DNA水平上研究遺傳變異的新階段。7.近10年來(lái)，在人類(lèi)基因組研究計(jì)劃的推動(dòng)下，分子標(biāo)記的研究與應(yīng)用得到迅速的發(fā)展。分子標(biāo)記的歷史第一代分子標(biāo)記技術(shù)RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）第二代分子標(biāo)記技術(shù)

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）事實(shí)上，還有很多分子標(biāo)記技術(shù)像SSR、ISSR、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另外，還有現(xiàn)在號(hào)稱(chēng)為第三代分子標(biāo)記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)

2

分子標(biāo)記來(lái)源于DNA水平的突變突變(Mutation)是指DNA水平的可遺傳的變異，不管這種DNA變異能不能導(dǎo)致可檢測(cè)的表型或生化改變，突變產(chǎn)生的變異是自然選擇的基礎(chǔ)，可遺傳的突變?cè)谌后w中擴(kuò)散從而產(chǎn)生多態(tài)性。多態(tài)性(Polymorphism)－群體內(nèi)同一DNA序列的兩種或多種變異形式，統(tǒng)計(jì)表明：群體內(nèi)任何兩個(gè)生物個(gè)體平均每1000～10000個(gè)堿基對(duì)有一對(duì)有差別，這種差別就是多態(tài)性。3

分子標(biāo)記的特點(diǎn)

(相對(duì)形態(tài)，細(xì)胞，生化標(biāo)記具有的優(yōu)點(diǎn))：

（1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題；（2）數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無(wú)限；（3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)須人為創(chuàng)造；（4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。理想的分子標(biāo)記必須達(dá)以下要求：具有高的多態(tài)性共顯性遺傳，即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型能明確辨別等位基因遍布整個(gè)基因組除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外，要求分子標(biāo)記均勻分布于整個(gè)基因組選擇中性(即無(wú)基因多效性)檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化)開(kāi)發(fā)成本和使用成本盡量低廉在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿(mǎn)足以所有要求二類(lèi)型及原理

現(xiàn)已出現(xiàn)的分子標(biāo)記技術(shù)有幾十種，部分分子標(biāo)記技術(shù)所屬類(lèi)型如下：建立在Southern雜交基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)；染色體原位雜交(CISH)。以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)衛(wèi)星DNA(SatelliteDNA)；小衛(wèi)星DNA(MinisatelliteDNA)；簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR(SimpleSequenceRepeat)，即微衛(wèi)星DNA。以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)；單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)；cDNA-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(cDNA-AFLP

)；靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性(TRAP)；序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)。以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)；差異顯示(DD)；逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)；差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)；特征性差異分析(RAD)；基因表達(dá)系列分析(SAGE)。以單個(gè)核甘酸的變異為核心的分子標(biāo)記技術(shù)

單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)以特定序列為核心的分子標(biāo)記技術(shù)

線粒體DNA分子標(biāo)記(mtDNA)三.幾種分子標(biāo)記介紹

1.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記

RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，為第一代多態(tài)性記。原理：限制性?xún)?nèi)切酶能識(shí)別并切割基因組DNA分子中特定的位點(diǎn)，如果因堿基的突變、插入或缺失，或者染色體結(jié)構(gòu)的變化而導(dǎo)致生物個(gè)體或種群間該酶切位點(diǎn)的消失或新的酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，

那么利用特定的限制性?xún)?nèi)切酶切割不同個(gè)體的基因組DNA，

就可以得到長(zhǎng)短、數(shù)量、種類(lèi)不同的限制性DNA片段，通過(guò)電泳和Southern雜交轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上,選用一定的DNA標(biāo)記探針與之雜交，放射自顯影后就可得到反映個(gè)體特異性的DNA限制性片段多態(tài)性圖譜。RFLP原理：DNA限制性?xún)?nèi)切酶酶切電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小RFLP的應(yīng)用1.遺傳學(xué)圖的構(gòu)建結(jié)合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測(cè)出的基因及其DNA片段都可以通過(guò)回交，快速有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)移。2.基因定位利用RFLP技術(shù)能夠準(zhǔn)確地標(biāo)記定位種質(zhì)中的目標(biāo)基因，結(jié)合雜交，回交及組織培養(yǎng)等技術(shù)就可以快速有效的將所需目標(biāo)基因的DNA片段引入栽培品種中，實(shí)現(xiàn)品種改良。

3.遺傳多態(tài)性分析運(yùn)用RFLP技術(shù)可以盡可能多地保存那些在已知位點(diǎn)上有異態(tài)的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細(xì)胞質(zhì)遺傳研究RFLP技術(shù)是對(duì)DNA序列自然變異的直接檢測(cè)，只需選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶或DNA探針作分子標(biāo)記，因而對(duì)植物不同種屬或雜種后的細(xì)胞質(zhì)遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應(yīng)用于細(xì)胞質(zhì)遺傳的研究。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)優(yōu)點(diǎn)標(biāo)記廣泛存在于生物體內(nèi)，不受組織、環(huán)境和發(fā)育階段的影響。RFLP標(biāo)記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區(qū)分純合基因與雜合基因。可產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目很多，可覆蓋整個(gè)基因組。缺點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)需要酶切,對(duì)DNA質(zhì)量要求高；RFLP

的多態(tài)性程度偏低；分子雜交時(shí)會(huì)用到放射性同位素，對(duì)人體和環(huán)境

都有害；探針的制備、保存和發(fā)放也很不方便；分析程序復(fù)雜、技術(shù)難度大、費(fèi)時(shí)、成本高。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)2.隨意擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA概念：RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)的基礎(chǔ)之上，它是利用一系列不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物在一定的退火條件下，

與基因組DNA中的互不順序配對(duì)，通過(guò)DNA聚合酶的作用，能啟動(dòng)DNA的合成，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)聚丙酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)EB染色或放射線自顯影檢測(cè)。這些擴(kuò)增產(chǎn)物（DNA片段）的多態(tài)性可以反映基因組相應(yīng)區(qū)域的多態(tài)性。原理：1.利用一個(gè)隨機(jī)引物(一般為10個(gè)堿基)通過(guò)PCR反應(yīng)非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段；2.擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺電泳分離；3.溴化乙錠染色或銀染等專(zhuān)一性染色技術(shù)即可記錄RAPD指紋；

4.進(jìn)行DNA多態(tài)性分析。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)RAPD技術(shù)流程：RAPD分子標(biāo)記的應(yīng)用RAPD技術(shù)已在苜蓿，豆類(lèi)，番茄，遼東櫟，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花，月季，牡丹，錦雞兒，野大豆，桉樹(shù)，玉米，水稻等多種植物中廣泛應(yīng)用。目前主要用于以下4個(gè)方面的研究：a：研究種質(zhì)資源的親緣關(guān)系和遺傳背景。b：種質(zhì)資源（含親本材料）的分類(lèi)。c：種質(zhì)的遺傳變異評(píng)價(jià)。d:核心種質(zhì)篩選?；蜻B鎖圖的構(gòu)建：Tulsieram等最早利用RAPD標(biāo)記在胚乳組織進(jìn)行白石杉的遺傳學(xué)圖構(gòu)建，而后用相同的策略又相繼構(gòu)建了濕地松、歐洲赤松、火炬松等的遺傳學(xué)圖。新遺傳資源的鑒定：李松濤等對(duì)抗銹病的兩個(gè)小冰麥進(jìn)行RAPD分析，從40個(gè)引物中篩選到一個(gè)與抗銹基因連鎖的RAPD標(biāo)記。分析結(jié)果有力地說(shuō)明，小冰麥?zhǔn)菑谋莴@得抗銹基因的易位系。優(yōu)點(diǎn)：技術(shù)簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，信息量大，檢測(cè)速度快；DNA用量少；實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進(jìn)行序列分析；不依賴(lài)于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段，幾乎覆蓋整個(gè)基因組，而且不需要同位素，安全性好。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)缺點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性差顯性遺傳，不能識(shí)別雜合子位點(diǎn)，這使得遺傳分析相對(duì)復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時(shí)，會(huì)因顯性遮蓋作用而使計(jì)算位點(diǎn)間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降；RAPD對(duì)反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)3、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記—SSR

（simplesequenceRepeats）

簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)即微衛(wèi)星DNA

微衛(wèi)星是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸(1~6個(gè))為單位

多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。

微衛(wèi)星由核心序列和兩側(cè)的保守側(cè)翼序列構(gòu)成。保守的側(cè)翼序列使微衛(wèi)星特異地定位于染色體某一區(qū)域，核心序列重復(fù)數(shù)的差異則形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。原理：由于重復(fù)次數(shù)的不同及重復(fù)程度的不完全造成了每個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性。根據(jù)其兩端的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增，再經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳即可顯示不同基因型個(gè)體在這個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)

SSR基本步驟：(1)構(gòu)建小片段或大片段的基因組。(2)篩選陽(yáng)性克隆。通過(guò)傳統(tǒng)的影印或挑單菌落點(diǎn)膜的方法，把克隆轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，經(jīng)過(guò)固定后，用標(biāo)記過(guò)的序列重復(fù)寡核苷酸或含微衛(wèi)星序列的探針與尼龍膜上的克隆點(diǎn)雜交，篩選出其中的陽(yáng)性克隆。(3)測(cè)序、設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)確認(rèn)后，全部或經(jīng)過(guò)隨機(jī)挑選后測(cè)序，然后根據(jù)微衛(wèi)星序列兩側(cè)保守區(qū)域的序列設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化PCR擴(kuò)增的條件，獲得穩(wěn)定、可靠的SSR標(biāo)記。應(yīng)用是種群研究和進(jìn)化生物學(xué)最常用的分子標(biāo)記之一，廣泛地應(yīng)用于生物雜交育種、遺傳連鎖圖譜、種群遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)生等研究領(lǐng)域。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)微衛(wèi)星標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：

分布廣泛、多態(tài)性豐富、雜合度高、通用性好以及擴(kuò)增反應(yīng)所需模板量少、重復(fù)性好，共顯性遺傳、檢測(cè)方便、結(jié)果穩(wěn)定。優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：SSR標(biāo)記的建立首先要對(duì)為微衛(wèi)星側(cè)翼序列進(jìn)行克隆、測(cè)序、人工合成設(shè)計(jì)引物以及標(biāo)記的定位、作圖等基礎(chǔ)性究，因而其開(kāi)發(fā)有一定的困難，費(fèi)用也很高。

4.擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記—AFLP

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism

1992年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的新方法。定義由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導(dǎo)致增加或減少限制性酶切位點(diǎn)，這種差異可通過(guò)選擇性的PCR擴(kuò)增而檢測(cè)。AFLP是在RFLP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，差別在于檢測(cè)手段。

AFLP的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)選擇性擴(kuò)增引物以及不同引物組合。原理：AFLP是建立在基因組限制性片段基礎(chǔ)上的PCR擴(kuò)增。由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導(dǎo)致增加或減少限制性酶切位點(diǎn)，這種差異可通過(guò)選擇性的PCR擴(kuò)增而檢測(cè)使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板,用含有選擇性堿基的引物對(duì)摸板DNA進(jìn)行擴(kuò)增,選擇性堿基的種類(lèi)、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性,只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢出多態(tài)性.AFLP技術(shù)路線1.基因組DNA被酶切成小片段：通常用一個(gè)四個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶如MseI和一個(gè)六個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的酶如EcoRI，其中MseI確保產(chǎn)生合適大小的DNA片段，這些片段能在序列膠上進(jìn)行有效的分離；而六個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)酶EcoRI能夠限制擴(kuò)增片段數(shù)目，確保DNA多態(tài)性的正常檢測(cè)；2.接頭與酶切片段的連接：接頭序列包括：一個(gè)核心序列和酶切位點(diǎn)特異序列，MSE接頭和ECORI接頭，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.預(yù)擴(kuò)增：應(yīng)用一對(duì)引物對(duì)酶切片段進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，目的是富聚目標(biāo)片段，減少本底，擴(kuò)增引物序列為接頭序列加一個(gè)選擇核甘酸。只有一端為EcoRI切點(diǎn)，一端為MseI切點(diǎn)的DNA酶切片段，同時(shí)也與選擇核甘酸配對(duì)的DNA序列才能被擴(kuò)增。1～3步的產(chǎn)物可以通過(guò)Agarose膠檢測(cè)。4.選擇擴(kuò)增：應(yīng)用含有接頭序列和三個(gè)選擇核甘酸序列的引物進(jìn)行選擇擴(kuò)增。通過(guò)這一輪擴(kuò)增，進(jìn)一步降低擴(kuò)增片段數(shù)量，同時(shí)一個(gè)引物被同位素或熒光染料標(biāo)記（也可用銀染），電泳后壓片檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)

1）非常高的基因型分析效率；

2）不需要標(biāo)記開(kāi)發(fā)成本，但是需要優(yōu)化特異引物及引物組合；

3）不需要基因組DNA序列信息；

4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual).5）AFLP可應(yīng)用于任何生物。缺點(diǎn)1）需要高質(zhì)量的DNA，以確保酶切完全；2）從單個(gè)多態(tài)性DNA片段開(kāi)發(fā)位點(diǎn)特異性標(biāo)記相當(dāng)困難；3）多數(shù)情況下采用的是同位素標(biāo)記；4）在染色體上不均勻分布，AFLP標(biāo)記經(jīng)常在著絲粒附近區(qū)域高度聚集AFLP標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究種質(zhì)資源鑒定分子標(biāo)記輔助選擇育種基因表達(dá)和基因克隆SNP主要是指在基因組水平上由于單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。也即SNP是同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化。

主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5.單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)原理：

SNP與RFLP及SSR標(biāo)記的不同有2個(gè)方面：其一，SNP不再以DNA片段的長(zhǎng)度變化作為檢測(cè)手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記；其二，SNP

標(biāo)記分析完全摒棄了經(jīng)典的凝膠電泳，代之以最新的DNA

芯片技術(shù)。對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)克隆測(cè)序，用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)和顯示最終結(jié)果。檢測(cè)DNA芯片技術(shù)，最新報(bào)道的微芯片電泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地檢測(cè)臨床樣品的SNP。雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價(jià)固定在載體表面，用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號(hào)，并行讀取芯片上不同SNP熒光信號(hào)，獲得SNP信息。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)應(yīng)用種群生物學(xué)特征、遺傳性疾病檢測(cè)、疾病關(guān)聯(lián)分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數(shù)量性狀定位等方面也有越來(lái)越多的應(yīng)用。單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNP)優(yōu)點(diǎn)

數(shù)量多，分布廣泛，檢測(cè)快速、

易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，遺傳穩(wěn)定性高。缺點(diǎn)成本高，錯(cuò)誤信號(hào)多。四作物育種中分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

一、品種、品系鑒定和雜交種純度分析

指紋圖譜是鑒別品種、品系的有利工具，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的條件下，指紋圖譜在檢測(cè)良種質(zhì)量（真?zhèn)?、純度），防止偽劣種子流入市場(chǎng)，保護(hù)名、優(yōu)、特種質(zhì)及育成品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)和育種家的權(quán)益等方面有重要意義。在國(guó)外，指紋圖譜用來(lái)鑒定作物品種的DUS（Distinctness，Unformity，Stability），為品種審定、保存、保護(hù)提供依據(jù)。

雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。對(duì)遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的評(píng)價(jià)方法經(jīng)歷了從形態(tài)性狀遺傳距離，到生化標(biāo)記遺傳差異，親緣系數(shù)，以及分子標(biāo)記遺傳差異等各種嘗試。

雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)及機(jī)理研究DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得能夠在整個(gè)基因組范圍內(nèi)對(duì)大量親本材料間的遺傳距離進(jìn)行估測(cè)，并在此基礎(chǔ)上有效地預(yù)測(cè)具有強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的組合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。結(jié)果：既有相關(guān)性很高的報(bào)道，又有完全相反的結(jié)果。分子標(biāo)記雜合度與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性因遺傳材料而異，在經(jīng)過(guò)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，兩者之間高度相關(guān)，而在一些未經(jīng)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，相關(guān)程度很低。提出了“上位性是雜種優(yōu)勢(shì)的主要遺傳基礎(chǔ)”的重要觀點(diǎn)。應(yīng)用cDNA－AFLP技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)與弱優(yōu)勢(shì)組合間基因表達(dá)有明顯差異，有增強(qiáng)型、減弱型和沉默型。雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)與單親沉默、雙單親沉默有密切關(guān)系。大量研究表明，雖然分子標(biāo)記揭示的遺傳距離與雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系比較復(fù)雜，但親本之間的遺傳差異是產(chǎn)生的主要原因。通過(guò)對(duì)與雜種優(yōu)勢(shì)相關(guān)QTLs效應(yīng)的研究，可以加深對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的了解。二、親緣關(guān)系分析

1.DNA標(biāo)記所檢測(cè)的是作物DNA水平的差異，因而非常穩(wěn)定，在分子圖譜幫助下對(duì)品種之間的比較可覆蓋，大大提高了結(jié)果的可靠性?？捎糜谄贩N資源的鑒定與保存，研究作物的起源與發(fā)展進(jìn)化，雜交親本的選擇等。2.利用分子標(biāo)記可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關(guān)系，從而確定親本間遺傳距離，指導(dǎo)雜交育種親本選配，減少雜交組合數(shù)，有效劃分雜種優(yōu)勢(shì)群，為提高育種效率提供依據(jù)。3.通過(guò)親緣關(guān)系分析，可以糾正形態(tài)分類(lèi)中一些不恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)論以及目前育種工作中存在的一些問(wèn)題。孟祥棟通過(guò)對(duì)洋蔥、胡蔥、大蔥的RAPD遺傳分析，否定了“胡蔥親緣關(guān)系與大蔥相近”的觀點(diǎn)，而發(fā)現(xiàn)胡蔥與洋蔥親緣關(guān)系較近，并推斷胡蔥可能是洋蔥與大蔥雜交后代逐漸進(jìn)化而來(lái)的。大蔥洋蔥胡蔥

三、基因標(biāo)記及標(biāo)記輔助育種（Marker-assistedSelection，MAS）

許多性狀重要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為質(zhì)量遺傳特點(diǎn)，如抗病、抗蟲(chóng)、雄性不育、自交不親和性等。質(zhì)量性狀雖然受少數(shù)主基因控制，但其中的許多性狀仍受遺傳背景、微效基因及環(huán)境因素影響，表現(xiàn)為數(shù)量性狀特點(diǎn)。利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，是進(jìn)行質(zhì)量性狀選擇的有效途徑。標(biāo)記目標(biāo)性狀的方法主要有兩個(gè)：

（一）Young等人提出近等基因系法（Near-isog