GB-TDNA甲基化的測定 焦磷酸測序法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會計劃項目，項目編號為

20182192-T-424。本項目由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2019年完成。

本標(biāo)準(zhǔn)起草工作由河北醫(yī)科大學(xué)等單位共同完成。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的及意義

DNA甲基化是DNA的一種序列修飾，即胞嘧啶發(fā)生了一個甲基基團的修

飾。哺乳細(xì)胞中，甲基化主要發(fā)生在CG中的胞嘧啶（C）上，而植物細(xì)胞中胞

嘧啶甲基化的形式更為廣泛。多項研究表明，DNA序列雖然未發(fā)生改變，但

DNA甲基化能修飾會引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋

白質(zhì)相互作用方式的改變，從而影響基因的表達(dá)；同時，DNA甲基化是個可逆

的過程，通常DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，而去甲基化則誘導(dǎo)了基因

的重新活化和表達(dá)。

焦磷酸測序可具體分析DNA甲基化程度，可對每個CpG或CpN進(jìn)行甲基

化定量，無需克隆就能獲得可靠、高靈敏度的結(jié)果；分析速度快，幾小時就能

獲得定量結(jié)果。在醫(yī)療診斷、法醫(yī)檢測、及植物研究中均有重要應(yīng)用。研究顯

示，腫瘤的發(fā)生和生長與DNA甲基化的變化有關(guān)。采用焦磷酸測序定量檢測

DNA甲基化水平，可以對癌癥進(jìn)行早期篩查，對腫瘤進(jìn)行分類，并可預(yù)測、監(jiān)

控藥物治療反應(yīng)。在法醫(yī)常規(guī)工作中，經(jīng)常會碰到無法和數(shù)據(jù)庫配對的犯罪嫌

疑人或受害者檢身份信息的情況，而焦磷酸測序通過甲基化位點檢測，能為犯

罪嫌疑人或受害者的年齡鑒定提供更準(zhǔn)確的判定標(biāo)準(zhǔn)。測序準(zhǔn)確率高，可以大

大地縮小篩選的范圍，提供一個更加客觀的年齡判定標(biāo)準(zhǔn)。在植物科學(xué)研究

中，常需要鑒別純合子、雜合子和多倍體不同雜合狀態(tài)，焦磷酸測序技術(shù)可以

靈敏地對甲基化頻率進(jìn)行快速定量，且焦磷酸測序不僅可以檢測CpG甲基化位

點，還可以檢測非CpG甲基化位點，適用于植物研究。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

嚴(yán)格按照GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)

則》的要求，制定該項國家標(biāo)準(zhǔn)。

四、主要工作過程

主要起草單位河北醫(yī)科大學(xué)開展的主要工作過程如下：

1、2017年1月，組成標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，安排了工作進(jìn)度。

2、2017年1月~2017年3月，起草工作組查閱了國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于此方

法的規(guī)定，調(diào)研了國內(nèi)外有關(guān)DNA甲基化檢測方法的情況，起草了標(biāo)準(zhǔn)討論

稿。

3、2017年4月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組對標(biāo)準(zhǔn)討論稿進(jìn)行了討論，形成第二輪

標(biāo)準(zhǔn)討論稿。

4、2017年5月，征求專家意見，形成第三輪標(biāo)準(zhǔn)討論稿。

5、2017年3月~2017年11月，對目前多種DNA甲基化檢測方法進(jìn)行驗證。

6、2017年12月，召開標(biāo)準(zhǔn)研制推進(jìn)會，對標(biāo)準(zhǔn)研制過程中的問題進(jìn)行討

論，商討解決方案。

7、2018年1月，標(biāo)準(zhǔn)起草工作組邀請專家對標(biāo)準(zhǔn)討論稿提出意見。

8、2018年2月~2018年5月，進(jìn)一步對標(biāo)準(zhǔn)討論稿進(jìn)行修訂，形成標(biāo)準(zhǔn)草

案。

9、2018年10月，本標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會批準(zhǔn)，獲得立項。

10、2018年10月，完成標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明的初稿。

11、2018年11月，完成第三方論證，召開專家征求意見會，進(jìn)行充分討

論，進(jìn)一步根據(jù)專家意見修改和完善征求意見稿。

13、2018年12月~2019年2月，向全社會征求意見，并向中國科學(xué)院、中國

農(nóng)科院、清華大學(xué)、北京大學(xué)、中國醫(yī)科大學(xué)、首都醫(yī)科大學(xué)、河北省食品監(jiān)

督檢驗研究院、河北師范大學(xué)、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院、河北省人民醫(yī)院、凱

杰生物技術(shù)（中國）有限公司等高校、科研院所、企業(yè)、政府單位發(fā)函征求意

見。截至到2019年3月1日，共收到7封意見書。編寫組對意見進(jìn)行認(rèn)真研究，采

納40條，未采納3條，并對文中相應(yīng)部分進(jìn)行了修改與完善，形成了標(biāo)準(zhǔn)送審

稿。

14、2019年5月，中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院組織專家進(jìn)行審查。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

在本標(biāo)準(zhǔn)制定過程中，隨著研究的深入，先后完成標(biāo)準(zhǔn)討論稿、草案和標(biāo)

準(zhǔn)征求意見稿，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容不斷完善，并趨于科學(xué)合理。根據(jù)需要，本標(biāo)準(zhǔn)的主

要技術(shù)內(nèi)容確定為：

（一）前言部分。給出了標(biāo)準(zhǔn)的起草原則、歸口單位、起草單位及主要起

草人。

（二）范圍。給出了本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍。

（三）縮略語。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的縮略語。

（四）術(shù)語和定義。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的相關(guān)術(shù)語及其定義。

（五）試劑和材料。給出了本標(biāo)準(zhǔn)中用到的化學(xué)試劑、緩沖液、試劑盒

等。

（六）儀器設(shè)備。給出了本標(biāo)準(zhǔn)所需的儀器和設(shè)備。

（七）主要技術(shù)內(nèi)容的說明

1、樣品的選擇

陽性樣品：完全甲基化的樣本

陰性樣品：無甲基化的樣本

測試標(biāo)本——前列腺組織、精液、前列腺癌組織、乳腺組織、膠質(zhì)母細(xì)胞

瘤、食管上皮細(xì)胞、煙草BY-2懸浮細(xì)胞、白細(xì)胞、血液、唾液等

2、PCR升降溫溫度優(yōu)化

PCR擴增是焦磷酸測序的重要步驟，其中模板DNA的添加量、PCR程序

設(shè)置等，均會影響焦磷酸測序的成功與否。在法醫(yī)檢測領(lǐng)域，由于案件檢測的

模板核酸含量很少且珍貴，因此很難對模板添加量進(jìn)行優(yōu)化，這就尤其需要對

PCR擴增的程序進(jìn)行選擇，以達(dá)到最佳的擴增效果。我們針對PCR的變溫速度

設(shè)計梯度實驗，分別設(shè)計1℃/s、2℃/s和3℃/s。實驗?zāi)０宀捎镁簶颖荆瑱z測

精液的標(biāo)記基因ZC3H12D。使用EZ1DNAInvestigator?Kit核酸提取試劑盒提

取DNA，并用AppliedBiosystems?Quantifiler?TrioKi進(jìn)行核酸定量。亞硫酸

鹽轉(zhuǎn)化采用EpiTect?FastDNABisulfiteKit試劑盒，程序見表1：

表1.EpiTect?FastDNABisulfiteKit亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化程序

轉(zhuǎn)化后的核酸利用QIAcube儀器進(jìn)行純化，獲得高質(zhì)量的核酸，以進(jìn)行后

續(xù)PCR擴增。使用一對擴增引物（其中一條有生物素標(biāo)記）進(jìn)行PCR擴增，

獲得擴增產(chǎn)物。擴增程序見表2：

表2.PyroMarkQ48采用的PCR擴增程序

將擴增產(chǎn)物和所需試劑加入焦磷酸測序儀中，儀器自動進(jìn)行測序引物的分

配，并實時監(jiān)測測序過程，焦磷酸測序結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，核酸通過

低變溫速度PCR擴增，其標(biāo)記基因ZC3H12D甲基化頻率可以被焦磷酸測序儀

更穩(wěn)定的檢測，獲得更優(yōu)的結(jié)果。而使用高變溫速度進(jìn)行PCR擴增，會影響焦

磷酸測序?qū)Φ皖l甲基化的檢測，對于標(biāo)記基因ZC3H12D的5個甲基化位點的

判斷定量結(jié)果穩(wěn)定性變差。因此，對于受核酸含量限制的檢材檢測而言，在檢

測低頻甲基化時，推薦使用低變溫速度PCR進(jìn)行擴增。

圖1.采用不同PCR變溫速度所得的焦磷酸測序峰圖。較高的變溫速度（3℃

/s）對ZC3H12DJIA的5個甲基化位點的定量偏高或偏低，而較低的變溫速度

（1℃/s）可獲得更穩(wěn)定的定量結(jié)果。

3、靈敏度檢測

為了分析焦磷酸測序?qū)怂釞z測的靈敏度，使用從精液樣本中提取的

DNA，梯度稀釋后進(jìn)行焦磷酸測序。結(jié)果如圖2所示，焦磷酸測序可以檢測低

至0.05ng的DNA，但是定量檢測結(jié)果與實際結(jié)果相比略有差異，可能是由于

極微量的核酸導(dǎo)致焦磷酸測序的特異性和準(zhǔn)確性有所降低。而使用0.1ng的

DNA上樣，可以獲得準(zhǔn)確的甲基化頻率檢測。此外，使用更低的DNA含量—

—0.01ng，則焦磷酸測序無法檢出。實驗表明，此項研究中焦磷酸測序的DNA

檢測靈敏度一般可達(dá)0.05ng~0.1ng。

圖2.添加不同DNA量得到的焦磷酸測序結(jié)果。A.0.1ngDNA添加量；B.0.05

ngDNA添加量；C.0.01ngDNA添加量

4、方法的重復(fù)性驗證

在前列腺癌biomarker研究中，選擇無甲基化的前列腺組織樣本，利用

QIAGENQIAampDNAMinikit進(jìn)行核酸提取，隨后進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化及

PCR，設(shè)置三個重復(fù)，分別的檢測結(jié)果如圖3所示。由圖可見，三個重復(fù)孔的

對待檢位點的判讀均為2%，說明方法的重復(fù)性良好。

圖3.焦磷酸測序?qū)o甲基化樣本的定量重復(fù)性的驗證

此外，我們以O(shè)ligo（寡核苷酸）標(biāo)準(zhǔn)品為實驗材料，進(jìn)一步對焦磷酸測序

的重復(fù)性進(jìn)行了驗證。具體過程和結(jié)果如下：

（1）性能指標(biāo)：

對0.5pmol和2pmol的兩組Oligo（寡核苷酸）樣本分別進(jìn)行檢測，每組

Oligo包括%C含量不同的3份樣本（A(5%)、B(95%)、C(50%)），每份樣

本分別重復(fù)測定10次，計算每份樣本測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，SD≤3%。

注：%C指寡核苷酸某一堿基位點上胞嘧啶的含量。

（2）檢測方法：

使用QIAGENGmbH生產(chǎn)的Oligo驗證試劑盒，根據(jù)試劑盒操作程序?qū)Ω?/p>

種濃度樣本（A、B、C）進(jìn)行檢測，每一濃度重復(fù)檢測10孔(各濃度滴入孔中

的排序應(yīng)嚴(yán)格按照說明書中的表格操作)，計算其在0.5pmol和2pmolOligo濃

度下的測得值標(biāo)準(zhǔn)差SD，結(jié)果應(yīng)符合2.2的要求。

（3）檢測結(jié)果：

A.0.5pmolOligo檢測結(jié)果：

C%A0.025B0.025C0.025A0.025B0.025C0.025

7.7890.8351.68.9592.1155.98

9.8292.8453.28.069351.27

bias&8.8492.5951.279.0192.3452.62

repeatibility9.5192.8552.277.6692.153.15

10.2792.7752.548.792.3555.03

mean8.8692.3852.89

重復(fù)性0.860.631.56

STDEV

passedpassedpassed

B.2pmolOligo檢測結(jié)果：

C%A0.1B0.1C0.1A0.1B0.1C0.1

6.0794.1253.475.2894.9653.64

6.1394.452.525.2694.8351.62

bias&5.8694.3253.265.8895.1652.05

repeatibility5.5694.8851.677.495.1851.82

695.5952.75.8294.852.28

mean5.9394.8252.50

重復(fù)性0.600.440.75

STDEV

passedpassedpassed

進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，焦磷酸測序可以對不同甲基化頻率準(zhǔn)確定量。實

驗分別使用無甲基化的DNA和完全甲基化的DNA（EpiTectControlDNAs）進(jìn)

行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并針對p16基因進(jìn)行PCR擴增，然后按照不同比例混合兩

種PCR產(chǎn)物，得到不同甲基化含量（0%~100%）的樣本，隨后使用焦磷酸測序

儀定量檢測甲基化，結(jié)果如圖4所示。其中，淺藍(lán)色正方形圖示為真實甲基化

頻率，深藍(lán)色三角形圖示為焦磷酸測序定量結(jié)果，分析表明，焦磷酸測序的定

量結(jié)果與真實甲基化頻率之間存在非常好的線性關(guān)系，相關(guān)指數(shù)R2=0.9962。

焦

磷

酸

測

序

甲

基

化

定

量

結(jié)

果

（

%）

混合物中甲基化DNA的真實比例（%）

圖4.焦磷酸測序的定量結(jié)果與真實甲基化頻率之間有很好的線性關(guān)系

5、方法的適用性

焦磷酸測序可用于多個應(yīng)用領(lǐng)域。在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域，DNA甲基化與腫瘤

癌癥、胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)，焦磷酸測序也被應(yīng)用于相關(guān)樣本

的甲基化檢測，如檢測乳腺組織中ALKBH3基因甲基化，用于乳腺癌相關(guān)研

究；檢測FFPE樣本中MGMT啟動子甲基化，用于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存率研

究；檢測食管上皮細(xì)胞中EPB41L3基因甲基化，用于食管鱗癌潛在治療靶點研

究。此外，焦磷酸測序也用于檢測Val158Met(rs4680)甲基化水平變化與精神分

裂癥患者的暴力行為的關(guān)聯(lián)；研究MMP-9CpG島甲基化水平與慢性牙周炎的

嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)；研究白細(xì)胞中ACSL4（CG1553655）基因甲基化與非酒精性

脂肪肝的關(guān)聯(lián)等。在法醫(yī)研究領(lǐng)域，焦磷酸測序檢測從血液、唾液、精液及上

皮組織中提取基因組