一種引起壞死性筋膜炎的變異a族侵襲性鏈球菌的檢測方法

一種引起壞死性筋膜炎的變異a族侵襲性鏈球菌的檢測方法專利名稱：一種引起壞死性筋膜炎的變異a族侵襲性鏈球菌的檢測方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及一種A族侵襲性鏈球菌的檢測方法，具體的說涉及一種引起壞死性筋膜炎的變異A族侵襲性鏈球菌的檢測方法。背景技術(shù)：A族鏈球菌(groupAstreptococcus)又稱化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)，是人類細菌感染中最重要的病原菌之一。引起的感染主要有急性咽炎、急性扁桃體炎，也可致肺部感染、猩紅熱、皮膚軟組織感染，嚴重時可致全身性感染。該菌嚴重感染除致中毒性休克、敗血癥、急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)外，尚伴壞死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)、肌炎、深部血腫及多臟器功能衰竭。近年來由A族鏈球菌所引起的嚴重感染，尤其是侵襲性A族鏈球菌感染(InvasiveGroupAStreptococcusInfections)嚴重感染的發(fā)病率的增長，引起了人們對該細菌感染更大的關(guān)注。20世紀80年代后期，變異鏈球菌嚴重感染引起的壞死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)和鏈球菌休克綜合癥(STSS)造成當(dāng)?shù)氐臉O大恐慌，其中引起壞死性筋膜炎的A族侵襲性鏈球菌稱為“食人菌”。近年來這種極具感染性的傳染病有重新流行趨勢，微生物的進化是導(dǎo)致新病原體強毒株出現(xiàn)的內(nèi)在因素，鏈球菌引起的嚴重感染與其基因組進化有關(guān)。對全球不同地域的鏈球菌全基因組測序結(jié)果表明，不同國家引起鏈球菌嚴重感染的強毒株的基因組序列存在較大差異，毒性強弱與噬菌體介導(dǎo)的基因組的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。在世界上許多國家發(fā)現(xiàn)了許多強毒株，而且基因組發(fā)生了新的變異，如在以色列發(fā)現(xiàn)的M14等。對全球不同地域的鏈球菌全基因組測序結(jié)果表明，不同國家引起鏈球菌嚴重感染的強毒株的基因組序列存在較大差異，毒性強弱與噬菌體介導(dǎo)的基因組的水平轉(zhuǎn)移有關(guān)。如引起NF的菌株中，美加流行的是M1、M3株，以色列是M14株。壞死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)的診斷主要依賴臨床診斷，當(dāng)前仍然缺乏引起壞死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)病原的實驗室診斷手段。鏈球菌導(dǎo)致的嚴重感染發(fā)病機制復(fù)雜，迄今尚未發(fā)現(xiàn)一種特異的靶分子可單獨應(yīng)用于食人菌的診斷，需要組合多種方法對鏈球菌嚴重感染進行實驗室診斷。發(fā)明內(nèi)容為克服壞死性筋膜炎(NecrotizingFasciitis)病原的實驗室診斷手段缺乏的不足，本發(fā)明公開了一種引起壞死性筋膜炎的變異A族侵襲性鏈球菌的檢測方法。本發(fā)明的檢測方法，通過多種方法的組合，能夠診斷鑒定A族侵襲性鏈球菌引起的食人菌感染。本發(fā)明的檢測方法，包括以下步驟(1)對分離菌株進行生化鑒定或進行針對speBPCR的檢測，確定分離菌株為A族侵襲性鏈球菌；(2)對分離菌株進行動物模型感染，確定菌株為強毒株；(3)對鑒定的A族侵襲性鏈球菌進行EMM基因分型；(4)對鑒定的A族侵襲性鏈球菌進行SLA基因檢測。本發(fā)明的方法首先通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法確定分離菌株為A族侵襲性鏈球菌，該生化鑒定方法可為針對speB的PCR快速檢測方法替代，因為半胱氨酸蛋白酶SPEB在GAS高度保守，鑒定到該基因的存在即可確定分離菌株為A族侵襲性鏈球菌；鑒于A族侵襲性鏈球菌有強毒株和弱毒株之分，然后通過動物模型感染確定菌株為強毒株。然后對鑒定的A族侵襲性鏈球菌進行EMM基因分型，進行SLA基因檢測，以與國外流行株進行對比。本發(fā)明的鏈球菌的分離培養(yǎng)和生化鑒定的技術(shù)是將細菌在血瓊脂平板上進行分離培養(yǎng)，取純培養(yǎng)孤立菌落采用VITEK微生物分析儀使用GPI測試卡進行生化鑒定，并進行溶血試驗。采用革蘭氏陽性菌的自動檢測卡檢測，也可采用鏈球菌專用自動檢測卡檢測。本發(fā)明針對speBPCR的檢測為制備鏈球菌DNA模板后，采用引物1(序列表中序列1所示)和引物2(序列表中序列2所示)進行，本法可替代生化鑒定用于引起壞死性筋膜炎的GAS初篩。與生化鑒定實驗相比，因本方法針對樣品中的DNA檢測，本法可用于因抗生素治療導(dǎo)致鏈球菌培養(yǎng)陰性的樣品的診斷。確定鏈球菌強毒株的動物模型為引起壞死性筋膜炎的皮膚侵襲小鼠模型。該模型的程序為取A族溶血性鏈球菌分離培養(yǎng)后，挑取對數(shù)期生長的細菌，平板培養(yǎng)計數(shù)后，重懸于無菌蒸餾水中洗滌，離心后棄上清，生理鹽水重懸，注射Balb/c小鼠背部皮下，觀察皮膚感染情況和動物死亡情況。確定分離鏈球菌為強毒株后，對分離菌株進行EMM基因分型。根據(jù)M蛋白的保守序列，經(jīng)PCR獲得現(xiàn)有菌株的emm基因片段，進行序列分析，并對美國CDCemm數(shù)據(jù)庫進行blast分析，建立符合國際標準的鏈球菌M蛋白分型方法，用于比較與引起NF的國外主要流行株的差異；具體包括以下步驟1)制備鏈球菌DNA模板；2)PCR反應(yīng)，采用引物primer1如序列表中序列3，序列3-2所示；primer2如序列表中序列4所示；PCR反應(yīng)體系10μl含15mMMgCl2的10×PCRbuffer，2μldNTP混合物(10mM)，引物1和引物2各2μl，高質(zhì)量Taq酶2-5個單位，82μldH2O，模板0.5μl，混勻進行冷啟動PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下94℃1min后，進行如下10個循環(huán)94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，然后進行如下20個循環(huán)94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，每一個循環(huán)延伸時間增加10s，最后72℃延伸10min，4℃保溫；3)DNA測序，以序列表中序列5為測序引物；4)序列分析與比對將測序結(jié)果提交美國CDCGASemm序列數(shù)據(jù)庫進行比對分析，確定M蛋白類型。上述speBPCR的檢測和EMM基因分型均需制備鏈球菌DNA模板，鏈球菌DNA模板制備方法包括以下程序為取新鮮細菌用無菌蒸餾水洗滌2次，用300μl生理鹽水重懸，70℃加熱15分鐘，離心棄去上清。用50μl的TE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)、10μl的變?nèi)芫?3,000units/ml)和2μl透明質(zhì)酸酶(30mg/ml)重懸，37℃溫育30分鐘，100℃煮沸10分鐘，離心，上清中即含有所需的鏈球菌DNA模板。根據(jù)最近公開的鏈球菌全基因組測序結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)和比較生物學(xué)方法，選取引起NF的美國、英國、加拿大的M3流行株(MGAS315)特異的靶基因序列SLA(毒力因子和侵襲因子)，建立PCR檢測方法，SLAPCR基因檢測采用引物1序列表中序列6所示和引物2序列表中序列7所示進行檢測。本發(fā)明提供了引起NF的變異鏈球菌的多層次的實驗室檢測方法，并提供適應(yīng)現(xiàn)場快速篩查的PCR檢測試劑，通過這些方法的組合，首先實現(xiàn)了的食人菌感染，對于控制變異鏈球菌的傳入和播散提供了實驗手段。圖1為鏈球菌在血瓊脂平板上溶血圖。圖2為壞死性筋膜炎小鼠動物模型，其中左圖為國內(nèi)分離強毒株動物實驗結(jié)果，右圖為國內(nèi)分離弱毒株動物實驗結(jié)果。圖3為GAS菌株的SPEB的PCR擴增具體實施例方式實施例一變異鏈球菌的樣品分離培養(yǎng)和生化鑒定通用技術(shù)的建立細菌鑒定方法按國家臨床檢驗操作規(guī)程將細菌在血瓊脂平板上進行分離培養(yǎng)，取純培養(yǎng)孤立菌落采用VITEK微生物分析儀使用GPI測試卡進行生化鑒定，并進行溶血試驗。采用上述方法，對44株GAS菌株(其中7株標準菌株，16株來自于沈陽中國醫(yī)科大學(xué)臨床分離，12株來自于浙江醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院臨床分離，9株來自于北京304醫(yī)院臨床分離)進行分離鑒定。同時結(jié)合A族鏈球菌能產(chǎn)生β溶血的特性，確定7株標準菌株中有5株為A族溶血性鏈球菌，37株臨床分離菌株中有33株為A族溶血性鏈球菌。每個菌株的生化指標鑒定符合率均在80％以上。實施例二GAS引起壞死性筋膜炎的小鼠模型建立方法借鑒國外壞死性筋膜炎的動物模型，建立了GAS引起壞死性筋膜炎的皮膚侵襲小鼠模型取A族溶血性鏈球菌分離培養(yǎng)后，挑取對數(shù)期生長的細菌，平板培養(yǎng)計數(shù)約108CFU，重懸于無菌蒸餾水中，反復(fù)洗滌兩次，離心，棄上清，用100μl生理鹽水重懸。取10g左右的Balb/c雌性小鼠，剃其背部皮毛，皮下注射，觀察皮膚感染情況和動物死亡情況。按照以上方法，我們對33株A族溶血性鏈球菌進行小鼠皮膚侵襲性感染試驗，對其侵襲性感染能力進行了評價。動物實驗結(jié)果顯示實驗動物出現(xiàn)不同程度的膿腫，其中有3株細菌注射后造成實驗動物在1到2天內(nèi)死亡，其注射部位出現(xiàn)嚴重膿腫，與國外報道的動物模型有相似的結(jié)果。這表明在我國雖然還沒有壞死性筋膜炎的報告，表1.GAS皮膚侵襲小鼠模型中不同臨床分離株的小鼠感染情況表但我國確實有強毒株的存在，有導(dǎo)致壞死性筋膜炎發(fā)生的潛在可能性。實施例三用于PCR檢測的鏈球菌DNA模板制備方法的建立取新鮮細菌用無菌蒸餾水洗滌2次，用300μl生理鹽水重懸，70℃加熱15分鐘，離心棄去上清。用50μl的TE(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)、10μl的變?nèi)芫?3,000units/ml)和2μl透明質(zhì)酸酶(30mg/ml)重懸，37℃溫育30分鐘，100℃煮沸10分鐘，離心，上清中即含有所需的鏈球菌DNA模板。實施例四PCR法快速檢測SPEB的引物設(shè)計與篩選及SPEB的快速檢測方法的建立根據(jù)SPEB的DNA序列，設(shè)計系列SPEB的引物，通過序列比對分析初步篩選特異性引物，并利用現(xiàn)有樣品進行PCR擴增分析引物的特異性，確定一對特異性引物bp1序列表中序列1所示，和bp2序列表中序列2所示，以這兩條引物對DNA模板進行Speb特異性序列的PCR擴增，建立了一種針對GAS的快速、特異、敏感的檢測方法。對所有樣品提取的DNA模板用以上引物進行PCR擴增，并以B族、G族鏈球菌、炭疽桿菌和土拉的DNA模板做陰性對照做特異性分析。同時將標準菌株32177DNA模板進行1∶10倍比稀釋進行PCR擴增做敏感性分析。結(jié)果表明所有GAS菌株均能擴出SPEB特異性片段，而G族鏈球菌、B族鏈球菌、炭疽桿菌和土拉均未見擴增片段，可見用此PCR方法具有良好的特異性。實施例五符合國際標準的變異鏈球菌M蛋白分型方法的建立M蛋白是GAS感染的一個主要的毒力因子，具有抗吞噬作用，其蛋白抗原的變異是M分型的基礎(chǔ)，編碼M蛋白的emm基因的5′端高度變異，可以應(yīng)用于M蛋白分型。具體分析方法如下M蛋白分型方法1.樣品處理方法同鏈球菌DNA模板制備方法；2.PCR引物1序列表中序列3，序列3-2所示；引物2序列表中序列4所示。PCR反應(yīng)體系10μl含15mMMgCl2的10×PCRbuffer，2μldNTP混合物(10mM)，引物1和引物2各2μl，高質(zhì)量Taq酶2-5個單位，82μldH2O，模板0.5μl，混勻進行冷啟動PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件如下94℃1min后，進行如下10個循環(huán)94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，然后進行如下20個循環(huán)94℃15s，46.5℃30s，72℃1min15s，每一個循環(huán)延伸時間增加10s，最后72℃延伸10min，4℃保溫。c)DNA測序，以序列表中序列5為測序引物。3.序列分析與比對將測序結(jié)果提交美國CDCGASemm序列數(shù)據(jù)庫(http///ncidod/biotech/strep/strepblast.htm)進行比對分析，確定M蛋白類型。采用上述方法，對33株臨床分離GAS菌株進行了M蛋白分型，結(jié)果如下表2臨床分離GAS的M分型情況根據(jù)上表數(shù)據(jù)可以看出在我國流行菌株以M1為最多，占總菌數(shù)的42％。其次是M12，占總菌數(shù)的27％。在11例侵襲性感染中，有4例是M1型的，大約占36％。對所有菌株進行SLA的PCR檢測，引物PLA1序列表中序列6和PLA2序列表中序列7。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國所有菌株中沒有一株細菌中含有這種基因，說明在我國沒有發(fā)生國外強毒株流行的可能。實施例六針對美國強毒株GAS315特異靶基因SLA的PCR擴增方法的建立根據(jù)文獻，SLA為引起全球NF流行的GAS315(M3)強毒株的特異性靶基因，根據(jù)最近公布的GAS315全基因組測序結(jié)果，調(diào)取SLA基因，設(shè)計一對引物L(fēng)A1序列表中序列6和PLA2序列表中序列7，對所有菌株進行SLA的PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，我國所有菌株中沒有一株細菌中含有這種基因，全合成的SLA基因序列PCR擴增陽性。侵襲性鏈球菌.SEQ序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>一種引起壞死性筋膜炎的變異A族侵襲性鏈球菌的檢測方法<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213><400>18tggagtctctgacggcttc20<210>2<211>20<212>DNA<213><400>2gtgttttcggcacaaaaggt20<210>3<211>19<212>DNA<213><400>3tattcgcttagaaaattaa19<210>4<211>19<212>DNA<213><400>4tattggcttagaaaattaa19<210>5<211>20<212>DNA<213><400>5gcaagttcttcagcttgttt20<210>6<211>26<212>DNA<213><400>6tattcgcttagaaaattaaaaacagg26<210>7<211>28<212>DNA<213><400>7cggaattcatgaaaaaagtaataaatac28侵襲性鏈球菌.SEQ<210>8<211>29<212>DNA<213><400>8cgggatccttaacatcctatagaacctac29權(quán)利要求1.一種引起壞死性筋膜炎的變異A族侵襲性鏈球菌的檢測方法，包括以下步驟(a)對分離菌株進行生化鑒定或進行針對speBPCR的檢測，確定分離菌株為A族侵襲性鏈球菌；(b)對分離菌株進行動物模型感染，確定菌株為強毒株；(c)對鑒定的A族侵襲性鏈球菌進行M蛋白(EMM)基因分型；(d)對鑒定的A族侵襲性鏈球菌進行SLA基因檢測。2.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其中步驟(a)所述生化鑒定是將細菌在血瓊脂平板上進行分離培養(yǎng)，取純培養(yǎng)孤立菌落采用VITEK微生物分析儀使用GPI測試卡進行生化鑒定，并進行溶血試驗，采用革蘭氏陽性菌的自動檢測卡檢測。3.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其中步驟(a)所述針對speBPCR的檢測為制備鏈球菌DNA模板后，采用引物1(序列表中序列1所示)和引物2(序列表中序列2所示)進行。4.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其中步驟(b)所述動物模型為引起壞死性筋膜炎的皮膚侵襲小鼠模型；取A族溶血性鏈球菌分離培養(yǎng)后，挑取對數(shù)期生長的細菌，平板培養(yǎng)計數(shù)后，重懸于無菌蒸餾水，洗滌離心，棄上清，用生理鹽水重懸，注射于Balb/c雌性小鼠背部皮下，觀察皮膚感染情況和動物死亡情況。5.根據(jù)權(quán)利要求1的檢測方法，其中步驟(c)所述EMM基因分型包括以下步驟a)制備鏈球菌DNA模板；b)PCR反應(yīng)，采用引物1如序列表中序列3，序列3-2所示；引物2如序列表中序列4所示；PCR反應(yīng)體系10μl含