GB-T非淀粉多糖水解酶活力測(cè)定征求意見(jiàn)稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

非淀粉多糖水解酶活力測(cè)定

Determinationofnon-starchpolysaccharidehydrolaseactivity

（征求意見(jiàn)稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

非淀粉多糖水解酶活力測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非淀粉多糖水解酶活力的一種通用測(cè)定方法，包括儀器和設(shè)備、試劑和材料、試驗(yàn)步

驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶等常見(jiàn)的單一及復(fù)合非淀粉多糖水解酶制

劑的活性測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB5009.7食品中還原糖的測(cè)定

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語(yǔ)與定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1

非淀粉多糖水解酶non-starchpolysaccharidehydrolase

能催化纖維素、β-葡聚糖、果膠和木聚糖等非淀粉多糖底物中的糖苷鍵斷裂，產(chǎn)生還原糖的一系列

酶類，包括纖維素酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、木聚糖酶等單一及其復(fù)合酶。

3.2

酶活力單位enzymeactivityunit

在45℃，pH5.50，反應(yīng)60min的條件下，每分鐘降解濾紙?jiān)嚇俞尫?μmol還原糖所需要的酶量

為1個(gè)酶活單位，以U表示。

4原理

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單一及復(fù)合的非淀粉多糖水解酶制劑可以水解濾紙，木聚糖、β-葡聚糖和果膠產(chǎn)生還原糖。還原糖

在沸水浴條件下可以將3,5-二硝基水楊酸（DNS）還原成棕紅色的氨基化合物（3-氨基-5-硝基水楊酸）。

該化合物在540nm波長(zhǎng)下有最大吸收。在一定范圍內(nèi)，該吸光度與還原糖含量呈一定的線性關(guān)系。而還

原糖的生成量又與單一及復(fù)合的非淀粉多糖水解酶的活力成正比。因此，通過(guò)分光光度法測(cè)定反應(yīng)液在

540nm的吸收強(qiáng)度，可以計(jì)算單一及復(fù)合的非淀粉多糖水解酶的活力。

5試劑和材料

除特殊說(shuō)明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級(jí)水。

5.4200g/L氫氧化鈉溶液

稱取20.0g氫氧化鈉，加水溶解，定容至100mL。

5.50.1mol/L乙酸溶液

量取0.60mL冰乙酸，加水稀釋，定容至100mL。

5.60.1mol/L乙酸鈉溶液

稱取1.36g三水乙酸鈉，加水溶解，定容至100mL。

5.70.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，pH=5.5

準(zhǔn)確稱取23.14g三水乙酸鈉，加冰乙酸1.70mL，加水溶解，定容至2000mL。測(cè)定溶液pH，若pH

偏離5.5，則用0.1mol/L的乙酸溶液（5.5）或0.1mol/L的乙酸鈉溶液（5.6）調(diào)節(jié)pH至5.5。

5.810mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖(5.2)1.000g,加水溶解，定容至100mL。

5.93,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）

準(zhǔn)確稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g，加水500mL攪拌溶解，水浴至45℃，然后逐漸加入氫氧化

鈉溶液（5.4）100mL，邊加邊攪拌，直至完全溶解（溫度不要超過(guò)48℃），再逐步加入酒石酸鉀鈉91.0

g，苯酚2.50g和亞硫酸鈉2.50g，攪拌至溶解，冷卻至室溫后，定容至1000ml。過(guò)濾，將濾液儲(chǔ)存

在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后方可使用，有效期為6個(gè)月。

警告：處理酸堿和配制DNS試劑時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥或通風(fēng)良好的房間進(jìn)行，戴上保護(hù)眼鏡和乳膠手套，

一旦皮膚或眼睛接觸了上述物質(zhì)，及時(shí)用大量的水沖洗。

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6儀器與設(shè)備

6.1分析天平：精度0.001g。

6.2pH計(jì)：精確至0.01。

6.3離心機(jī)：最小轉(zhuǎn)速不小于1000×g。

6.4恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在30℃~60℃之間，精度為0.1℃。

6.5移液槍：精度為1μL。

6.6定性濾紙：快速定性濾紙孔徑8-15um，直徑9cm。

7分析步驟

7.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

7.1.1分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.8）0.00、0.20、0.40、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00mL于10mL

容量瓶中，用水定容至10.0mL，配置成濃度為0.00mg/mL~2.00mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)系列。

7.1.2分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（7.1.1）各1.0mL于25mL具塞玻璃試管中，加去離子水2.0mL和DNS

試劑（5.9）2.0mL于各管中（每管3個(gè)平行），混勻。將標(biāo)準(zhǔn)管同時(shí)置于沸水浴中，反應(yīng)5min，流水冷

卻，蒸餾水定容至25.0mL，混勻。測(cè)量540nm處吸光度。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。

7.2酶制劑溶液準(zhǔn)備

固體樣品：參見(jiàn)附錄A稱取適量待測(cè)酶制劑試樣，精確至0.001g。加入40.0mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶

液（5.7），低溫磁力攪拌30min，再用緩沖溶液（5.7）補(bǔ)充至100.0mL，在4℃下避光靜置1h?；靹蚝?，

1000×g，4℃，離心3~5min。取上清，再用緩沖溶液（5.7）做二次稀釋（稀釋后的待測(cè)酶液酶活應(yīng)

控制在0.04U/mL~0.1U/mL），并用乙酸（5.5）或乙酸鈉溶液（5.6）調(diào)節(jié)pH為5.5。

液體樣品：直接用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（5.7）按標(biāo)識(shí)酶活力進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使稀釋后酶活控制在

0.04U/mL~0.1U/mL，并用乙酸（5.5）或乙酸鈉溶液（5.6）調(diào)節(jié)pH為5.5。

7.3酶制劑溶液活性測(cè)定

7.3.1吸取10.0mL經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的待測(cè)酶液（7.2），45℃平衡10min。

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GB/T××××—201×

7.3.2在25mL具塞比色管中加入濾紙片。定性濾紙（6.10）須對(duì)稱剪成32片并全部放入，加1.0mL乙

酸-乙酸鈉緩沖溶液（5.7）浸潤(rùn)濾紙條，45℃水浴平衡10min。

7.3.3實(shí)驗(yàn)組：在平衡后的濾紙片（7.3.2）中依次加入0.50mL待測(cè)酶液（7.3.1），5.0mL水，振蕩3s~5s，

45℃水浴保溫60min，加2.0mLDNS試劑（5.9），然后沸水浴煮沸5min，自來(lái)水冷卻至室溫，加水定

容至25.0mL。在540nm處測(cè)吸光度A1。

7.3.4對(duì)照組：在平衡后的濾紙片（7.3.2）中依次加2.0mLDNS試劑（5.9），0.50mL待測(cè)酶液（7.3.1）

和5.0mL水，振蕩3s~5s，45℃水浴保溫60min，然后沸水浴煮沸5min，自來(lái)水冷卻至室溫，加水定容

至25.0mL。在540nm處測(cè)吸光度A0。

8結(jié)果計(jì)算與分析

酶活力按照式（1）計(jì)算：

…….…….（1）

m

(?×t)

式中：X=×1000×n

X——非淀粉多糖水解酶的酶活力（U）；

m——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程上計(jì)算得的(A1-A0)值對(duì)應(yīng)的葡萄糖的質(zhì)量（mg）；

M——葡萄糖的摩爾質(zhì)量（180.2g/mol）；

t——酶解反應(yīng)時(shí)間（min）；

1000——轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000μmol；

n——酶制劑稀釋倍數(shù)。

平行重復(fù)測(cè)定至少3次，以平行樣的平均值為最終的酶活力，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

9重復(fù)性

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)值差值不得超過(guò)算數(shù)平均值的10%。

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附錄A

（資料性附錄）

樣品酶活力與建議稱取量對(duì)應(yīng)關(guān)系

表A.1.樣品酶活力與建議稱取量對(duì)應(yīng)關(guān)系。

非淀粉多糖水解酶活力/（U/g）（或者U/mL）稱取量/g（或者mL）

≥20000.1~0.2

50~1999